Chẩn đoán bệnh Tiên mao trùng trong phòng thí nghiệm với mục đích là phát hiện Tiên mao trùng trong máu gia súc. Tùy theo từng trường hợp bệnh, tuỳ điều kiện mà có thể làm cùng lúc một số phương pháp hoặc lựa chọn một phương pháp phù hợp và có độ chính xác cao.
* Phương pháp phát hiện T.evansitrực tiếp
Để phát hiện T.evansi trực tiếp, có thể áp dụng những phương pháp sau: - Phương pháp xem tươi (Direct smear)
Khi bệnh súc sốt, T.evansi thường xuất hiện trong mao quản ngoại vi. Vì vậy, nên lấy máu vùng ngoại vi để xem tươi.
Cho 1 giọt máu nhỏ lên phiến kính đã có sẵn 1 giọt EDTA; dùng góc của la men khuấy đều, đậy la men lên để máu dàn theo la men thành một lớp mỏng. Soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10x40) để phát hiện Tiên mao trùng sống.
Ưu điểm của phương pháp này là có thể được thực hiện dễ dàng và cho kết quả chính xác khi con vật mắc bệnh ở thể cấp tính, mỗi khi con vật sốt cao để có thể
phát hiện thấy Tiên mao trùng.
Tuy nhiên phương pháp này khó có thể phát hiện được Tiên mao trùng nếu con vật không sốt và bệnh ở thể mãn tính.
- Phương pháp nhuộm Giemsa tiêu bản máu khô
+ Phương pháp giọt dầy: Đặt 1 giọt máu to vào giữa phiến kính, dùng một góc của đầu một phiến kính khác ria tròn giọt máu với đường kính khoảng 1 - 1,25 cm. Để khô tự nhiên trong khoảng 1 giờ, rồi cố định bằng cồn Methanol, nhuộm Giemsa [1 giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS (Phosphat Buffered Saline) pH = 7,2] trong 25 phút. Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô rồi soi dưới kính hiển
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 31 vi (độ phóng đại 10 x 100).
Phương pháp này có nhược điểm là dễ làm tổn thương Tiên mao trùng, do đó khó phân biệt được các loài khác nhau trong trường hợp nhiễm nhiều loài Tiên mao trùng cùng một lúc.
+ Phương pháp giọt mỏng: Đặt 1 giọt máu cách 1 đầu phiến kính 2 cm, dùng la men ria máu thành một lớp mỏng. Để khô, cố định bằng cồn Methanol trong 2 phút. Nhuộm Giemsa trong 25 phút (l giọt Giemsa + 1 ml dung dịch PBS pH = 7,2). Rửa tiêu bản dưới vòi nước chảy mạnh, để khô, soi dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 100).
Ưu điểm của phương pháp giọt mỏng là có thể phân biệt được hình thái các loài Tiên mao trùng khác nhau.
* Phương pháp tiêm truyềnđộng vật thí nghiệm
Đây là phương pháp phổ biến, hiệu quả, chính xác và thường được ứng dụng nhiều để chẩn đoán bệnh Tiên mao trùng ở Việt Nam. Phương pháp này có ưu điểm là chính xác, do trực tiếp phát hiện thấy Tiên mao trùng sau khi nhân chúng lên trong động vật thí nghiệm mẫn cảm. Song, nhược điểm của phương pháp tiêm truyền động vật thí nghiệm là khi cần chẩn đoán nhanh, với số lượng nhiều và thời gian ngắn thì phương pháp này không thểđáp ứng được (Lê Ngọc Mỹ, 1994; Đoàn Văn Phúc, 1994).
Để đánh giá các phương pháp phát hiện T.evansiở Việt Nam, Lê Ngọc Mỹ và cs. (2000) đã sử dụng phương pháp ký sinh trùng học khác nhau để chẩn đoán bệnh Tiên mao trùng ở trâu gây nhiễm. Kết quả cho biết phương pháp tiêm truyền chuột bạch phát hiện nhạy nhất: 3con/ml máu trâu là có thể phát hiện được T.evansi, còn các phương pháp khác gấp từ 2; 125; 250 lần.
*Phương pháp tập trung T.evansi
Người ta đã sử dụng phương pháp ly tâm tập trung T.evansi bằng ống Haematocrit hoặc tách tiên mao trùng bằng gen DEAE - cellulose.
- Phương pháp ly tâm tập trung bằng ống Haematocrit (WOO, 1971): cho máu động vật nghi mắc bệnh vào ống Haematocrit, một đầu ống được bịt kín bằng
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 32 chất dẻo matit, một đầu ống để hở. Ly tâm với tốc độ 14.000 vòng/phút trong 5 phút. Sau đó kiểm tra sự tập trung của T.evansi tại vị trí tiếp giáp giữa huyết tương và hồng cầu (độ phóng đại 10 x 10).
Phương pháp này đơn giản, phát hiện T.evansi tốt hơn phương pháp xem tươi và nhuộm Giemsa. Song, tỉ lệ phát hiện chưa cao.
Với ống Haematocrit trên, có thể thực hiện phương pháp Darkground: dùng cưa y tế cắt ống ở vị trí tiên mao trùng tập trung (ranh giới giữa huyết tương và hồng cầu), nhỏ 1 giọt huyết tương lên phiến kính, đậy la men và kiểm tra dưới kính hiển vi (độ phóng đại 10 x 40).
- Phương pháp tách chiết T.evansi bằng tiền DEAE – cellulose (Diethyl – Anomino Ethyl – cellulose).
* Phương pháp chẩnđoán huyết thanh học
Bằng phương pháp huyết thanh học, có thể phát hiện kháng thể hoặc kháng nguyên T.evansi. Đây là các phương pháp huyết thanh học đặc hiệu.
- Các phương pháp phát hiện kháng thể kháng T.evansi
Khi T.evansi ký sinh, cơ thể vật chủ sinh ra kháng thể đặc hiệu chống lại
chúng. Những phương pháp sau cho phép phát hiện kháng thể kháng T.evansi trong máu vật chủ:
+ Phương pháp ngưng kết trên phiến kính (SAT: Slice Agglutination Test) + Phương pháp LATEX (Latex Agglutination Test)
+ Phương pháp CATT (Card Agglutination Test for Trypanosomiasis) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
+ Phương pháp kháng thể huỳnh quang gián tiếp IFAT (Indirect Fluorescent Antibody Test)
+ Phương pháp ELISA (Enzym Linked Immunosorbent Assay)
- Các phương pháp phát hiện kháng nguyên T.evansi
+ Phương pháp ELISA kháng nguyên (Ag - ELISA) + Phản ứng Suratex
* Phương pháp phát hiện ADN của T.evansi bằng phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction)
Học viện Nông nghiệp Việt Nam – Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 33 PCR là phương pháp hiện đại nhất, mới được đưa vào ứng dụng để chẩn
đoán và xác định loài Tiên mao trùng trong những năm gần đây.
Nguyên lý: dựa vào trình tự sắp xếp các Nucleotit trong các đoạn AND của Tiên mao trùng để xác định. Phương pháp PCR có độ nhạy và độđặc hiệu rất cao.