Mục đích: Theo dõi sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian, từ đó chọn ra thời gian nuôi cấy thích hợp của dòng vi khuẩn B. megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với một nhân tố là thời gian: ngày 1, ngày 2, ngày 3, ngày 4, ngày 5, ngày 6, ngày 7.
- Số lần lặp lại: 3 lần.
- Số nghiệm thức: 7 nghiệm thức. - Số đơn vị thí nghiệm: 21
Các bước thực hiện:
Chuẩn bị 3 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng.
Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn, ủ trên máy lắc (120 rpm) với nhiệt độ 37ºC.
Mỗi ngày rút 100µL trong mỗi bình tiến hành pha loãng đếm mật số vi khuẩn. Thực hiện liên tục đến ngày thứ bảy.
Chỉ tiêu theo dõi: Mật số của vi khuẩn.
3.2.3. Thí nghiệm 2: Khảo sát ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Mục đích: Xác định mứ c nhiê ̣t đô ̣ và pH thích hợp cho sự sinh trưởng , phát triển và phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 2 nhân tố: pH (5 mức độ: 4, 5, 6, 7, 8), nhiệt độ (4 mức độ: 30o C, 35oC, 40oC, 45oC). - Số lần lặp lại: 3 lần. - Tổng số nghiệm thức: 20 nghiệm thức - Số đơn vị thí nghiệm: 60. Các bước thực hiện:
Chuẩn bị 15 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng. Lần lượt điều chỉnh pH như bố trí thí nghiệm, mỗi mức pH có 3 bình.
Mỗi nghiệm thức chuẩn bị 1 bình không chủng vi khuẩn để làm mẫu đối chứng âm.
Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Ủ trên máy lắc (120 rpm) với các mức nhiệt độ như bố trí thí nghiệm.
Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm.
3.2.4. Thí nghiệm 3: Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa carbon đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn B. megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiệt độ và pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2. - Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố thí nghiệm là nguồn dinh dưỡng chứa
carbon như: glucose, sucrose, rỉ đường và bột bắp với nồng độ 1% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng carbon.
- Tổng số nghiệm thức: 5 nghiệm thức - Số đơn vị thí nghiệm: 15
Các bước thực hiện:
Chuẩn bị 12 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng; lần lượt bổ sung vào các bình thủy tinh các nguồn carbon với nồng độ như bố trí thí nghiệm. Ba bình không bổ sung các nguồn carbon được dùng làm mẫu đối chứng. Điều chỉnh pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2.
Đậy kín miệng bình và khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Ủ trên máy lắc (120 rpm) với mức nhiệt độ chọn ra từ thí nghiệm 2.
Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm.
3.2.5. Thí nghiệm 4: Khảo sát ảnh hƣởng của nguồn dinh dƣỡng chứa nitơ đến sƣ̣ phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Mục đích: Đánh giá ảnh hưởng của các nguồn dinh dưỡng chứa nitơ đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn B. megaterium V1.
Bố trí thí nghiệm:
- Thí nghiệm được thực hiện ở nhiêt độ và pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2. - Bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với nhân tố thí nghiệm là nguồn dinh dưỡng chứa
nitơ như: yeast extract, bột đậu nành, bã đậu nành, NH4Cl với nồng độ 0,5% (w/v) và nghiệm thức không bổ sung nguồn dinh dưỡng chứa nitơ.
- Số lần lặp lại: 3 lần
- Tổng số nghiệm thức: 5 nghiệm thức - Số đơn vị thí nghiệm: 15
Các bước thực hiện:
Chuẩn bị 12 bình thủy tinh 80mL chứa 40mL môi trường bột lông vũ lỏng; lần lượt bổ sung vào các bình thủy tinh các nguồn nitơ với nồng độ như bố trí thí nghiệm. Ba bình không bổ sung các nguồn nitơ được dùng làm mẫu đối chứng. Điều chỉnh pH thích hợp chọn ra từ thí nghiệm 2.
Đậy kín miệng bình và đem khử trùng ở 121ºC trong 15 phút.
Chủng vào mỗi bình 2mL dịch nuôi tăng sinh khối vi khuẩn đã chuẩn bị trước (thực hiện trong tủ cấy vô trùng).
Ủ trên máy lắc (120 rpm) với mức nhiệt độ chọn ra từ thí nghiệm 2.
Sau ba ngày nuôi lắc, tiến hành lấy mẫu theo dõi sự phát triển của vi khuẩn.
Sau bảy ngày nuôi lắc, tiến hành đánh giá khả năng phân hủy lông gia cầm.
Chỉ tiêu theo dõi: Sự phát triển của vi khuẩn (mật số), hiệu suất phân hủy bột lông gia cầm.
3.2.6. Phƣơng pháp phân tích
a. Xác định tỉ lệ bột lông bị phân hủy
Mục đích: Đánh giá khả năng phân hủy bột lông gia cầm của vi khuẩn trong các điều kiện môi trường nuôi cấy khác nhau.
Các bước thực hiện:
Giấy lọc được sấy khô ở 80ºC trong hai đến năm ngày và cân đến khi khối lượng không đổi (G1).
Sau quá trình nuôi cấy, dịch môi trường được lọc qua giấy lọc. Sau đó sấy khô ở 80ºC và cân lại đến khi khối lượng không đổi (G2).
Khối lượng bột lông còn lại sau khi phân hủy = G2 – G1
Tỉ lệ phần trăm lông bị phân hủy bởi vi khuẩn được tính theo công thức sau (Nguyễn Huy Hoàng et al., 2010):
A (%) = (mBĐ - mC) x 100 / mBĐ Trong đó: A (%) là tỉ lệ lông bị phân hủy bởi vi khuẩn mBĐ là khối lượng bột lông ban đầu
b. Xác định mật số vi khuẩn
Mục đích: Kiểm tra sự phát triển của vi khuẩn.
Các bước thực hiện:
Mật số vi khuẩn được xác định bằng cách đếm sống tổng số khuẩn lạc xuất hiện trên đĩa petri chứa môi trường thạch rắn.
Hút 100µL dịch môi trường nuôi cấy vi khuẩn trong bình thủy tinh cho vào eppendorf chứa 900µL nước cất cất vô trùng ta được độ pha loãng 10-1, tiếp tục pha loãng mẫu đến độ pha loãng thích hợp.
Hút 10µL trong eppendorf ở độ pha loãng thích hợp cho vào đĩa môi trường đã chuẩn bị trước. Dùng que trãi trãi đều mẫu trên đĩa môi trường.
Ủ ở 37oC, sau 24 giờ đếm số khuẩn lạc xuất hiện trên bề mặt môi trường.
Số tế bào vi khuẩn trong 1 mL dịch nuôi cấy (CFU/mL) tính từ số liệu của độ pha loãng Di được tính theo công thức
Trong đó: Di: độ pha loãng
Ci: số khuẩn lạc đếm được ở độ pha loãng Di
Vi: thể tích dịch huyền phù vi sinh vật cho vào đĩa petri
c. Xử lý số liệu
Các số liệu thí nghiệm được phân tích thống kê và vẽ đồ thị bằng phần mềm Minitab 16 và MS Excel 2003.
CFU/mL
Ci × Di Vi
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Khảo sát sự phát triển của vi khuẩn theo thời gian
Đường sinh trưởng của vi khuẩn thể hiện các giai đoạn phát triển của vi khuẩn trong quá trình nuôi cấy. Nhờ vào đường sinh trưởng người làm nghiên cứu có thể xác định được thời điểm thích hợp để tiến hành thực hiện các thí nghiệm.
Hình 2. Biểu đồ sự thay đổi mật số vi khuẩn theo thời gian
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên hình là trung bình của ba lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả khảo sát đường tăng trưởng của vi khuẩn B. megaterium V1 cho thấy mật số vi khuẩn tăng lên theo mỗi ngày từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 3 và có đấu hiệu giảm ở các ngày thứ 4, 5, 6, 7 (Hình 2). Ở ngày thứ 1, 2 mật số vi khuẩn có sự thay đổi, mật số vi khuẩn tăng từ 8,87 log (CFU/mL) lên 9,06 log (CFU/mL). Ở ngày thứ 3 mật số vi khuẩn đạt cao nhất là 9,37 log (CFU/mL), và sau đó mật số vi khuẩn có sự giảm nhẹ theo từng ngày và thấp nhất ở ngày thứ 7 là 9,24 log (CFU/mL).
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.1) cho thấy mật số tăng từ ngày thứ 1 đến ngày thứ 2, khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Nguyên nhân là do đây là khoảng thời gian đầu vi khuẩn được đưa vào môi trường mới, cần có thời gian để vi khuẩn thích nghi và tổng hợp nên hệ enzyme cần thiết để phân giải nguồn dinh dưỡng của môi trường. Sau khi đã thích nghi với môi trường, vi khuẩn bắt đầu tăng trưởng nhanh và đạt mật số cao nhất ở ngày thứ 3, tuy mật số vi khuẩn đạt cao nhất nhưng khác biệt không có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các ngày thứ 4, thứ 5, thứ 6. Nguyên nhân
8.87 d 9.06 c 9.37 a 9.32 ab 9.30 ab 9.29 ab 9.24 b 8.0 8.5 9.0 9.5 10.0 0 1 2 3 4 5 6 7 8
Thời gian (Ngày)
Lo g (C F U /m L)
là do ngày thứ 3 là giai đoạn vi khuẩn trong pha ổn định hay gọi là pha cân bằng, điều này có thể giải thích là khi vi khuẩn đã thích nghi với môi trường thì ngày thứ 2 vi khuẩn bắt đầu phát triển mạnh sinh tổng hợp nhiều hợp chất dinh dưỡng, đến ngày thứ 3, mật số vi khuẩn ổn định do số lượng tế bào chết đi bằng với số lượng vi khuẩn sinh ra. Ngày thứ 4, 5, 6, 7 mật số giảm dần theo thời gian. Do đó, vi khuẩn bắt đầu chết dần và ở giai đoạn này vi khuẩn đi vào pha chết. Mặc dù, kết quả phân tích thống kê cho thấy sự khác biệt về mật số vi khuẩn trong thời gian từ ngày thứ 3 đến ngày thứ 6 là không có ý nghĩa nhưng để tiết kiệm thời gian thì chọn ngày thứ 3 là thời gian nuôi cấy tối ưu của vi khuẩn B. megaterium V1.
4.2. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến sự phát triển và khả năng phân hủy lông gia cầm của vi khuẩn
Nhiệt độ và pH của môi trường là hai yếu tố thường ảnh hưởng lớn đến quá trình sinh trưởng và phát triển của vi khuẩn. Thông thường khi nhiệt độ tăng thì tốc độ phản ứng tăng. Tuy nhiên, tốc độ phản ứng chỉ tăng đến một giới hạn nhất định. Vượt quá giới hạn đó, tốc độ phản ứng sẽ giảm. Bên cạnh đó, pH môi trường ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất và đặc biệt là ảnh hưởng đến độ bền enzyme. Theo Sinoy et al. (2011), các chủng vi khuẩn thuộc dòng Bacillus sp. phát triển thuận lợi trong khoảng nhiệt độ 30o
C – 40oC và pH tối ưu là 6 – 8, hoạt độ keratinase cũng thu được cao nhất trong khoảng nhiệt độ , pH này.
Thí nghiệm được tiến hành trên cơ chất bột lông gia cầm với dòng vi khuẩn B. megaterium V1, với 5 mức pH là 4, 5, 6, 7, 8 và 4 mức nhiệt độ là 30°C, 35°C, 40°C, 45°C; nhằm khảo sát ảnh hưởng của hai nhân tố này đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn, từ đó chọn ra mức nhiệt độ và pH thích hợp cho các thí nghiệm sau.
Bảng 6. Ảnh hƣởng của nhiệt độ và pH đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông gia cầm.
Nhiệt độ pH Mật số (CFU/mL) Phân hủy (%)
30°C 4 4,21×108hijk 18,59 fg 30°C 5 6,22×108hi 19,39 efg 30°C 6 10,33×108efg 23,06 defg 30°C 7 15,10×108cd 2470 defg 30°C 8 19,77×108b 28,74 cde 35°C 4 5,21×108hij 21,97 defg 35°C 5 7,66×108gh 25,59 defg 35°C 6 11,77×108def 31,27 bcd 35°C 7 19,22×108b 40,53 ab 35°C 8 24,55×108a 49,21 a 40°C 4 2,22×108ijk 16,89 g 40°C 5 5,99×108hi 19,86 efg 40°C 6 10,77×108efg 25,76 defg 40°C 7 16,99×108bc 31,07 bcd 40°C 8 19,33×108b 37,31 bc 45°C 4 8,33×107k 15,95 g 45°C 5 13,3×107jk 16,29 g 45°C 6 45,5×107hijk 22,52 defg 45°C 7 77,7×107fgh 27,46 def 45°C 8 122,1×107 de 30,71 bcd
Ghi chú: các giá trị thể hiện trên bảng là trung bình của 3 lần lặp lại, các giá trị có chữ khác nhau thể hiện sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%.
Kết quả ở Bảng 6 cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển cũng như khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn, đồng thời thấy được mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của chủng vi khuẩn B.
megaterium V1. Khi nhiệt độ tăng từ 30oC lên 35oC, mật số vi khuẩn tăng, đồng thời khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng tăng. Khi nhiệt độ lên đến 40o
C và 45oC thì mật số vi khuẩn giảm xuống và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn cũng giảm theo.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.2) cho thấy nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn trung bình cao nhất tại nhiệt độ 35oC (13,68×108 CFU/mL) và thấp nhất ở nhiệt độ 45o
C (5,34×108 CFU/mL), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Khả năng phân hủy trung bình đạt giá trị cao nhất tại nhiệt độ 35o
C (33,71%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại; thấp nhất ở nhiệt độ 45o
C (22,59%), tuy nhiên, sự khác biệt về mật số giữa nghiệm thức 40o
C và 50oC là không có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Bên cạnh đó, pH môi trường cũng ảnh hưởng đến mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Khi pH 4 mật số vi khuẩn trung bình có giá trị thấp nhất (3,12×108
CFU/mL) và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn ở mức pH này cũng thấp nhất (18,35%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Khi tăng pH lên tới 8, mật số vi khuẩn trung bình đạt giá trị cao nhất (18,96 ×108 CFU/mL) và khả năng phân hủy trung bình cũng đạt giá trị cao nhất (36,49%), khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5% so với các nghiệm thức còn lại. Từ kết quả trên cho thấy mối liên hệ giữa mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn. Khi mật số vi khuẩn tăng thì khả năng phân hủy bột lông cũng tăng theo và ngược lại. Mặc dù khả năng phân hủy bột lông phụ thuộc nhiều vào keratinase do vi khuẩn tiết ra nhưng tế bào vi khuẩn cũng đóng vai trò quan trọng trong quá trình phân hủy này. Theo Gupta và Ramnani (2006), có thể chia sự phân hủy keratin thành hai quá trình là phá hủy các cầu nối disulfide và phân hủy protein, tế bào sống giữ vai trò quan trọng trong việc hỗ trợ các enzyme ngoại bào phá hủy các cầu nối disulfide.
Từ kết quả xử lý thống kê (phụ lục 3.2 và hình 8, 9) còn cho thấy sự tương tác pH và nhiệt độ ảnh hưởng đến sự phát triển và khả năng phân hủy bột lông của vi khuẩn khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Mật số vi khuẩn và khả năng phân hủy