2.3.1. Phương phâp tâch chiết ADN tổng số
ADN lúa đƣợc tâch chiết vă tinh sạch theo phƣơng phâp CTAB cải tiến trín cơ sở phƣơng phâp của Shagai – Maroof (năm 1984).
Lâ của câc giống lúa nghiín cứu đƣợc cắt lấy mẫu sau khi cấy 2 -3 tuần. Mẫu đƣợc lấy văo sâng sớm lă lúc nồng độ muối trong lâ thấp, câc enzym hoạt động ít lă điều kiện tốt để tâch chiết ADN.
Nghiền mẫu cùng với nitơ lỏng trong eppendorf (hoặc cối) thănh dạng bột mịn, khi nghiền luôn để mẫu trong nitơ lỏng.
Cho mẫu văo eppendorf 2ml vă cho 1ml đệm chiết (100mM Tris HCl, pH 8): 500mM NaCl: 50mM EDTA, pH 8,0): 0,07% - Mercaptol ethanol) rồi đảo đều, giữ trong đâ vă thím 50µl SDS 10%.
Đặt văo nồi câch thủy ủ trong 30 phút ở 650C, thỉnh thoảng đảo cho dịch đƣợc trộn đều.
Ly tđm 13500 vòng/phút trong 20 phút.
Lấy ra đổ dịch nổi ở phía trín sang một eppendorf mới. Thím 1ml isopropanol alcohol rồi để văo tủ 40C cho kết tủa khoảng 30 phút (hoặc qua đím) không để văo tủ lạnh sđu -200C vì sẽ gđy hiện tƣợng kết tủa muối.
Ly tđm 13500 vòng/phút trong 25 phút.
Đổ hết dịch nổi ở trín rồi giữ lại tủa ở dƣới đây eppendorf. Cho 400µl đệm TE (10mM Tris HCl pH=8,0; 0,5 mM EDTA pH=8,0)cho văo tủ 650C ủ trong 5 phút. Dùng pipet nhỏ hoặc búng nhẹ hoă tan tủa, bƣớc năy có thể giữ ở 40
C qua đím.
Cho 3µl Rnase (10mg/ml) văo mỗi eppendorf. Ủ ở 37oC khoảng 3 tiếng. Thím 400µl đệm CTAB (0,2M Tris HCl (pH 8,0): 2M NaCl: 0,05M EDTA (pH 8,0): 2% CTAB, đặt văo nhiệt độ 650C trong 15 phút, thỉnh thoảng trộn, lắc đều.
Cho vă tủ hút, thím văo 8ml chloroform/isoamyl alcohol (24:1), lắc trộn từ 5 – 7 phút nhằm loại bỏ protein.
Ly tđm ở 13500 vòng/phút trong 10 phút. Dung dịch bín trong eppendorf tâch thănh 2 phần. Sử dụng pipet hút chuyển dịch nổi ở phía trín sang một
eppendorf mới. Nếu chƣa sạch có thể chiết lại lần 2 bằng chloroform/isoamyl alcohol (24:1).
Thím 2,5 lần thể tích ethanol 96% vă giữ trong tủ lạnh sđu (-200
C).
Ly tđm 13500 vòng/phút trong 30 phút, loại bỏ cồn để giữ lại tủa trắng ở đây ống.
Rửa tiếp bằng 400µl cồn 70% rồi đƣa văo mây ly tđm 13500 vòng/phút trong 5 phút. Dùng pipet rút bỏ cồn giữ lại tủa, cho văo mây lăm khô chđn không khoảng 10 phút lăm khô tủa (ADN), sau đó cho 100µl TE (10:1) văo mỗi eppendorf hoă tan tủa.
Giữ ADN trong tủ lạnh sđu (- 200C) để sử dụng cho câc bƣớc nghiín cứu tiếp theo.
2.3.2. Phương phâp PCR với mồi thí nghiệm
Câc thănh phần tham gia văo phản ứng PCR đƣợc chuẩn bị trong tấm PCR plate 96 giếng. Thănh phần, hăm lƣợng của câc chất trong mỗi phản ứng nhƣ trong bảng 2.2. Bảng 2.2. Thănh phần phản ứng PCR STT Thănh phần Thể tích (l) 1 H2O cất khử trùng 8.95 2 Buffer 10X 1,5 3 MgCl2 (50mM) 0,45 4 dNTP (1mM) 1,0
5 Taq DNA polymeraza (5U) 0,1
6 Primer forward 5M 0,5
7 Primer Revert 5M 0,5
8 ADN (35ng/ l) 2,0
Sau khi đê có đủ thănh phần, hăm lƣợng câc chất cần thiết, tiến hănh đặt chƣơng trình chạy cho mây. Chu trình nhiệt trong mây PCR nhƣ sau:
Bảng 2.3. Chƣơng trình chạy của phản ứng PCR Bƣớc Nhiệt độ (o
C) Thời gian Số chu kỳ
1 94 5 phút 1 2 94 55* 72 30 giđy 30 giđy 45 giđy 35 3 72 5 phút 1 4 10 ∞ 1
(*): Nhiệt độ gắn mồi - có thể thay đổi tùy theo từng cặp mồi thí nghiệm
2.3.3. Phương phâp điện di trín gel agarose 0,8%
Câc bước tiến hănh
Cđn 0.8g agarose, đong 100ml TBE 0,5X (5,4g Tris base; 2,76g axít boric; 2ml 0,5M EDTA, pH = 8,0) cho văo bình tam giâc.
Đun trong lò vi sóng cho đến khi tạo thănh một dung dịch đồng nhất. Để nguội đến khoảng 50 - 600
C, thím 5µl ethidium bromide (10 mg/ml) vă lắc đều.
Chuẩn bị khay vă lƣợc. Đổ dung dịch agarose văo khay sao cho không có bọt khí. Chờ khoảng 45 - 60 phút gel đông.
Rút lƣợc, đặt gel văo bể điện di. Đổ 0,5X TBE ngập mặt gel khoảng 2mm.
Tra sản phẩm PCR đê đƣợc trộn với Xylen cyanol văo giếng. tỷ lệ 5µl Xylen cyanol /15µl mẫu. Thời gian vă điện thế sử dụng để điện di dăi hay ngắn phụ thuộc văo kích thƣớc của cặp mồi thí nghiệm cần kiểm tra. Câc mẫu chạy với ladder 25 bp.
Soi gel trín mây soi cực tím.
2.3.4. Phương phâp điện di trín gel polyacrylamide biến tính
Chuẩn bị kính
Lau kỹ bề mặt hai tấm kính 3 lần bằng nƣớc cất, sau đó lau lại 3 lần bằng ethanol 95%, để khô sau mỗi lần lau.
Lau tấm kính dăi với giấy lụa tẩm Rain-X . Để 5 phút cho khô dung dịch.
Chú ý. Trânh lăm dính dung dịch năy lín tấm kính ngắn.
Lau tấm kính ngắn với dung dịch dính (Binding solution) đƣợc tạo thănh bằng câch thím 2µl Bind Silane văo 1ml chứa 95% ethanol vă 5% glacial acetic acid.
Để cho tấm kính khô, lau tiếp bằng ethanol 95% 1 lần.
Lắp ghĩp 2 tấm kính lại với nhau, sử dụng nẹp Sigma 0,4mm.
Chuẩn bị gel polyacrylamide
Chuẩn bị dung dịch 4,5% acrylamide từ dung dịch gốc 40% acrylamide (19:1 = acrylamide 380g; bisacrylamide 20g pha trong 1 lít nƣớc)
Đổ 60ml dung dịch 4,5% acrylamide (25,2 Urea: 6ml TBE 10X: 6,75ml acrylamide/bis-acrylamide 40% (19:1)văo 1 cốc đong 100ml. Thím 300l 10% APS (ammonium persulfate) vă 60l TEMED (N,N,N’,N’-Tetraethyl - ethylendiamine), trộn đều.
Bơm dung dịch gel văo giữa hai tấm kính sao cho không có bọt khí. Căi lƣợc văo giữa hai tấm kính (răng lƣợc hƣớng ra phía ngoăi). Dùng kẹp cố định lƣợc.
Để gel polyme hóa trong 1 - 2 giờ.
Điện di
Thâo lƣợc vă loại bỏ hết câc mảnh gel thừa bâm trín mặt tấm kính. Lắp râp bộ điện di. Cho 1 lít đệm TBE 1X văo buồng đệm trín vă dƣới.
Dùng xylanh đuổi hết bọt khí ở bề mặt phía trín của khuôn gel. Chạy tiền điện di (prerun) với cƣờng độ dòng điện lă 50 - 60A, công suất 92 - 100W.
Biến tính câc sản phẩm PCR ở 950C trong 5 phút, rồi ngay lập tức đặt văo trong đâ vă phủ đâ lín trín ít nhất 5 phút.
Sản phẩm PCR lúc năy đê đƣợc trộn với 4µl Sequencing Stop solution (10mM NaOH: 95% formamid: 0,05% bromphenol; 0,05% xylene cyanol).
Tra văo mỗi giếng 5µl sản phẩm PCR đê đƣợc lăm biến tính, câc mẫu chạy với ladder 50 bp.
Thời gian tra mẫu không kĩo dăi quâ dăi để gel không bị nguội đi nhiều.
Tiến hănh điện di với công suất 60W vă ở 500C, thời gian chạy ngắn hay dăi tùy kích thƣớc từng mồi sử dụng.
+ Chuẩn bị câc dung dịch
Dung dịch cố định/dừng phản ứng (Fix/Stop solution): gồm có 100ml glacial acetic acid vă 900ml nƣớc cất.
Dung dịch nhuộm (Staining solution) đƣợc tạo thănh bằng câch hòa tan 1g bạc nitrat (AgNO3) văo 1 lít nƣớc cất, sau đó bổ sung thím 1,5ml formaldehyd (H2CO)37%.
Dung dịch hiện (Developing solution): Hòa tan 30g natri cacbonat (Na2CO3) trong 1 lít nƣớc cất vă lăm lạnh ở -200
C.
Chú ý. (Trƣớc khi sử dụng thím 1,5ml formaldehyd (H2CO)37% vă 200µl natri thiosulfat 10% (Na2S2O.5H2O).
+ Tiến hănh nhuộm
Sau khi chạy điện đi, thâo gỡ tấm kính bâm gel vă tiến hănh câc bƣớc sau: Cố định gel: Đặt tấm kính văo khay sao cho mặt bâm gel hƣớng lín
trín, đổ dung dịch cố định/dừng phản ứng vă để trong khoảng 30 phút. Sau đó lấy gel ra khỏi dung dịch. Chú ý. Giữ lại dung dịch năy để dùng cho bƣớc sau. Rửa gel bằng nƣớc cất 2 lần mỗi lần 5 phút. Cho gel văo dung dịch nhuộm, lắc nhẹ trong 30 phút. Thím formaldehyd vă sodium thiolsufat văo dung dịch hiện. Lấy gel ra khỏi dung dịch nhuộm, rửa lại bằng nƣớc cất trong 5 - 10 giđy.
Đƣa gel văo dung dịch hiện vă lắc nhẹ đến khi câc băng xuất hiện. Cho gel văo dung dịch cố định/dừng phản ứng ở trín trong 3 - 6 phút. Rửa lại gel bằng nƣớc cất. Để gel khô tự nhiín sau đó ghi nhận kết quả.
2.4. Địa điểm vă thời gian tiến hănh nghiín cứu
-Địa điểm:Tại Viện Di truyền Nông nghiệp, bộ môn Kĩ thuật di truyền. - Thời gian: 08/2014-04/2015.
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÍN CỨU VĂ THẢO LUẬN
3.1. Tâch chiết vă tinh sạch ADN
Tâch chiết ADN lă bƣớc đầu tiín khâ quan trọng trong mọi nghiín cứu về sinh học phđn tử. Nếu có ADN đủ độ tinh sạch lă điều kiện tốt cho câc bƣớc nghiín cứu tiếp theo. Trong nghiín cứu năy, chúng tôi chọn phƣơng phâp tâch chiết ADN bằng CTAB. Lâ non 3 tuần sau khi cấy của những giống nghiín cứu đƣợc thu để tâch chiết ADN. Nồng độ vă độ tinh sạch của ADN đƣợc kiểm tra bằng điện di trín gel agarose 0,8% cùng với ADN chuẩn. Nhuộm gel bằng dung dịch ethidum bromide vă ghi nhận kết quả trín mây soi cực tím. Kết quả tâch chiết ADN đƣợc minh hoạ ở hình 3.1
Hình 3.1. Kết quả kiểm tra ADN tổng số tâch chiết theo phƣơng phâp CTAB trín gel agarose 0,8%.
Giếng số 1- Lambda ADN nồng độ chuẩn (200ng/l), giếng số 4 – OM6976, giếng số 6 – KC25
Kết quả tâch chiết ADN cho thấy phƣơng phâp tâch chiết ADN bằng CTAB cho hiệu quả cao, 100% số mẫu ADN đủ độ tinh sạch. Câc mẫu ADN không bị đứt gêy, việc loại bỏ ARN bằng RNase tiến hănh khâ tốt thể hiện câc băng điện di gọn, rõ. Những mẫu ADN năy đủ điều kiện để sử dụng cho những thí nghiệm sinh học phđn tử tiếp theo.
3.2. Khảo sât đa hình trín 12 NST giữa giống cho vă nhận QTL/gen quy định tính trạng tăng số hạt trín bông định tính trạng tăng số hạt trín bông
Đa hình giữa hai giống lúa có thể đƣợc phât hiện bằng chiều dăi khâc nhau của câc đoạn lặp lại đƣợc khuếch đại bởi phản ứng PCR khi sử dụng cùng một cặp mồi SSR. Việc nhận dạng đa hình ADN giữa câc giống cho gen vă nhận gen với câc chỉ thị SSR trín 12 NST nhằm phục vụ chọn lọc nền di truyền giống nhận gen vă chọn lọc câc câ thể con lai.
Dòng KC25 có mang QTL quy định tính trạng tăng số hạt trín bông
Yd7. Nhằm mục đích tìm kiếm chỉ thị có thể sử dụng xâc định nền di truyền
trong câc câ thể con lai, tiến hănh phản ứng PCR với ADN của câc giống lúa OM6976; KC25.
Sử dụng 156 chỉ thị SSR trín 12 nhiễm sắc thể đê xâc định 58/156chỉ thị cho đa hình giữa giống OM6976 vă KC25 một văi kết quả chạy đa hình đƣợc thể hiện qua Hình 3.2, Hình 3.3, Hình 3.4
Quan sât Hình 3.2 ta thấy câc chỉ thị RM1208, RM10916, đƣờng chạy số 3(mẫu DNA của giống KC25) xuất hiện băng ADN cao hơn câc băng ở đƣờng chạy số 2 đƣờng chạy số 5 (mẫu ADN của giống OM6976). Chỉ thị RM24865 ở đƣờng chạy số 3 xuất hiện băng ADN thấp hơn băng ADN ở đƣờng chạy số 5. Sự chính lệch về vị trí câc băng ADN ở đƣờng chạy 5 với 3 thể hiện đa hình giữa câc giống OM6976 với giống KC25.
Hình 3.3. Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM19199; RM19238; RM22825
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
Kết quả Hình 3.3 cũng cho thấy chỉ thị RM19199, RM22825 có vị trí mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 cao hơn câc đƣờng chạy số 2, 4, 5. Ở chỉ thị RM19238 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 2, 4 lín mờ, đƣờng chạy số 3 vă 5 lín rõ, có sự khâc biệt vị trí ở đƣờng chạy số 3 vă số 5. Chỉ thị RM21471 ở tất cả câc giếng không xuất hiện băng vạch năo có thể do mồi không hoạt động hoặc do lăm phản ứng sai.
Hình 3.4. Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM6; RM3; RM345
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
Chỉ thị RM6, RM3, RM345 mẫu ADN ở đƣờng chạy số 3 có vị trí thấp hơn đƣờng chạy số 5 do vậy chỉ thị RM6, RM3, RM345 cho đa hình giữa câc giống OM6976 vă KC25.
Sau khi phđn tích câc kết quả chạy điện di kiểm tra chúng tôi xâc định đƣợc 58/156 chỉ thị cho đa hình giữa OM6976 với KC25. Kết quả tổng hợp đƣợc thể hiện ở Bảng 3.1.
Bảng 3.1. Câc chỉ thị SSR cho đa hình giữa giống OM6976 vă KC25
STT Tín chỉ thị cho phđn tử đa hình Số lƣợng 1 RM10115, RM10136, RM10741, RM10800, RM10815, RM10916, RM11062, RM11438, RM11504, RM1287, RM3412b, RM493, RM5365, RM7075 14 2 RM207, RM526, RM5356, RM6, RM7355 5 3 RM14795, RM14820, RM282, RM3297, RM3654, RM5480 6
4 RM16589, RM16820, RM280, RM349, RM551 5 5 RM19199; RM31 2 6 RM19238, RM3, RM345, RM494, RM527, RM528, RM7434 7 7 RM11, RM21769, RM7338 3 8 RM22825, RM331, RM447 3 9 RM296, RM11874, RM1208 3 10 RM24865, RM25181, RM25271, RM3628 4 11 RM19840, RM341, RM3625 3 12 RM1194, RM247, RM7102 3 Tổng 58
Câc chỉ thị cho đa hình giữa giống cho gen KC25 vă giống nhận gen OM6976 sẽ đƣợc sử dụng để đânh giâ xâc định nín di truyền ở câc thế hệ con lai.
Kết quả khảo sât đa hình trín 12 NST của câc giống nghiín cứu với câc chỉ thị SSR đƣợc minh họa bởi một số hình ảnh sau đđy:
Hình 3.5 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM3482; RM3628; RM3625; RM3654; RM3753
Hình 3.6 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM11745; RM11799; RM11874; RM20163;
RM20192
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
Hình 3.7 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM31; RM 148; RM 296; RM247; RM282
Hình 3.8 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM10115; RM10649; RM10681;
RM10694A;RM10694; RM10720
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
Hình 3.9 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM10741; RM10782; RM10806; RM10815;
RM10820
Hình 3.10 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM16589; RM16820; RM17391; RM17411;
RM09034
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
Hình 3.11 Một số hình ảnh khảo sât đa hình với ADN câc giống cho vă nhận gen với chỉ thị RM11438; RM12769; RM13197; RM13332;
RM14795; RM14820
L.Marker; 3.KC25; 5.OM6976
3.3 Thảo luận
Ở Trung quốc câc nhă khoa học đê thănh công quy tụ câc QTL/gen quy định yếu tố cấu thănh năng suất văo một giống [8]. Những giống lúa cải tiến năy đƣợc tạo ra bằng sự kết hợp cả hai phƣơng phâp chọn giống truyền thống
vă hiện đại. Bƣớc đột phâ trong việc chọn giống lúa siíu cao sản trở nín có thể thực hiện đƣợc sau khi locut điều khiển tính trạng tăng năng suất (QTL) đƣợc xâc định. Bằng việc sử dụng phƣơng phâp chọn giống nhờ chỉ thị phđn tử vă lai trở lại đê đẩy nhanh quâ trình quy tụ câc gen đó văo những giống mới năng suất cao [21], [17], [19].
Ngăy nay, với công nghệ sinh học phđn tƣ̉ đƣợc phât triển nhanh chóng trong giải trình tự hệ gen , phđn tích chức năng gen vă so sânh hệ gen đê dẫn đến phât triển đƣợc một số lƣợng lớn chỉ thị phđn tử . Lập bản đồ QTL , xâc đi ̣nh QTL liín quan đến tính trạng năng suất. Đồng thời phât triển kĩ thuật chỉ thị phđn tƣ̉ kiểm tra QTL nhằm giải thích cơ chế di truyền của câc tính trạng năng suất. Câc nỗ lực hợp tâc trong phđn tích chức năng gen đê dẫn tới việc xâc định đƣợc 23 gen vă QTL quan tđm [16].
Mặc dù đê có nhiều tiến bộ trong nghiín cứu về tính trạng tăng năng suất lúa, nhƣng vẫn còn nhiều thâch thức cần phải chứng minh về cơ chế phđn tử quy đi ̣nh tí nh hình thănh câc tính trạng năng suất. Hầu hết tất cả câc tính trạng năng suất bao gồm số bông trín khóm, số hạt trín bông, vă khối lƣợng hạt biểu hiện nhiều biến dị liín tục trong quần thể di truyền hoặc ngay giữa câc giống đê đƣợc thƣơng mại, lă tính trạng đó do nhiều gen hay QTL quy định. Cơ sở dữ liệu Gramene, đê lƣu trữ vă xâc định hăng ngăn QTL/gen liín