Đường sinh trưởng của vi khuẩn thể hiện các giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Nhờ vào đường sinh trưởng người làm nghiên cứu có thể xác định được thời điểm thích hợp để tiến hành thực hiện các thí nghiệm.
Hình 2. Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên hình là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn B. megaterium V1 cho thấy mật số vi khuẩn tăng lên theo mỗi ngày từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 và có đấu hiệu giảm ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7 (Hình 2). Ở ngày thứ 1, 2 mật số vi khuẩn có sự thay đổi, mật số vi khuẩn tăng từ 8,87 log (CFU/mL) lên 9,06 log (CFU/mL). Ở ngày thứ 3 mật số vi khuẩn đạt cao nhất là 9,37 log (CFU/mL), và sau đó mật số vi khuẩn có sự giảm nhẹ theo từng ngày và thấp nhất ở ngày thứ 7 là 9,24 log (CFU/mL).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy mật số tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 2, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Nguyên nhân là do đây là khoảng thời gian đầu vi khuẩn được đưa vào môi trường mới, cần có thời gian để vi khuẩn thích nghi và tổng hợp nên hệ enzyme cần thiết để phân giải nguồn dinh dưỡng của môi trường. Sau khi đã thích nghi với môi trường, vi khuẩn bắt đầu tăng trưởng nhanh và đạt mật số cao nhất ở ngày thứ 3, tuy mật số vi khuẩn đạt cao nhất nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6. Nguyên nhân
8.87 d 9.06 c 9.37 a 9.32 ab 9.30 ab 9.29 ab 9.24 b 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (Ngày)
Lo g (C F U /m L)
là do ngày thứ 3 là giai đoạn vi khuẩn trong pha ổn định hay gọi là pha cân bằng, điều này có thể giải thích là khi vi khuẩn đã thích nghi với môi trường thì ngày thứ 2 vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh sinh tổng hợp nhiều hợp chất dinh dưỡng, đến ngày thứ 3, mật số vi khuẩn ổn định do số lượng tế bào chết đi bằng với số lượng vi khuẩn sinh ra. Ngày thứ 4, 5, 6, 7 mật số giảm dần theo thời gian. Do đó, vi khuẩn bắt đầu chết dần và ở giai đoạn này vi khuẩn đi vào pha chết. Mặc dù, kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt về mật số vi khuẩn trong thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 là không có ý nghĩa nhưng để tiết kiệm thời gian thì chọn ngày thứ 3 là thời gian nuôi cấy tối ưu của vi khuẩn B. megaterium V1.
4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Nhiệt độ và pH của môi trường là hai yếu tố thường ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm. Bên cạnh đó, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Theo Sinoy et al. (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp. phát triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30o
C – 40oC và pH tối ưu là 6 – 8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ , pH này.
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất bột lông gia cầm với dòng vi khuẩn B. megaterium V1, với 5 mức pH là 4, 5, 6, 7, 8 và 4 mức nhiệt độ là 30°C, 35°C, 40°C, 45°C; nhằm khảo sát ảnh hưởng của hai nhân tố này đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn, từ đó chọn ra mức nhiệt độ và pH thích hợp cho các thí nghiệm sau.
Bảng 6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm.
Nhiệt độ pH Mật số (CFU/mL) Phân hủy (%)
30°C 4 4,21×108hijk 18,59 fg 30°C 5 6,22×108hi 19,39 efg 30°C 6 10,33×108efg 23,06 defg 30°C 7 15,10×108cd 2470 defg 30°C 8 19,77×108b 28,74 cde 35°C 4 5,21×108hij 21,97 defg 35°C 5 7,66×108gh 25,59 defg 35°C 6 11,77×108def 31,27 bcd 35°C 7 19,22×108b 40,53 ab 35°C 8 24,55×108a 49,21 a 40°C 4 2,22×108ijk 16,89 g 40°C 5 5,99×108hi 19,86 efg 40°C 6 10,77×108efg 25,76 defg 40°C 7 16,99×108bc 31,07 bcd 40°C 8 19,33×108b 37,31 bc 45°C 4 8,33×107k 15,95 g 45°C 5 13,3×107jk 16,29 g 45°C 6 45,5×107hijk 22,52 defg 45°C 7 77,7×107fgh 27,46 def 45°C 8 122,1×107 de 30,71 bcd
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả ở Bảng 6 cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn, đồng thời thấy được mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của chủng vi khuẩn B.
megaterium V1. Khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên 35oC, mật số vi khuẩn tăng, đồng thời khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng tăng. Khi nhiệt độ lên đến 40o
C và 45oC thì mật số vi khuẩn giảm xuống và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng giảm theo.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.2) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn trung bình cao nhất tại nhiệt độ 35oC (13,68×108 CFU/mL) và thấp nhất ở nhiệt độ 45o
C (5,34×108 CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Khả năng phân hủy trung bình đạt giá trị cao nhất tại nhiệt độ 35o
C (33,71%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại; thấp nhất ở nhiệt độ 45o
C (22,59%), tuy nhiên, sự khác biệt về mật số giữa nghiệm thức 40o
C và 50oC là không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Bên cạnh đó, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Khi pH 4 mật số vi khuẩn trung bình có giá trị thấp nhất (3,12×108
CFU/mL) và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ở mức pH này cũng thấp nhất (18,35%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Khi tăng pH lên tới 8, mật số vi khuẩn trung bình đạt giá trị cao nhất (18,96 ×108 CFU/mL) và khả năng phân hủy trung bình cũng đạt giá trị cao nhất (36,49%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Từ kết quả trên cho thấy mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Khi mật số vi khuẩn tăng thì khả năng phân hủy bột lông cũng tăng theo và ngược lại. Mặc dù khả năng phân hủy bột lông phụ thuộc nhiều vào keratinase do vi khuẩn tiết ra nhưng tế bào vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy này. Theo Gupta và Ramnani (2006), có thể chia sự phân hủy keratin thành hai quá trình là phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy protein, tế bào sống giữ vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ các enzyme ngoại bào phá hủy các cầu nối disulfide.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.2 và hình 8, 9) còn cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột của vi khuẩn đạt giá trị cao nhất tại 35o
C và pH 8 với lần lượt các giá trị là 24,55×108 CFU/mL và 49,21%, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Kết quả trên tương đồng với nghiên cứu của Ganesh Kumar et al.
(2006), nhiệt độ và pH thích hợp cho sự phát triển và khả năng phân hủy keratin của dòng vi khuẩn B. Licheniformis K-508 là 35oC và 8. Mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột của vi khuẩn thấp nhất tại 45o
C và pH 4 với lần lượt các giá trị là 8,33×107 CFU/mL và 15,95%. Từ kết quả thí nghiệm này cho thấy môi trường acid pH 4 ở các mức nhiệt độ sau 7 ngày ủ lắc làm ức chế sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Nhiệt độ quá cao cũng làm giảm sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn.
Tóm lại, kết quả thí nghiệm cho thấy rằng có sự tương tác giữa hai nhân tố pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Giá trị pH 8 và nhiệt độ là 35oC là điều kiện thích hợp cho hoạt động phân hủy bột lông (keratin) và được sử dụng cho các thí nghiệm tiếp theo.
4.3. Ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Đường là một nguồn carbon đóng vai trò quan trọng trong quá trình phát triển của nhiều loại vi sinh vật, đường cung cấp nguồn carbohydrate tạo thành các hợp chất cấu tạo nên tế bào và cung cấp năng lượng cho hoạt động sống của tế bào. Khi bổ sung thêm các nguồn carbon, có thể giúp cho sự phân hủy keratin nhanh hơn hoặc làm ức chế sự phân hủy keratin của vi khuẩn. Để xác định ảnh hưởng của nguồn carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy keratin của chủng vi khuẩn B. megaterium V1, các nguồn carbon như glucose, sucrose, bột bắp và rỉ đường được bổ sung với nồng độ 1%.
Hình 3. Biểu đồ ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa carbon đến mật số vi khuẩn
Ghi chú: các giá trị là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả ở Hình 3 cho thấy khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau làm cho mật số vi khuẩn giữa các nghiệm thức có sự thay đổi, mật số vi khuẩn đạt cao nhất ở nghiệm thức bổ sung rỉ đường (22,66×108
CFU/mL). Xếp sau lần lượt là nghiệm thức đối chứng không bổ sung thêm nguồn carbon (21,88×108CFU/mL), nghiệm thức bổ sung bột bắp (12,44x108
CFU/mL), nghiệm thức bổ sung sucrose (7,1×108 CFU/mL) và thấp nhất là nghiệm thức bổ sung glucose (5,66×108 CFU/mL).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.3) cho thấy ảnh hưởng các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau đến mật số vi khuẩn là có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Tuy nhiên, mật số giữa hai nghiệm thức bổ sung glucose và sucrose khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Nghiệm thức bổ sung rỉ đường đạt mật số cao nhất nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon, nguyên nhân làm cho mật số vi khuẩn ở nghiệm thức bổ sung rỉ đường cao hơn so với các nghiệm thức khác là do trong thành phần rỉ đường có các khoáng chất và vitamin cần thiết cho sự phát triển của vi khuẩn. Kết quả thí nghiệm này phù hợp với nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), rỉ đường được bổ sung với nồng độ 1% trên đối tượng là chủng Bacillus licheniformis MZK-3 là nguồn carbon thích hợp cho sự phát triển của vi khuẩn. Nghiệm thức bổ sung bột bắp có mật
21,88 a 22,66 a 12,44 b 7,10 c 5,66c 0.00 5.00 10.00 15.00 20.00 25.00
Glucose Sucrose Bột bắp Rỉ đường Đối chứng
Nguồn dinh dƣỡng Carbon (1%)
M ật s ố vi k h u ẩn ( x10 8 C F U /m L )
số vi khuẩn thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon và khác biệt này có ý nghĩa thống kê. Nghiệm thức bổ sung sucrose và glucose có mật số thấp hơn rất nhiều so với nghiệm thức đối chứng và các nghiệm thức còn lại ở mức 5%, chứng tỏ sự có mặt của sucrose và glucose ức chế quá trình phát triển của vi khuẩn. Mặc dù, kết quả này khác so với nghiên cứu của Manczinger et al. (2003), tinh bột và sucrose được bổ sung vào môi trường bột lông vũ làm tăng mật số vi khuẩn, tăng hoạt độ enzyme đối với dòng vi khuẩn Bacillus licheniformis K-508. Tuy nhiên, kết quả thí nghiệm trên tương đồng với nghiên cứu của Mohammad et al. (2007), sucrose hoặc glucose được bổ sung với nồng độ 1% trên đối tượng là chủng Bacillus licheniformis MZK-3 làm cho mật số vi khuẩn thấp hơn nhiều so với đối chứng. Như vậy, chủng vi khuẩn B. megaterium V1 cho khả năng phân hủy bột lông cao nhất khi môi trường chỉ có bột lông là nguồn dinh dưỡng duy nhất.
Hình 4. Ảnh hƣởng của các nguồn dinh dƣỡng chứa carbon đến khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn
Ghi chú: các giá trị là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả ở Hình 4 cho thấy thấy khi bổ sung các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau làm cho khả năng phân hủy bột lông ở các nghiệm thức là khác nhau. Phần trăm phân hủy đạt cao nhất ở nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon (47,34%), xếp sau là nghiệm thức bổ sung rỉ đường (38,36%), nghiệm thức bổ sung
17,93 d 25,39 c 36,77 b 38,36 b 47,34 a 0 5 10 15 20 25 30 35 40 45 50
Glucose Succrose Bột bắp Rỉ đường Đối chứng
Nguồn dinh dƣỡng Carbon (1%)
P h â n h ủ y (%)
bột bắp (36,7%), nghiệm thức bổ sung sucrose (25,9%) và nghiệm thức bổ sung glucose cho kết quả phân hủy bột lông thấp nhất (17,3%).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.3) cho thấy các nguồn dinh dưỡng chứa carbon khác nhau ảnh hưởng đến khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng khác nhau và có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Nghiệm thức đối chứng không bổ sung nguồn carbon cho khả năng phân hủy bột lông cao nhất khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức bổ sung rỉ đường và nghiệm thức bổ sung bột bắp cho khả năng phân hủy bột lông tương đương nhau nên khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Rỉ đường là một phụ phẩm dễ tìm, được sinh ra với số lượng lớn trong quá trình sản xuất đường. Với ưu điểm rẻ tiền lại chứa thành phần dinh dưỡng phong phú nên rỉ đường được ứng dụng rất nhiều trong sản xuất thức ăn gia súc và trong nuôi cấy vi sinh vật. Với thành phần chính là carbohydrate cùng nhiều vitamin và khoáng chất rỉ đường là nguồn dinh dưỡng rất tốt cho sự phát triển, tăng sinh khối của vi khuẩn. Tuy nhiên, rỉ đường lại có thể ức chế quá trình sinh keratinase (Wang and Shih, 1999; Cheng et al., 1995), đó là lý do làm cho khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn giảm đi so với nghiệm thức đối chứng. Nghiệm thức bổ sung sucrose cho khả năng phân hủy bột lông thấp hơn so với nghiệm thức đối chứng, và nghiệm thức bổ sung glucose cho khả năng phân hủy bột lông thấp nhất, khác biệt có ý nghĩa với các nghiệm thức còn lại. Theo nghiên cứu của Wang và Shih (1999), sự có mặt của glucose và sucrose trong môi trường nuôi cấy làm ức chế sự phát triển và khả năng sinh keratinase của vi khuẩn, nguyên nhân có thể là do chúng kìm hãm sự biểu hiện của gene keratinase của vi khuẩn. Báo cáo tổng hợp của Kumar và Takagi (1999) cũng chỉ ra sự ức chế khả năng sinh các protease kiềm của vi sinh vật thông qua sự kìm hãm các sản phẩm dị hóa của glucose.
Như vậy, trong môi trường bột lông có bổ sung glucose, sucrose hoặc bột bắp với nồng độ 1% làm ức chế sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi