hóa 16S rRNA
a) Tách DNA tổng số
DNA tổng số được tách chiết theo mô tả của Sambrook và Russel [47]. Các bước được tiến hành theo thứ tự sau:
22
-Bước 1: Thu sinh khối tế bào vào eppendorf 1,5ml bằng cách ly tâm 6000 vòng/phút trong 10 phút
-Bước 2: Hòa tan mẫu trong 400µl dung dịch đệm lysis Thành phần đệm:
20mM Tris – HCl pH8 50mM NaCl
10mM EDTA
-Bước 3: Bổ sung 30µl lysozyme 10mg/ml, ủở 37oC trong 15-30 phút -Bước 4: Bổ sung 10µl protease K 10 mg/ml, ủở 56oC trong 60 phút -Bước 5: Bổ sung phenol tỉ lệ 1:1 (theo thể tích), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút, thu dịch nổi
-Bước 6: Bổ sung hỗn hợp chloroform : isoamylalcohol theo tỉ lệ 1:1 (theo thể tích), ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút
-Bước 7: Hút dịch phía trên chuyển sang eppendorf mới. Tủa DNA bằng ethanol 100%, giữ mẫu DNA ở -20oC trong 2-3 giờ
-Bước 8: Ly tâm 12000 vòng/phút trong 15 phút để thu tủa DNA -Bước 9: Rửa DNA bằng ethanol 70%
-Bước 10: Làm khô, hòa tan trong nước khử ion vô trùng b) Điện di kiểm tra DNA tổng số
DNA được điện di trên gel agarose 1% trong đệm TAE 1X, nhuộm bằng ethidium bromide (0,5 µg/ml) và tiến hành hiển thị băng DNA dưới ánh sáng tử ngoại.
c) Khuếch đại đoạn gen 16S rRNA bằng kỹ thuật PCR
Cặp mồi 27F và 1492R được sử dụng để nhân gen mã hóa 16S rRNA từ
23 Bảng 3.2 Thành phần phản ứng PCR Thành phần Thể tích Nước khử ion khử trùng 14,3 µl Đệm Taq 10X 2,5 µl dNTPs 2 mM 2,5 µl MgCl2 20 mM 2,5 µl Mồi xuôi 27F 10 pmol 1 µl Mồi ngược 1492R 10 pmol 1 µl Taq polymerase (5 U/µl) 0,2 µl
DNA khuôn 1 µl
Tổng thể tích 25 µl
Chu trình nhiệt cho phản ứng PCR: (i). Bước 1: 95oC trong 5 phút; (ii). Bước 2: 94oC trong 1 phút; (iii). Bước 3: 55oC trong 50 giây; (iv). Bước 4: 72oC trong 1 phút 30 giây; (v). bước 5: 72oC trong 5 phút; (vi). Bước 6: ử ở
4oC. Trong đó ba bước 2,3,4 lặp lại 30 chu kỳ
d) Xác định trình tự gen mã hóa 16S rRNA
Sản phẩm PCR của chủng BBV11 được xác định trình tự bởi Công ty Macrogen, Hàn Quốc.
24
PHẦN 4:
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN