2.4.1. Phương pháp xử lý mẫu
Mẫu dược liệu được xử lý bằng hai kỹ thuật xử lý mẫu:
Kỹ thuật vô cơ hóa ướt sử dụng tác nhân là acid HNO3 đặc và acid HClO4 đặc.
Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng sử dụng tác nhân là hỗn hợp acid HNO3 đặc và dung dịch H2O2.
Quá trình hóa học xảy ra:
Mẫu + HNO3 + H2O2→ Pb(NO3)x + H2O + CO2 +NO2
2.4.2. Phương pháp phân tích định lượng
Xác định hàm lượng chì trong mẫu phân tích bằng kỹ thuật hấp thụ
Định lượng chì trong dược liệu bằng phương pháp đường chuẩn.
Tiến hành xây dựng đường chuẩn, rồi dựa vào đồ thị tính nồng độ
chì trong mẫu dược liệu.
2.4.3. Kết quả thu được xử lý thống kê
Hàm lượng chì trong dược liệu: Hàm lượng Pb trong mẫu được quy về đơn vị ppm và được tính theo công thức sau:
X=
Trong đó:
X: hàm lượng Pb trong mẫu phân tích (ppm)
C: nồng độ Pb trong dung dịch mẫu tính theo đường chuẩn (ppb) m: Khối lượng mẫu phân tích
V: thể tích dung dịch mẫu định mức sau khi vô cơ hóa mẫu (ml)
Giá trị trung bình:
Độ lệch chuẩn: S=
Độ lệch tương đối: % RSD= . 100%
Giới hạn phát hiện: LOD =
Giới hạn định lượng: LOQ= 3 x LOD trong đó a là độ dốc của đường chuẩn, SD là độ lệch chuẩn của mẫu trắng.
Chuẩn F (Fisher)
Giả sử có 2 kết quả thu được từ hai dãy thí nghiệm hoặc từ 2 phương
chính xác, ta so sánh 2 phương sai: Ftn= 2 2 2 1 s s trong đó: 2 1 s > 2 2 s vì vậy Ftn luôn lớn hơn 1.
So sánh giá trị Ftn với giá trị F với độ tin cậy 95% và số bậc tự do f1= n1 – 1 và f2= n2 – 1. Nếu:
Ftn F: độ chính xác của 2 kết quả khác nhau không có ý nghĩa thống kê. Ftn > F: độ chính xác của 2 kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê.
Chuẩn t ( Student)
Giả sử định lượng hoạt chất trong một mẫu bằng 2 phương pháp có kết quả x1 và x2 , với số lần thực nghiệm N1, N2 và độ lệch chuẩn s1 ,s2. Cần đánh
giá xem hai kết quả khác nhau có ý nghĩa thống kê hay không, ta thực hiện
các bước sau:
Trước hết so sánh độ chính xác của hai phương pháp theo chuẩn F ( độ
tin cậy 95%):
Nếu FtnF’: độ lệch chuẩn s1 ,s2 thuộc cùng 1 tập hợp, tính độ lệch chuẩn chung theo công thức:
Sd = 2 1 2 1 2 2 2 2 1 1 1 1 2 ) 1 ( ) 1 ( N N N N s N s N ; t.sd
Giá trị t ứng với độ tin cậy 95% và f= N1 + N2 – 2 So sánh giá trị của với x1x2 nếu:
2
1 x
x : hai kết quả trung bình x1 và x2 khác nhau không có ý nghĩa thống kê, chúng cùng đại diện cho một giá trị thực,
2
1 x
x > : hai kết quả trung bình khác nhau có ý nghĩa thống kê. Nếu Ftn > F’: hai phương pháp có độ chính xác khác nhau cso ý nghĩa
1 2 1 1 N s 2 2 2 2 N s
Tìm giá trị của t1 với f1= N1-1 và của t2 với f2= N2-1. Tính giá trị T theo công thức: T = 2 1 2 2 1 1 v v t v t v . So sánh giá trị T với x1x2 2 1 x x T: hai kết quả phù hợp nhau, 2 1 x
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM VÀ BÀN LUẬN
3.1. XÂY DỰNG PHƯƠNG PHÁP ĐỊNH LƯỢNG CHÌ TRONG DƯỢC
LIỆU
3.1.1.Xử lý dụng cụ
- Cốc Teflon: Tiến hành vệ sinh các cốc Teflon bằng kỹ thuật vô cơ hóa ướt trong lò vi sóng, sau đó tráng rửa bằng nước cất hai lần và đảm bảo các bộ
phận của cốc phải khô trước khi tiến hành xử lý mẫu.
- Các cốc có mỏ, pipet, bình định mức được xử lý bằng cách ngâm trong dung dịch H2SO4 5% trong 24h. Sau đó tráng lại dụng cụ bằng nước cất hai lần.
- Các cốc chứa dung dịch đo: Lắc siêu âm với nước 2-3 lần x 15 phút / lần. Sau đó ngâm trong dung dịch HNO3 1%.
3.1.2. Lựa chọn các thông số hoạt động của máy quang phổ
Để thực hiện các phép đo trong để tài này, chúng tôi sử dụng các điều kiện đã được cài đặt sẵn của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử Zeenit 700P:
Bảng 2: Thông số làm việc của máy quang phổ hấp thụ nguyên tử
Điều kiện Thông số
Loại đèn HCL
Cường độ đèn 3 mA
Độ rộng khe 0.8 nm
Bước sóng 283.3 nm
Thể tích tiêm mẫu 20µL
Bảng 3: Chương trình nhiệt độ nguyên tử hóa được áp dụng
Giai đoạn Nhiệt độ (oC)
Làm khô 90/110 Tro hóa 400/400 Nguyên tử hóa 1500/1500 Làm sạch lò 2300/2300
Hình 4: Phổ hấp thụ của một số dung dịch chì chuẩn
(a)Mẫu chuần chì 2ppb (d) Mẫu chuần chì 12ppb (b)Mẫu chuẩn chì 4ppb
(c)Mẫu chuẩn chì 8ppb
(e) Mẫu chuẩn chì 16ppb (f) Mẫu chuẩn chì 20ppb
Nhận xét: Với các thông số hoạt động của máy quang phổ hấp thụ
nguyên tử ở bảng 2 và chương trình nhiệt độ nguyên tử hóa mẫu ở bảng 3 thu
được vạch phổ khá rõ ràng. Những thông số này cho độ hấp thụ của chì cao và ổn định nên chúng tôi giữ nguyên trong quá trình phân tích.
(a)
(d)
(b) (c)
(f) (e)
3.1.3. Xây dựng phương pháp xử lý mẫu
Xử lý mẫu phân tích là khâu hết sức quan trọng, là một trong những yếu tố ảnh hưởng đến độ chính xác của kết quả phân tích. Dựa trên các tài liệu tham khảo, chúng tôi thực hiện tiến hành khảo sát hiệu suất thu hồi của hai kỹ
thuật xử lý mẫu: Kỹ thuật vô cơ hóa ướt và kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng.
3.1.3.1. Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt
Chúng tôi tiến hành vô cơ hóa 6 mẫu dung dịch chì chuần 100ppb sử
dụng tác nhân vô cơ hóa acid HNO3 đặc và acid HClO4 đặc bằng kỹ thuật vô
cơ hóa ướt.
Chúng tôi lựa chọn hai acid này do: Acid HNO3 đặc là chất oxy hóa mạnh, là tác nhân giải phóng các vết nguyên tố trong các mẫu dược liệu, acid HClO4 đặc là một chất oxy hóa mạnh nên dùng để phá hủy hoàn toàn các hợp chất hữu cơ. Cho aicd HClO4 đặc ngay từ đầu có thể gây cháy nổ (vì nó là chất có tính oxy hóa rất mạnh) nên khi tiến hành, chúng ta cho acid HNO3 đặc
trước để vô cơ hóa những chất hữu cơ dễ bị oxy hóa, sau đó mới thêm acid
HClO4 đặc để vô cơ hóa hoàn toàn mẫu phân tích.
Tiến hành: Hút chính xác 2ml dung dịch chì 100ppb vào 6 bình Kendal. Thêm chính xác 5ml acid HNO3 đặc vào mỗi bình. Đun trên bếp cách cát đến khi còn cắn. Để nguội, thêm khoảng 1ml acid HClO4 đặc vào mỗi bình và tiếp tục đun. Tiếp tục làm như vậy cho đến khi dung dịch trong. Đun tiếp để đuổi
acid dư. Để nguội, sau đó lọc chuyển sang bình định mức 25ml, thêm nước cất hai lần đến vạch định mức và tiến hành đo phổ.
Bảng 4: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt Bình Kendal Abs Nồng độ Pb chuẩn (ppb) Nồng độ Pb tìm lại (ppb) Hiệu suất (%) 1 0,04512 6,854 85,68 2 0,04583 6,972 87,15 3 0,04755 7,258 90,73 4 0,04620 7,033 87,91 5 0,04515 6,858 85,73 6 0,04671 8 7,118 88,97 Hiệu suất thu hồi trung bình: 87,68% RSD % = 2,22
Lưu ý: Theo dõi nhiệt độ của hỗn hợp khi xử lý để đảm bảo an toàn lao
động vì acid HClO4 rất dễ gây nổ. Không để hỗn hợp trong bình sôi mạnh vì
acid bay hơi rất nhanh và có thể gây cháy.
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô
cơ hóa ướt sử dụng tác nhân là acid HNO3 đặc và acid HClO4 đặc là 87,68%,
độ lặp lại RSD % = 2,22.
3.1.3.2. Khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng sóng
Chúng tôi tiến hành vô cơ hóa 6 mẫu dung dịch chì chuần 100ppb bằng
tác nhân vô cơ hóa acid HNO3 đặc và dung dịch hydro peroxyd H2O2.
Hỗn hợp này cơ ưu điểm là tạo ra môi trường oxy hóa rất mạnh, phá hủy hợp chất hữu cơ nhanh. Acid HNO3 đặc là tác nhân oxy hóa mạnh, thường
dùng để giải phóng các vết nguyên tố, mặt khác nó là acid dễ bay hơi, ít gây ảnh hưởng đến nền mẫu. H2O2 có khả năng gây phá hủy, vô cơ hóa hoàn toàn
hợp chất hữu cơ. Mặt khác hỗn hợp này có tính oxy hóa êm dịu, không làm mẫu bắn lên thành cốc, tránh gây sai số trong quá trình vô cơ hóa mẫu.
Tiến hành: Hút chính xác 2ml dung dịch chì chuẩn 100ppb vào 6 cốc Teflon. Thêm vào mỗi cốc 5ml acid HNO3 đặc và 1ml dung dịch hydro peroxyd H2O2. Để khoảng 30 phút. Thực hiện quá trình vô cơ hóa bằng lò vi
sóng QLAB PRO theo chương trình nhiệt độ cài đặt của lò. Sau đó, lọc toàn bộ dịch trong cốc Teflon, tráng cốc và gộp toàn bộ dịch vào bình định mức
25ml, thêm nước cất hai lần đến vạch định mức và tiến hành đo phổ. Kết quả thu được thể hiện ở bảng sau:
Bảng 5: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng Cốc Teflon Abs Nồng độ chì chuẩn (ppb) Nồng độ chì tìm lại (ppb) Hiệu suất (%) 1 0,05151 7,919 98,99 2 0,04999 7,665 95,81 3 0,05196 7,993 99,91 4 0,05110 7,850 98,13 5 0,05036 7,726 96,57 6 0,05060 8 ppb 7,766 97,08 Hiệu suất thu hồi trung bình: 97,75% RSD % = 1,58
Nhận xét: Kết quả thu được cho thấy hiệu suất thu hồi của kỹ thuật vô
cơ hóa ướt bằng lò vi sóng sử dụng tác nhân là acid HNO3 đặc và dung dịch hydro peroxyd H2O2 là 97.75%, RSD % = 1.58.
3.1.3.3. So sánh hai kỹ thuật xử lý mẫu
Dựa vào thực nghiệm, chúng tôi so sánh hai kỹ thuật xử lý mẫu trên một số tiêu chí sau:
Bảng 6: So sánh hai kỹ thuật vô cơ hóa mẫu
Tiêu chí Kỹ thuật vô cơ hóa ướt Kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng
Thời gian Khoảng 1h. Có thể lên đến 24h tùy thuộc bản chất dược liệu.
Khoảng 40 phút với đa số
các mẫu.
Thao tác Đơn giản nhưng dễ gây cháy nổ. Đơn giản, an toàn. Thiết bị Đơn giản, áp dụng được ở mọi
phòng thí nghiệm.
Thiết bị đắt tiền, không phải
cơ sở nào cũng có. Hóa chất
sử dụng
Tốn nhiều acid đặc Tiết kiệm hóa chất
Hiệu suất 87,68% 97,75% RSD % 2,22 1,58
Nhận xét: Dựa vào kết quả so sánh hai kỹ thuật xử lý mẫu trên, nhận thấy kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng có nhiều ưu điểm hơn, chúng tôi quyết định sử dụng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng để xử lý các mẫu
dược liệu định lượng chì.
3.1.4. Xử lý các mẫu dược liệu bằng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng sóng
Để xây dựng quy trình xử lý mẫu dược liệu bằng kỹ thuật vô cơ hóa ướt bằng lò vi sóng, chúng tôi tiến hành khảo sát một số yếu tố sau: Xác định điều kiện vô cơ hóa mẫu, xác định khối lượng dược liệu và xác định tỷ lệ tác nhân
3.2.4.1. Xác định điều kiện vô cơ hóa mẫu
Quá trình vô cơ hóa ướt sử dụng hỗn hợp acid HNO3 đặc và dung dịch hydro peroxyd xảy ra qua 3 giai đoạn:
Giai đoạn 1: Nâng dần nhiệt độ của hỗn hợp phản ứng từ nhiệt độ phòng lên xấp xỉ nhiệt độ sôi của acid nitric (120oC). Việc nâng nhiệt độ từ từ cho
phép vô cơ hóa các thành phần dễ bị oxy hóa ở điều kiện nhẹ nhàng, tránh sự tăng đột ngột nhiệt đô và áp suât.
Giai đoạn 2: Nâng dần nhiệt độ lên cao hơn và giữ trong khoảng thời gian nhất định để vô cơ hóa hết các thành phần còn lại của mẫu, chuyển chì về dạng vô cơ.
Giai đoạn 3: Hạ dần nhiệt độ gần nhiệt độ phòng với mục đích giảm áp suất trong bình và đuổi hết acid dư.
Bảng 7: Điều kiện nhiệt độ vô cơ hóa mẫu
Nhiệt độ Thời gian tăng nhiệt(phút) Thời gian giữ (phút)
120oC 6 0
150oC 5 15
180oC 5 5
3.1.4.2. Xác định khối lượng dược liệu
Khối lượng dược liệu sử dụng cho mỗi lần phân tích quyết định lượng tác nhân oxy hoá sử dụng khi vô cơ hóa mẫu. Khối lượng mẫu cần phải dùng cho mỗi lần phân tích phụ thuộc vào hàm lượng chì có trong mẫu. Thiết bị
phân tích tại cơ sở cho phép xác định trong dải khối lượng từ 100mg-1000mg mẫu phân tích. Kết quả thử nghiệm trên các mẫu dược liệu đã phân tích cho thấy lượng mẫu phân tích tối ưu cho mỗi lần đo là 0.200g. Do đó, chúng tôi
3.1.4.3. Xác định tỷ lệ tác nhân vô cơ hóa mẫu
Để xác định tỷ lệ tối ưu giữa 2 chất, chúng tôi đã tiến hành thử nghiệm xử lý mẫu với hỗn hợp các chất vô cơ hóa với các tỷ lệ khác nhau.
Quá trình vô cơ hóa mẫu được thực hiện như sau:
Cân chính xác khoảng 0.200g mẫu dược liệu cho vào cốc Teflon, thêm những lượng acid HNO3 đặc và H2O2 như trong bảng. Để khoảng 1h, thỉnh thoảng lắc đều cho thấm đều mẫu dược liệu. Sau đó tiến hành phá mẫu bằng máy phá mẫu lò vi sóng theo chương trình điều kiện nhiệt độở bảng 7. Sau đó để nhiệt độ hạ xuống dưới 30oC, tháo bình, tráng rửa cốc bằng nước cất hai lần, lắc kỹ, lọc và gộp toàn bộ dịch lọc vào bình định mức 25ml, thêm nước cất hai lần tới vạch định mức, lắc đều. Đo đọ hấp thụ của dung dịch trên máy AAS. Kết quả được thể hiện trong bảng sau:
Bảng 8: Sự phụ thuộc độ hấp thụ quang vào tỉ lệ các chất vô cơ hóa mẫu
Lượng mẫu (g)
Thể tích acid HNO3
Thể tích
H2O2 Nhận xét cảm quan Abs
0,2023 4ml 1ml
Dung dịch xuất hiện cặn có màu gần giống
màu dược liệu.
0,04097
0,2038 5ml 1ml Dung dịch thu được
trong, không có cặn. 0,04777
Nhận xét: Qua kết quả thực nghiệm thu được chúng tôi nhận thấy sử
dụng hỗn hợp các chất vô cơ hóa mẫu với tỷ lệ 5ml dung dịch HNO3 đặc và 1ml dung dịch H2O2 là thích hợp để xử lý các mẫu dược liệu.
3.1.5. Quy trình định lượng chì trong dược liệu
Cân chính xác khoảng 0,200 g
dược liệu vào cốc Teflon
Thêm 5ml acid HNO3 đặc và 1ml dung dịch H2O2. Để khoảng 1h. Thỉnh thoảng lắc
cho mẫu dược liệu ngấm đều.
Vô cơ hóa mẫu bằng lò vi sóng
theo điều kiện nhiệt độở bảng 7.
Lọc toàn bộ dịch trong cốc Teflon và gộp dịch tráng cốc vào bình định mức 25ml, định mức bằng nước cất hai lần.
Đo độ hấp thụ của dung dịch bằng máy AAS Zeenit 700P theo
chương trình cài đặt sẵn như
bảng 2 và bảng 3.
Hình 6: Quy trình định lượng chì trong dược liệu bằng kỹ thuật quang phổ hấp thụ nguyên tử
3.2. THẨM ĐỊNH PHƯƠNG PHÁP
3.2.1. Xây dựng khoảng tuyến tính
Để xác định khoảng tuyến tính của Pb chúng tôi tiến hành pha mẫu của Pb chuẩn trong nền HNO3 1% sao cho nồng độ tăng dần 2ppb, 4ppb, 8ppb, 12ppb, 16ppb, 20ppb. Sau đó đo độ hấp thụ trong các điều kiện đã chọn và ghi lại kết quả thu được thể hiện ở bảng 9.
Chuẩn bị dung dịch chuẩn: