II. MỤC ĐÍCH NGHIÊN CỨU
2.3 Thăm dò hoạt tính kháng sinh của phức chất Cu(II), Ni(II) với phối tử
phối tử
Các thí nghiệm thử hoạt tính sinh học của các mẫu nghiên cứu đều được thực hiện bởi Phòng Tế bào gốc của Trường Đại học Khoa học Tự Nhiên Thành phố Hồ Chí Minh.
Để tiến hành sàng lọc các chất có hoạt tính kháng sinh, chúng tôi tiến hành thử hoạt tính kháng vi sinh vật bằng các phương pháp khoanh giấy lọc đặt trên bề mặt thạch theo dược điển Việt Nam.
■Nguyên liệu:
- Mẫu thực vật và sinh vật biển được chuẩn bị theo một quy trình thống nhất đã được xây dựng theo khuôn khổ đề tài VIETNAM-ITALIA
- Các chủng vi sinh vật kiểm định bao gồm:
- Vi khuẩn Gr (-): Escherichia coli (ATCC 25922) Pseudomonas aeruginosa (ATCC 25923)
- Vi khuẩn Gr (+): Bacillus subtillis (ATCC 27212) Staphylococcus ảueus
- Nấm sợi: Aspergillus niger, Fusarium oxysporum
-Nấm men: Candida albicans, Saccharomyces cerevisiae - Kháng sinh kiểm định:
+ Ampicylin đối với vi khuẩn Gr (+) + Tetracylin đối với vi khuẩn Gr (-) + Nystatin đối với nắm sợi và nấm men
- Cách pha kháng sinh: Kháng sinh pha trong DMSO với nồng độ; Ampicylin: 50mM; Tetracylin: 10mM; Nystatin: 0,04mM
- Môi trường nuôi cấy vi sinh vật:
Môi trường duy trì và bảo tồn giống: Saboraud txtrose broth cho nấm men và nấm mốc. Vi khuẩn trong môi trường Trypcase soya broth (TBS).
Môi trường thí nghiệm: Eugon broth cho vi khuẩn, Myco phil cho nấm.
■Phương pháp tiến hành và đọc kết quả:
Bước 1: Sàng lọc sơ bộ tìm chất chiết có hoạt tính - Chuẩn bị vi sinh vật:
Nấm được duy trì trong môi trường dinh dưỡng nêu ở phần nguyên liệu phương pháp. Các chủng kiểm định được hoạt hóa trước khi tiến hành thử nghiệm trong môi trường dinh dưỡng dịch thể đặc biệt (24 giờ đối với vi khuẩn, 48 giờ đối với nấm). Sau đó được pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm.
- Chuẩn bị mẫu thử:
+ Hòa tan các chiết phẩm trong dung dịch DMSO bằng máy Vortex với nồng độ 4-10mg/ml.
+ Từ dung dịch gốc nhỏ sang phiến lượng 96 giếng, mỗi giếng 10l mẫu. + Nhỏ vào mỗi giếng đã có mẫu sẵn 190l vi sinh vật đã hoạt hóa. + Đối chứng dương:
Dãy 1: Môi trường Dãy 2: Kháng sinh + vi sinh vật kiểm định
+ Đối chứng âm: chỉ có vi sinh vật kiểm định
+ Để trong tủ ấm 37oC/24 giờ đối với vi khuẩn và 30oC/48 giờ đối với nấm. + Đọc kết quả:
Mẫu dương tính khi nhìn bằng mắt thường thấy trong suốt, không có vi sinh vật phát triển, giống như hình ảnh ở các giếng chứng âm tính. Mẫu dương tính ở bước 1 sẽ được tiếp tục thử bước 2 để tính giá trị MIC.
Bước 2: Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của chất có hoạt tính:
- Các bước tiến hành như bước 1: Riêng mẫu đã có hoạt tính được sàng lọc ở bước 1 được pha loãng theo các thang nồng độ thấp dần, từ 5 đến 10 thang nồng độ để tính giá trị tối thiểu mà ở đó vi sinh vật bị ức chế phát triển gần như hoàn toàn.
- Đọc kết quả:
Nồng độ dương tính là ở đó không có vi sinh vật phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFU < 5. Đánh giá mẫu thô có MIC 200g/ml; Mẫu tinh khiết có MIC 50g/ml là có hoạt tính.
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Xác định thành phần và cấu tạo của phối tử H2L1
3.1.1. Phổ IR của H2L1
Phổ IR có dải hấp thụ rộng và mạnh ở 1678,13 cm-1 chứng tỏ trong phối tử có nhóm cacbonyl (C=O), còn tần số ở 1614,47 cm-1 tương ứng với dao động hóa trị của nhóm C=N. Dải hấp thụ 1153,47 cm-1 tương đối rộng và mạnh ứng với dao động hóa trị của C-O-C ở nhóm ete. Sự xuất hiện của dải hấp thụ trung bình ở 1512 cm-1 tương ứng với tần số dao động hóa trị của liên kết C=C. Dải hấp thụ ở 34441,37 cm-1 ứng với dao động của nhóm -NH và dải hấp thụ ở 3190,37 cm-1 ứng với dao động hóa trị O-H phenol của phối tử. Dải hấp thụ trung bình ở 1084,03 cm-1 được gán cho dao động hóa trị N-N của hydrazin [69].
Bảng 3.1: Tần số dao động của phổ IR phối tử H2L1
(cm-1) Quy gán dao động
3441,12 Hóa trị N-H (amin bậc 2), NH
3190,37 hóa trị O-H phenol, OH
3064,59 Hóa trị sp2 =C-H, 2970,48 2858,60 hóa trị sp3 C-H CH 1678,13 Hóa trị C=O 1614,47 Hóa trị C=N + biến dạng N-H 1512,24 Hóa trị C=C vòng 1417,73 biến dạng sp3 CH3, CH2 1226,77 Hóa trị C-N
1294,24 hóa trị C-O ester 1153,47 Alkoxy C-O mạnh 1084,03 hóa trị C-N , hóa trị N-N 810,13 754,19 653,89 biến dạng alkene sp2 C-H
Hình 3.1: Phổ IR của phối tử H2L1 3.1.2. Phổ HR-ESI-MS
Việc xác định khối lượng phân tử của phối tử (H2L1) bằng khối phổ đã rất hữu ích trong việc giải đoán cấu trúc của nó. Trong nghiên cứu này chúng tôi đo phổ khối lượng phân giải cao để xác định công thức phân tử của phối tử tổng hợp được. Số liệu và công thức phân tử tính được nêu trong bảng 3.2.
Bảng 3.2: Khối lượng phối tử
Công thức Khối lượng m/z chính xác của [M+Na]
+
Lý thuyết Thực nghiệm C16H16N2O3Na 307,1059 307,1073
Hình 3.2: Phổ HR-ESI-MS của phối tử
Như vậy, phổ HR-ESI-MS có cụm pic phân tử với m/z = 307,1073 ứng với ion [M+Na]+
, phù hợp rất tốt với giá trị m/z tính toán 307,1059 tương ứng với công thức của phối tử là C16H16N2O3. Điều đó cho phép chúng tôi kết luận phối tử có công thức phân tử C16H16N2O3, có khối lượng mol 284.
3.1.3. Phổ 1H-NMR
Phổ 1H-NMR cho thấy tín hiệu của proton của nhóm metyl tại 2,30 (3H, s), tín hiệu của 8 proton thơm trong vùng 6,87 – 7,34 ppm, một proton của N-H tại 8,41 (1H, s), tín hiệu proton của metylen tại 4,63 (2H, s).
Bảng 3.3: Số liệu phổ 1H-NMR của phối tử
Proton ở nguyên tử cacbon Độ dịch chuyển (ppm) Ghi chú H (thực nghiệm) H* (mô phỏng) 1 - - 2 7,33 (1H, d) 7,66 3 7,003(1H, d) 7,08 4 7,25 (1H, d) 7,52 5 6,98 (1H, d) 7,02 6 7,33 (1H, d) 7,66 1’ - - 2’ 6,87 (1H, d) 6,87 3’ 7,14 (1H, d) 7,12 4’ - -
5’ 7,14 (1H, d) 7,12
6’ 6,87 (1H, d) 6,87
4’-CH3 2,30 (3H, s) 2,34
-NH 8,41 (1H, s) 8,00
-CH2- 4,63 (2H,s) 4,63
( H được đo trong dung môi CDCl3 và MeOD)
Từ phổ 1H – NMR thực nghiệm và phổ 1H- NMR trên mô hình mô phỏng, kết hợp các dữ kiện phổ IR đã phân tích ở trên , chúng tôi đưa ra công thức cấu tạo của phối tử như sau:
Hình 3.4: Phổ 1H-NMR của phối tử H2L1
3.2. Xác định thành phần của phức chất Ni(II) với phối tử
3.2.1 Phổ hồng ngoại IR của phức chất Ni(II) với phối tử
Phổ IR của phức Ni(II) có dải hấp thụ rộng và mạnh ở 3132,5 cm-1
tương ứng với dao động hóa trị của nhóm N-H, đồng thời dải hấp thụ mạnh ở 1618,33cm-1 tương ứng với tần số dao động hóa trị của liên kết C=O, dải C=N dịch chuyển xuống 1546,96 cm-1, đều giảm mạnh so với trong H2L1. Dải hấp thụ khá mạnh ở 1022,31 cm-1 do dao động hóa trị của nhóm N-N cũng có sự giảm tần số rõ rệt so với trong phối tử tự do. Những sự dịch chuyển này chứng tỏ có sự tạo phức giữa kim loại Ni (II) với phối tử qua nguyên tử N nhóm hydrazid và O nhóm cacbonyl.
Hình 3.6: Phổ IR của phức chất Ni(II) với phối tử
3.2.2. Phổ khối lượng phân giải cao HR-ESI-MS của phức chất Ni(II) với phối tử H2L1 Ni(II) với phối tử H2L1
Phổ HR-ESI-MS có các cụm pic với số khối m/z 359,0565, 419,0564 và 625,1622 là những mảnh cấu trúc chứa ion Ni(II). Còn pic với số khối 307,1076 chính là phối tử bị tách ra ở điều kiện đo MS, dưới dạng [M+Na]+.
Bảng 3.5: Công thức và khối lượng của phức Ni(II)
Công thức Khối lượng M chính xác
Lý thuyết Thực nghiệm [NiL2+H]+ 625,1597 625,1622 [NiLX.MeOH+H]+
X là gốc formic 419,0753 419,0584
Như vậy, phức chất có thành phần và các mảnh khối lượng tạo thành trong phổ MS của phức chất có thể được mô tả như sau (hình 3.7).
Hình 3.7: Phổ HR-ESI-MS của phức Ni(II) với phối tử H2L2
Như vậy có thể kết luận rằng phối tử HL tạo phức với Ni(II) theo tỷ lệ 1:2. Cấu trúc của phức chất NiL2 có thể mô tả như sau:
NiL2+Na 625,1597 NiLOH+H 359,0542 HL+Na 307,1059 NiLX.MeOH+H 419,0753
3.3. Xác định thành phần của phức chất Cu(II) với phối tử
Phản ứng của dung dịch H2L1 với CuCl2 trong dung môi etanol được thực hiện ở điều kiện đun nóng hồi lưu trong môi trường axit. Khi kết tinh, thu được phức màu vàng nâu.
3.3.1 Phổ hồng ngoại IR của phức chất Cu(II) với phối tử
Phổ IR của sản phẩm này có dải hấp thụ rộng và mạnh ở 3423,76 cm-1
ứng với sự tồn tại nhóm NH giống như trong phối tử, trong khi dải ở 3200 của nhóm OH biến mất. Sự thay đổi này so với phối tử chứng tỏ đã có sự tạo phức giữa Cu(II) và nhóm –OH phenol. Dao động hóa trị C=O dịch chuyển xuống tần số 1604,83 cm-1, đồng thời dao động hóa trị của C=N cũng dịch chuyển xuống đến 1580 cm-1.
Dải ở 3020,63 cm-1 ứng với dao động hóa trị =C-H, dải trung bình ở 1541 và 1381 cm-1 thuộc dao động biến dạng nhóm NH bị tách do sự tạo phức của N; dải ở 1020 cm-1 do dao động hóa trị của nhóm N-N tổ hợp với nhóm C-N. Ngoài ra, dải hấp thụ ở 466,79 cm-1 ứng với dao động hóa trị của liên kết Cu-N, chứng tỏ có sự tạo liên kết phối trí giữa N amin với ion đồng.
Sự khác nhau về phổ IR giữa phức của Cu(II) với phức của Ni(II) như vậy có thể là bằng chứng của sự phối trí qua 3 nguyên tử cho của phối tử, tức là phối tử thể hiện dung lượng phối trí 3, qua O của nhóm phenol, N của nhóm hydrazin và O của nhóm cacbonyl.
Hình 3.8: Phổ IR của phức chất Cu(II) với phối tử 3.3.2. Phổ 1H- NMR của phức chất Cu(II)
Phổ cộng hưởng từ proton của phức Cu(II) với phối tử được biển diễn trong hình . Có thể thấy rõ tín hiệu H của nhóm NH vẫn tồn tại trong phức chất, chứng tỏ phối tử không phân ly H từ nhóm NH.
Trên cơ sở những số liệu đã có, chúng tôi đề nghị cấu trúc của phức chất CuL2 như sau, ứng với SPT 6 của Cu(II) và mỗi phối tử L thể hiện tritntat.
3.4.Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn
+ Các mẫu thực hiện gồm các bước: Bước 1: Chuẩn bị môi trường
Bước 2: Hoạt hóa chủng E.coli (Gram -) và Bacillus subtilis (Gram +) Bước 3: Test khả năng kháng khuẩn ở 7 nồng độ pha loãng khác nhau cho từng mẫu
Bước 4: Kiểm chứng với mẫu đối chứng dương: kháng sinh Amp đối với E.coli (Gram -) và Cm đối với Bacillus subtilis (Gram +)
Bước 5: Kiểm chứng với mẫu đối chứng âm là dung dịch nước cất vô trùng Bước 6: Ủ đĩa ở 37 oC qua đêm.
Bước 7: Đọc kết quả
Bước 8: Thí nghiệm được lặp lại 3 lần
Bảng 3.6: Đánh giá tính kháng vi khuẩn Gram(+) và Gram(-) của phức Cu(II) và Ni(II) với phối tử H2L1
Bảng 3.6. Số liệu thử hoạt tính kháng khuẩn của phối tử và phức chất
(+):có tạo vòng kháng khuẩn; (-): không tạo vòng kháng khuẩn
Hình 3.10. Hình ảnh vòng kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram (-)
Tên mẫu Nồng độ (mg/ml) Gram (+) Gram (-)
Cu(II) Vàng nâu 50 + + 5 + - 0,5 - - 5.10-2 - - 5.10-3 - - 5.10-4 - - 5.10-5 - - Ni(II) xanh 15 + - 1,5 - - 0,15 - - 1,5.10-2 - - 1,5.10-3 - - 1,5.10-4 - - 1,5.10-5 - -
Hình 3.11. Hình ảnh kháng khuẩn đối với vi khuẩn gram (+)
Thử hoạt tính kháng khuẩn của phối tử H2L1 cho thấy phối tử không có khả năng kháng khuẩn.
Kết quả trên cũng cho thấy khả năng kháng khuẩn có ở cả hai phức Cu(II) và Ni (II) do có khả năng tạo vòng kháng khuẩn. Nhưng khả năng kháng khuẩn của phức Cu (II) ở nồng độ cao, cho thấy khả năng kháng khuẩn của Cu (II) là không cao.
KẾT LUẬN
Từ kết quả nghiên cứu trên có thể đưa ra một số kết luận sau:
1. Phối tử N'-[(E)-(2-hydroxyphenyl) methylitne] -2-phenoxyacetohydrazit đã được tổng hợp từ monocloetylacetat, p-crezol, hidrazin và 2-hydroxy benzalthyd. Phối tử đã được xác định cấu trúc phân tử bằng các dự liệu phổ IR, 1H- NMR và HR-MS.
2. Phối tử tạo thành phức chất với tỷ lệ M(II): L = 1:2 với các ion kim loại Ni(II) và Cu(II). Các phức chất rắn đã được tách và làm sạch, nghiên cứu bằng các phương pháp phổ.
Phức chất với Ni(II) có thành phần NiL2, với M = 624; phối tử tạo phức qua N nhóm hydrazin và O nhóm C=O.
Phức chất với Cu(II) có thành phần CuL2, phối tử tạo phức với Cu(II) qua O nhóm OH, N nhóm hydrazin và O nhóm C=O.
3. Các phức chất và phối tử đã được thử sàng lọc hoạt tính khảng khuẩn với các chủng E. coli và Bacillus subtilis. Phối tử không có khả năng kháng khuẩn với hai chúng vi khuẩn này, chỉ có phức chất của Cu(II) có hoạt tính kháng khuẩn với Bacillus subtilis Gr(+).
TÀI LIỆU THAM KHẢO TIẾNG VIỆT
1. Hoàng Nhâm (2001), Hoá học Vô cơ, tập 3, Nhà xuất bản giáo dục. 2. Dương Tuấn Quang (2002), Luận án tiến sĩ Hoá học, Viện Hoá học, Trung tâm khoa học Tự nhiên và Công nghệ quốc gia.
3. Đặng Như Tại, Phan Tống Sơn, Trần Quốc Sơn (1980), Cơ sở hoá học hữu cơ, Nhà xuất bản Đại học và Trung học chuyên nghiệp, Hà Nội.
4. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lý ứng dụng trong hoá học, Nhà xuất bản Đại học Quốc gia.
5. Nguyễn Hữu Đĩnh, Trần Thị Đà (1999), Ứng dụng một số phương pháp phổ nghiên cứu cấu trúc phân tử, NXB Giáo dục.
6. Nguyễn Đình Triệu (1999), Các phương pháp vật lí ứng dụng trong hóa học, NXB Đại học Quốc gia Hà Nội.
7. Nguyễn Kim Phi Phụng (2004), Khối phổ, NXB Đại học Quốc gia TP Hồ Chí Minh.
TIẾNG ANH
8. Abu-Eittah R., Osman A. and Arafa G. (1979), “Studies on copper(II)- complexes : Electronic absorption spectra”, Journal of Inorganic and Nuclear Chemistry, 41(4), pp.555-559.
9. O. W. Salawu and A. O. Abdulsalam (2011). Synthesis, characterization and biological activities of Cd(II) complexes with hydrazit ligands. Tr Pharma Chemica, 3 (4),p298-304.
10. Rajesh Malhotra, Mange1 S. Mallk, Jai P. Singh, and Kuldlp S. Dhindsa (1992). Synthesis, Characterization, and Microbiocidal Activity of a-Methyl-( 2-Thiophenomethylene) Aryloxyacetic Acid, Hydrazits and Their Metal Complexes. Journal of Inorganic Biochemistry, 45, p269-275.
11. Manjola Mancka, Winfried Plass (2007). Dioxomolybtnum(VI) complexes with amino acid functionalized N-salicylitne hydrazits: Synthesis, structure and catalytic activity. Inorganic Chemistry Communications, 10,p 677–680.
12. Simona Nica, Manfred Rudolph, Helmar Gorls, Winfried Plass (2007). Structural characterization and electrochemical behavior of oxovanadium (V) complexes with N-salicylitne hydrazits. Inorganica Chimica Acta 360, p 1743–1752.
13. Ivanka Ivanovic,Nevenka Gligorijevic, Sandra Arantlovic, et al. (2013). New ruthenium(II)-arene complexes bearing hydrazits and the corresponding (thio)semicarbazones of 3- and 4-acetylpyridine: Synthesis, characterization, crystal structure ttermination and antiproliferative activity. Polyhedron 61, p112–118.
14. Palanisamy Sathyatvi, Paramasivam Krishnamoorthy, Rachel R. Butorac, Alan H.Cowley, Nallasamy Dharmaraj (2014). Novel ONN pincer type copper(II) hydrazit complexes: An investigation on the effect of electronegativity and ring size of heterocyclic hydrazits towards nucleic acid/protein binding, free radical scavenging and cytotoxicity. Inorganica Chimica Acta 409, 185–194.
15. Anindita Sarkar, Samudranil Pal (2009). Divanadium(V) complexes with 4-R -benzoic acid (1-methyl-3-oxo-butylitne)-hydrazits: Syntheses, structures and properties. Inorganica Chimica Acta 362, 3807–3812.
16.H. Schiff (1864). “Studies on trivalent lanthanit complexes of bis- (acetylacetone) o-dianisidine”, Ann. Suppl 3, 343.
17.J.P. Costes,. Fr (1986). “Nickel(II) and copper(II) complexes of tetratntate unsymmetrical Schiff base ligands: First evitnce of positional isomerism in such system”, Bull. Soc. Chim, 78.
18.J.P. Costes (1987). “Nickel(II) and copper(II) complexes of tetratntate unsymmetrical Schiff base ligands: First evitnce of positional isomerism in such system”, Inorg. Chim. Acta 17, 130.
19.M. Calligaris, L. Randaccio (1987). “Synthesis and characterization of salen-type ligands functionalized with pyrrole trivative pendant arms”, Comprehensive Coordination Chemistry, vol. 2, Pergamon Press (Chapter 20), London, Chim.
20.R.H. Holm, J. Am (1960). "Studies on Nickel(II) Complexes. I. Spectra of Tricyclic Schiff Base Complexes of Copper(II) and Nickel(II)", Chem. Soc 82, 5632.
21.J. Lacroix (2001). “Layered transition metal hydroxit: Magnetism and multifunctionalities by tsign”, Eur. J. Inorg. Chem 2, 339.
22.J.Nagel, U. Oertel, P. Frietl, H. Komber, D. Mobius (1997).
“Solvent-tpentnt synthesis and mono-hydrolysis of the di-Schiff base of (±)