Sau khi đã lựa chọn được các yếu tố ảnh hưởng đến khả năng sinh tổng hợp laccase cùng với khả năng oxy hóanhiều hợp chất khó phân hủy và loại màu của enzyme này, do đó nghiên cứu về khả năng loại màu thuốc nhuộm bởi chủng BBV11 được thực hiện. Trên môi trường PDB-M bổ sung 0,5mM CuSO4, 33oC, pH 8, bổ sung màu Dimaren Black CLS 60 ppm, khả năng loại màu và hoạt tính laccase đã được trình bày trênhình 3.7 và 3.8.
Hình 4.7 Hiệu quả loại màu và khả năng sinh laccase của chủng BBV11 sau 6 ngày nuôi
A B
Hình 4.8 Màu Dimaren Black CLS tại thời điểm ban đầu (A) và sau 6 ngày nuôi (B)
35
Từ kết quả trên có thể nhận thấy chủng BBV11 có khả năng loại 65% màu Dimaren Black CLS sau 5 ngày. Trong quá trình loại màu, laccase vẫn tiếp tục được chủng BBV11 sinh tổng hợp, tuy nhiên hoạt tính đã giảm đi khá nhiều (66,5 U/l).
Joe và cộng sự (2011) đã cho thấy khả năng loại màu Remazol Black B với nồng độ 50mg/l bởi chủng Pseudomonas aeruginosa CR-25 được phân lập từ nhà máy xử lý nước thải lên đến 97% [27].
Ponraj và cộng sự (2011) đã chứng minh được khả năng loại màu Orange 3R (200mg/l) tốt nhất của Chủng Bacillus sp. là 86.72% tại pH 7 [41].
Theo Maulin và cộng sự (2014) Chủng vi khuẩn Bacillus spp. có khả
năng loại 95 ± 0,3% màu Reactive Black 5 (RB5) sau 6 ngày ở 25oC [35]. Một nghiên cứu khác của Gurulakshimi và cộng sự (2008) cho thấy khả năng loại 90% màu thuốc nhuộm acid blue 113 với nồng độ 200mg/l trên môi trường BHM, pH 7 trong 50 giờở 37oC [25].
36
PHẦN 5:
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 1. Kết luận
Từ các kết quả nghiên cứu đạt được, có thể rút ra một số kết luận như sau: 1. Từ 54 chủng vi khuẩn phân lập từ rừng Quốc Gia Ba Vì và vườn Quốc Gia Bidoup, đã sàng lọc được 47 chủng sinh chitinase, 42 chủng sinh cellulase, 43 chủng sinh protease. Đặc biệt chủng BBV11 ngoài khả năng sinh 3 enzyme trên còn có khả năng sinh laccase với hoạt tính ban đầu đạt 49,2 U/l.
2. Chủng BBV11 được đặt tên là Bacillus sp. BBV11.
3. Đã xác định được 1 số điều kiện nuôi cấy thích hợp cho chủng BBV11 sinh laccase hoạt tính cao và ổn định, đó là: môi trường PDB-M, pH 8, nhiệt độ 33oC, nồng độ CuSO4 bổ sung 0,5 mM, chủng Bacillus sp. BBV11
sinh laccase với hoạt tính cao nhất là 366,4 U/l.
4. Chủng Bacillus sp. BBV11 có khả năng loại 65% màu Dimaren Black CLS sau 5 ngày.
2. Kiến nghị
1. Nghiên cứu khả năng sinh laccase của chủng Bacillus sp. BBV11 trên
các nguồn carbon, nitrogen và khi bổ sung các chất cảm ứng khác nhau.
2. Nghiên cứu 1 số đặc tính của laccase của chủng Bacillus sp. BBV11
nhưđộ bền pH, độ bền nhiệt độ.
3. Nghiên cứu các điều kiện nuôi cấy thích hợp để chủng Bacillus sp.
BBV11 sinh các enzyme ngoại chitinase, cellulase và protease hoạt tính cao và ổn định.
37
TÀI LIỆU THAM KHẢO TÀI LIỆU TIẾNG VIỆT
1. Nguyễn Thị Cẩm, Nguyễn Thị Thiên Trúc, Trần Ngọc Thiên Kim, Nguyễn Thị Thanh Hà (2010), Khảo sát khả năng tổng hợp chất chitin từ
nấm sợi, Tạp chí Khoa học-Công nghệ, 18: 520-527.
2. Nguyễn Thị Hà (2012), Tối ưu hóa điều kiện nuôi cấy chủng Aspergillus
protuberus sinh tổng hợp enzyme chitinase được phân lập từ rừng ngập mặn Cần Giờ, Tạp chí khoa học Trường Đại học Cần Thơ,22b: 26-35. 3. Thạch Thành Trung, Hồ Thị Thu Linh, Đinh Minh Hiệp (2009), Nghiên
cứu sự cảm ứng isozyme endochitinase ở Trichoderma longibrachiatum
Tđ16, Science & Technology Development, 12(17): 34-41.
4. Trần Đình Toại, Nguyễn Văn Thiết, Nguyễn Bích Thủy, Đỗ Trung Sĩ
(2008), Động học của quá trình hoạt hóa chitinase trong phản ứng thủy phân chitin thành glucosamine, Tạp chí Khoa học- Công nghệ, 1: 79-85.
TÀI LIỆU TIẾNG ANH
5. Abidi, F., F. Limam and M.M. Nejib, (2008), Production of alkaline
proteases by Botrytis cinerea using economic raw materials: Assay as biodetergent. Proc. Biochem., 43: 1202-1208.
6. Akcan N, Uyar F, (2011), Production of extracellular alkaline protease
from Bacillus subtilis RSKK96 with solid state fermentation. Eurasia J
Biosci 5: 64-72.
7. Alfred M Mayer, Richard C Staples, 2002, laccase new functions for an
old enzyme, Phytochemistry. ;60(6):551-65.
8. Bhatnagar A., Sillanpaa M (2010). “Utilization of agro-industrial and municipal waste materials as potential adsorbents for water treatment: a
review”. Chem Eng J, 157:277-96.
9. Bugg T. D., Ahmad M., Hardiman E.M., Singh R., 2011, The emerging role for bacteria in lignin degradation and bio-product formation,
38
10. C. Held, A. Kandelbauer, M. Schroeder, A. Cavaco-Paulo, G. M. Guebitz (2005), biotransformation of phenolics with laccase containing
bacterial spores, Environ Chem Lett 3: 74–77.
11. C. P. Kubicek, (1993), “From cellulose to cellulase inducers: facts and fiction,” in Proceedings of the 2nd Symposium Trichoderma Reesei Cellulases and Other Hydrolases (TRICEL ’93), P. Suominen and T.
Reinikainen, Eds., vol. 8, pp. 181–188, Foundation for Biotechnical and
Industrial Fermentation Research, Espoo, Finland.
12. Chacko J T., Subramaniam K. (2011). "Enzymatic degradation of azo
dyes: a review". Int J Environ Sci, 1:1250-60.
13. CL Wang, M Zhao, L Lu, XD Wei, TL Li, (2011), Characterization of
spore laccase from Bacillus subtilis WD23 and its use in dye decolorization, African Journal of Biotechnology Vol. 10(11), pp. 2186-
2192.
14. Couto and Herrera (2006), Industrial and biotechnological applications
of laccases:A review, Biotechnology advances 24, 500-513.
15. D. S. Manamgoda & Lei Cai (2011), Cochliobolus: an overview and current status of species, Fungal Diversity, 51:3–42.
16. Domínguez. A, Couto S. R, Sanroman. R. A (2005), Dye decolorization
by Trametes hirsutaimmobilized into alginate beads, World Journal of
Microbiology and Biotechnology, Vol 21. 405-409.
17. E. A. Bayer, J. P. Belaich, Y. Shoham, and R. Lamed, (2004),“The cellulosomes: multienzyme machines for degradation of plant cell wall
polysaccharides,”Annual Review of Microbiology,vol. 58, pp. 521–554.
18. Gabriella Kova´cs, La´szlo´ Sa´gi, Ge´raldine Jacon, (2012), Expression of a rice chitinase gene in transgenic banana (‘Gros Michel’, AAA genome group) confers resistance to black leaf streak disease, 2013,
Transgenic Res, 22:117–130.
19. Galai S., Limam F., Marzouki M. N. (2009), A New Stenotrophomonas
maltophilia Strain Producing Laccase. Use in Decolorization of
39
20. Garima Kaushik & Indu Shekhar Thakur (2014), Production of laccase and optimization of its production by Bacillus sp. using distillery spent
wash as inducer, Bioremediation Journal, 18:1, 28-37.
21. Ghafoor A, Hasnain S (2010), Purification and Characterization of an
Extracellular Protease from Bacillus subtillis EAG-2 Strain isolated from Ornamental Plant Nursery, Pol J Microbiol, Vol 59(2): 107-112.
22. Gianfreda L., Xu. F & Bollag J.M, 1999, Laccases: A Useful Group of
Oxidoreductive Enzymes, Bioremediation Journal, 3:1, 1-26.
23. Giongo, J.L., F.S. Lucas, F. Casarin, P. Heeb and A. Brandelli,
(2007). Keratinolytic protease of Bacillus species isolated from the Amazon basin showing remarkable dehairing activity. World J.
Microbiol. Biotechnol., 23: 375-382.
24. Givaudan A, Effosse A, Faure D, Potier P, Bouillant ML, Bally R, (1993), Polyphenol oxidase in Azospirillum lipoferum isolated from rice rhizosphere : evidence for laccase activity in nonmotile strains of
Azospirillum lipoferum. FEMS Microbiol Lett 108:205–210.
25. Gurulakshimi. M, Sudarmani. D.N.P and Venba. R (2008),
Biodegradation of leather acid dye by Bacillus subtilis, Advanced
Biotechnology, 12-17.
26. Hiroshi Ihui, Hirano S., Kosaki H., Uno Y., (1994), “Biotechnology and
bioactive polymers”, International Journal of Science, 2: 34-35.
27. Joe J, Kothari RK, Raval CM, Kothari CR, Akbari VG, et al. (2011) “Decolorization of Textile Dye Remazol Black B by Pseudomonas
aeruginosa CR- 25 Isolated from the Common Effluent Treatment
Plant”. J Bioremed Biodegrad 2:118.
28. K. Narayanan, Nagosh Chopada, P. Vasanhth Raj (2013), “Fungal chitinase production and its application in biowaste management”,
Journal of Scientific and Industrial Research, 72: 393-399.
29. K. Vega ; Kalkum, Markus (2012), Chitin, Chitinase Responses, and
40
30. Kalyani D., Dhiman S.S., Kim H., Lee. J. K. (2012). "Characterization of
a novel laccase from the isolated Coltricia perennis and its application to detoxification of biomass". Process Biochem. 47(4):671–678.
31. L. Sang-Mok and Y. M. Koo (2001), “Pilot-scale production of cellulase
using Trichoderma reesei Rut C-30 in fed-batch mode,”Journal of
Microbiology and Biotechnology, vol.11,no. 2, pp. 229–233.
32. Laura-Leena Kiiskinen, (2005), characterization and heterologous
production of a novel laccase from Melanocarpus albomycetes.
33. Marie-Françoise Hullo, Ivan Moszer, Antoine Danchin and Isabelle
Martin-Verstraete (2001), CotA of Bacillus subtilis Is a Copper- Dependent Laccase, Journal of Bacteriology, 183(18), p. 5426–5430.
34. Mathiasen TE. Laccase and beer storage. PCT international application, WO 9521240 A2, (1995)
35. Maulin. P. S, Kavita. A. P, Sunu. S. N, and Darji A. M. (2014)
“Microbial degradation and decolorization of reactive dyes by Bacillus Spp. ETL-1979.” American Journal of Microbiological Research, vol. 2,
no. 1: 16-23.
36. Mikolasch and Schauer., (2009), Fungal laccases as tools for the
synthesis of new hybrid molecules and biomaterials, Applied
Microbiology and Biotechnology, , Volume 82, pp 605-624.
37. Nunes, A.S. and M.L. Martins, (2001). Isolation, properties and kinetics
of growth of a thermophilic Bacillus. Braz. J. Microbiol., 32: 271-275.
38. Olumide D. Olukanni, Aliu Adenopo1, Ayodeji O. Awotula and Akinniyi A. Osuntoki (2013), Biodegradation of Malachite Green by
Extracellular Laccase Producing Bacillus thuringiensis RUN1, Journal
of Basic & Applied Sciences, Vol 9, 543-549.
39. P. Mishra, R. Kshirsagar, S. Nilegaonkar1 and S. Singh (2012), Statistical optimization of medium components for production of extracellular
chitinase by Basidiobolus ranarum: a novel biocontrol agent against plant pathogenic fungi, ,Journal of Basic Microbiology, 52: 1–10. .
41
40. Piontek K, Antorini M, Choinowski T. (2002), Crystal structure of a
laccase from the fungus Trametes versicolor at 1.90-A resolution containing a full complement of coppers, J Biol Chem. ;277(40):37663-9.
41. Ponraj M, Gokila K and Zambare V (2011), Bacterial decolorization of
textile dye ORANGE 3R. Intl. J . Advanced Biotechnol. &Res . 2, 168-
177.
42. R. C. Kuhad, M. Manchanda, and A. Singh (1999), Hydrolytic potential
of extracellular enzymes from a mutant strain of Fusarium
oxysporum,Bioprocess Engineering, vol. 20, no. 2, pp. 133–135.
43. R.K.Sukumaran, R.R.Singhania and A. Pandey (2005), Microbial
cellulases production, applications and challenges, Journal of Scientific
and Industrial Research, vol. 64, no. 11, pp. 832– 844.
44. Renate Reiss, Julian Ihssen, Linda Thöny-Meyer (2011), Bacillus
pumilus laccase: a heat stable enzyme with a wide substrate spectrum, BMC Biotechnology.
45. Rossana C. Minussi, Glaucia M. Pastore, Nelson Duran (2002), Potential
applications of laccase in the food industry, Trends in Food Science &
Technology, Vol13, pp: 205-216.
46. S.S. Desai and C. Nityanand (2011), Microbial Laccases and their
Applications: A Review. Asian Journal of Biotechnology, 3: 98-124. .
47. Sambrook J., Russel D.W. (2001). Molecular cloning. A laboratory manual, 3rd ed. Cold spring harbor laboratory press, Cold spring harbor, NewYork
48. Saratale R.G., Saratale G.D., Chang J.S., Govindwar SP. (2011).
"Bacterial decolorization and degradation of azo dyes: a review". J
Taiwan Inst Chem Eng, Vol 42:138-57.
49. Singh. G, Ahuja. N, Sharma. P and Capalash. N (2009), Response surface methodology for the optimized production of an alkaphilic laccase from γ – Proteobacterium JB, BioResources 4(2),544-553.
42
50. Soares M.A, Cavallazzi J.R.P, Kasuyal C.M (2005), Screening of
inducers for laccase production by Lentinula edodes in liquid medium,
Brazilian J Microb 36: 383-387.
51. Sondhi. S, Sharma P., George N., Chauhan P.S., Puri N., Gupta. N,
(2014), An extracellular thermo-alkali-stable laccase from Bacillus
tequilensis SN4, with a potential to biobleach softwood pulp, 3 Biotech.
52. Vishalakshi N.,Lingappa K., Amena S.,Prabhakar M., Dayanand A.
(2009), Production of alkaline protease from Streptomyces gulbargensis and its application in removal blood stains, Indian Journal of
Biotechnology, vol 8, July , 280-285
53. Wu Y., Li T., Yang L (2012). "Mechanisms of removing pollutants from aqueous solution bu microorganisms and their aggretaes: a review".
Bioresource Technol, Vol 107:10-8 .
54. Y. H. Percival Zhang, M. E. Himmel, and J. R. Mielenz (2006), “Outlook for cellulase improvement: screening and selection strategies,”
Biotechnology Advances, vol. 24, no. 5, pp. 452– 481.
55. Zaharia C., Suteu D., Muresan A., Muresan R&Popescu A (2009). "textile wastewater treatment by homogenous oxidation with hydrogen peroxide". Environmental Engineering and Management Journal, Vol.8, No.6, pp.1359-1369.
56. Zu F., Viraraghavan T (2001). "Fungal decolorrization of dye