2.2.4.1. Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat
Quá trình tham khảo tài liệu, đề tài dự kiến qui trình thu nhận Chondroitin sulfate từ sụn cá mập được trình bày ở hình 2.2.
Hình 2.2. Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân
Bất hoạt enzyme
Kết tủa protein hòa tan bằngTCA
Ly tâm
Kết tủa CS thô bằng ethanol
Sấy khô
Chondroitin sulfate thô Ly tâm
Dịch thủy phân
Ly tâm Dịch chứa CS thô
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi
thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn. Sụn cá mập sau khi thu nhận được tách bỏ thịt, làm khô để sử dụng làm nguyên liệu thủy phân thu CS. Trước khi thủy phân, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với tốc độ 25000 vòng/phút trong thời gian 30 phút.
+ Xử lý: Sụn cá được xử lý bằng cách đun nóng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ.
+ Thủy phân: Sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân các mối liên kết peptit
để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với protein bằng liên kết o – glycosid tạo thành phức proteoglycan.
+ Bất hoạt enzyme: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme
bằng cách đun nóng ở 900C trong thời gian 15 phút.
+ Ly tâm: Loại bỏ phần bã, ly tâm 6000 v/phút để thu dịch thủy phân. + Kết tủa protein hòa tan: Sử dụng TCA để kết tủa hoàn toàn protein hòa
tan trong dung dịch.
+ Ly tâm: Tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa protein hòa tan trong dung dịch
và thu dịch chứa CS.
+ Kết tủa CS thô: CS không hòa tan trong ethanol nên sử dụng ethanol để
tủa CS. Sau đó, tiến hành ly tâm để thu chế phẩm CS.
+ Sấy khô: Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS đem đi sấy lạnh để thu
được CS thô. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý sụn cá mập
Từ tham khảo các nghiên cứu trước đây, đồ án thử nghiệm xử lý sụn cá theo quy trình trình bày ở hình 2.3.
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi thu
+ Tách thịt: Quá trình tách sụn cá mập được tiến hành theo hai chế độ xử lý sụn khác nhau:
- Chế độ 1: Tiến hành đun sụn ở 1000C trong 30 phút. Sau đó, làm nguội và tách bỏ thịt cá.
- Chế độ 2: Sụn cá được ngâm trong nước trong 30 phút, không đun và được tách bỏ thịt.
+ Xay nhỏ: Sau khi tách bỏ thịt, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với
tốc độ 25000 vòng/phút trong thời gian 20 phút.
+ Sấy khô: Sấy ở nhiệt độ 700C và bảo quản ở 40C suốt thời gian làm đề tài. + Đánh giá: Sụn cá mập sau khi sấy khô, tiến hành đánh giá cảm quan để chọn
được chế độ xử lý sụn tốt nhất. Sau đó, tiến hành phân tích hóa học sụn cá.
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sụn cá mập Sụn cá mập Tách thịt theo chế độ khác nhau Xay nhỏ Sấy khô Đánh giá Chọn chế độ xử lý sụn
Đun sụn ở 1000C trong 30 phút Không đun, ngâm nước 30 phút
2.2.4.3. Xác định các thông số của quy trình
Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Hình 2.4. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân ở điều kiện nhiệt độ 450C trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme bổ sung 0.1%, chỉ thay đổi thay đổi pH ở các mức: pH tự nhiên; 6; 6.5; 7; 7.5. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó,
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở pH khác nhau
5.5 6.5 7 7.5
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân Tự nhiên
tiến hành ly tâm ở 6000v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4 xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
(adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.5. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở tỷ lệ enzyme khác nhau (%)
0 0.1 0.3 0.4
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân 0.2
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích và ở nhiệt độ 450C trong thời gian 2h với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau, mẫu 1: mẫu đối chứng 0% E, mẫu 2: bổ sung 0.1% E, mẫu 3: 0.2% E, mẫu 4: 0.3% E, mẫu 5: 0.4% E. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.5 xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.6. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở nhiệt độ khác nhau (0C)
40 45 55 60
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân 50
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân ở 400C, mẫu 2: 450C, mẫu 3: 500C, mẫu 4: 550C, mẫu 5: 600C. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 vòng/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Ta có sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.6 xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân trong 2h, mẫu 2: 3h, mẫu 3: 4h, mẫu 4: 5h, mẫu 5: 6h. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.7 xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.7. Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân 2.3. CÁC THIẾT BỊ CHỦ YẾU VÀ HÓA CHẤT ĐÃ SỬ DỤNG. 2.3.1. Các thiết bị chủ yếu
Sử dụng các thiết bị để thực hiện đề tài chủ yếu ở phòng thí nghiệm Công nghệ Sinh học – Trung tâm Thực hành thí nghiệm – Trường Đại học Nha Trang, phòng thí nghiệm Hóa phân tích và phòng thí nghiệm Công nghệ Chế biến, gồm các thiết bị sau: tủ sấy (Memmert – Đức), bể ổn nhiệt (Memmert – Đức), máy so màu UV – Vis (Labomed – Mỹ), máy ly tâm (Đức), thiết bị đo pH (Hanna – Mỹ). (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở thời gian khác nhau (h)
2h 3h 5h 6h
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân 4h
2.3.2. Hóa chất
Các hóa chất sử dụng trong đồ án: Xanh methylene, NaOH, KH2PO4, axit tricloacetic, Na2CO3, thuốc thử Folin – Ciocalteau, tyrosine, H2SO4 đậm đặc, CuSO4
và K2SO4 đều là hóa chất tinh khiết đạt tiêu chuẩn cho phân tích được Trung Quốc sản xuất.
2.4. PHƯƠNG PHÁP XỬ LÝ SỐ LIỆU
Số liệu được xử lý bằng phần mền Excel 2013, phân tích sâu ANOVA phần mềm SPSS 20.0. Tất cả các số liệu được lấy từ kết quả trung bình cộng của 3 lần thí nghiệm song song.
CHƯƠNG III. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN
3.1. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU XỬ LÝ SỤN CÁ MẬP.
Sụn cá mập khô sau khi xử lý được đánh giá cảm quan để chọn chế độ xử lý sụn thích hợp cho quá trình thủy phân. Theo kết quả đánh giá cảm quan ở bảng 3.1 nhận thấy rằng: sụn cá được xử lý bằng nhiệt ở 1000C trong 30 phút khả tăng loại bỏ thịt cá tốt hơn mẫu sụn không xử lý nhiệt.
Do vậy, để đảm bảo thích hợp cho quá trình thủy phân sụn chọn chế độ xử lý
xử lý sụn là đun ở 1000C trong 30 phút.
Bảng 3.1. Kết quả đánh giá chỉ tiêu cảm quan mẫu sụn cá có chế độ xử lý sụn khác nhau STT Chế độ xử lý sụn Đánh giá cảm quan 1 Đun ở nhiệt độ 1000C trong 30 phút. Tách bỏ thịt dễ dàng và loại sạch phần thịt ra khỏi sụn cá, sụn có màu trắng.
2 Không đun, ngâm trong nước 30 phút.
Thịt vẫn còn bám dính trong sụn cá, không thể loại bỏ sạch phần thịt, sụn có màu vàng nâu.
Tiến hành lấy mẫu sụn cá mập xác định thành phần hóa học. Kết quả được thể hiện ở bảng 3.2. Bảng 3.2. Thành phần hóa học của sụn cá mập STT Chỉ tiêu hóa học Thành phần (%) 1 Hàm ẩm 37.67 2 Protein thô 10.5 3 Tro 19.79
Nhận xét:
Từ kết quả xác định trên cho thấy hàm lượng protein thô của sụn cá chiếm 10.5%, hàm ẩm 37.67% và tro tổng số 19.79%. Vì vậy, hàm lượng CS trong sụn cá tương đối cao. Điều này cho thấy có thể tiến hành thu nhận CS từ sụn cá mập.
3.2. XÁC ĐỊNH CÁC THÔNG SỐ TỐI ƯU CHO QUÁ TRÌNH THỦY PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE. PHÂN SỤN CÁ MẬP BẰNG ENZYME NEUTRASE.
3.2.1. Xác định hoạt độ của enzyme neutrase.
Tiến hành lấy mẫu xác định hoạt độ enzyme neutrase. Kết quả xác định hoạt độ enzyme neutrase được thể hiện ở bảng 3.3
Bảng 3.3. Xác định hoạt độ enzyme neutrase
Enzyme Hoạt độ enzyme (PU/g)
Neutrase 1.05
Nhận xét: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Từ kết quả phân tích ở bảng 3.2 cho thấy chế độ thủy phân enzyme Neutrase có hoạt độ 1.05PU/g nếu so sánh với hoạt độ enzyme khi mua thì thấp hơn. Vì vậy, enzyme cần được bảo quản ở nhiệt độ -100C.
3.2.2. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH khác nhau. Mẫu 1: thủy phân ở pH tự nhiên, mẫu 2: ở pH 6, mẫu 3: pH 6.5, mẫu 4: pH 7 và mẫu 5 pH 7.5.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng nhiệt ở 1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành tỷ lệ enzyme 0.1% và nhiệt độ 500C trong thời gian 5h. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.4 và hình 3.1.
Bảng 3.4. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân STT pH Hàm lượng CS (mg/10g mẫu) 1 TN 107.493 2 6 108.663 3 6.5 111.132 4 7 112.002 5 7.5 112.807
Hình 3.1. Ảnh hưởng của pH đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân Nhận xét:
Kết quả phân tích bảng 3.4 và hình 3.1 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi
tăng pH thủy phân thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng tăng và đạt cao nhất ở pH = 7.5. Như vậy, ở pH = 7.5 lượng CS tạo thành cao gấp tương ứng 1.05 lần so với khi pH tự nhiên; 1.04 lần so với khi pH = 6; 1.02 lần so với pH = 6.5, và 1.01 lần so với khi pH = 7. 92 93 94 95 96 97 98 99 100 TN 6 6.5 7 7.5 Hàm lượn g CS t ương đố i (% so vớ i cực đại) pH
Kết quả trên có thể lý giải như sau: pH ảnh hưởng đến hoạt độ của của enzyme, ảnh hưởng đến mức độ ion hóa cơ chất, ion hóa của enzyme và đến độ bền của protein enzyme. Do vậy, khi thay đổi pH làm thay đổi hoạt tính enzyme nên hàm lượng CS tạo thành cũng thay đổi.
Từ các phân tích trên cho thấy ở pH 7.5 khả năng thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase tốt nhất được thể hiện qua hàm lượng CS được tạo thành là cao nhất. Do vậy, pH 7.5 được lựa chọn làm pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
3.2.3. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Tiến hành 5 mẫu thí nghiệm thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase với tỷ lệ enzyme sử dụng khác nhau: mẫu đối chứng; 0.1%; 0.2%; 0.3%; 0.4%. Mẫu đối chứng không bổ sung enzyme.
Các mẫu thí nghiệm được sử dụng 10g sụn cá mập đã được xử lý bằng cách đun ở 1000C trong 1h, tỷ lệ nước bổ sung 1:10. Quá trình thủy phân được tiến hành ở 450C trong thời gian 2h, pH tự nhiên. Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme bằng cách đun ở 900C trong 15 phút, lấy mẫu xác định hàm lượng CS. Kết quả được trình bày ở bảng 3.5 và hình 3.2.
Bảng 3.5. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
STT Tỷ lệ enzyme (%) Hàm lượng CS (mg/10g mẫu)
1 0 95.706
2 0.1 101.424
3 0.2 101.662
4 0.3 98.546
Hình 3.2. Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme đến hàm lượng CS thu được sau thủy phân
Nhận xét:
Kết quả phân tích ở bảng 3.5 và hình 3.2 cho thấy cùng chế độ thủy phân, khi tỷ lệ enzyme neutrase sử dụng tăng thì hàm lượng CS tạo thành trong phản ứng cũng tăng và đạt cao nhất khi tỷ lệ enzyme sử dụng là 0.2%. Sau đó nếu tiếp tục tăng tỷ lệ enzyme sử dụng thì hàm lượng CS tạo thành không tăng mà có xu hướng giảm. Như vậy, ở tỷ lệ enzyme sử dụng 0.2% lượng CS tạo thành cao gấp tương ứng 1.06, 1.03, 1.02 lần so với khi sử dụng tỷ lệ enzyme là 0; 0.3; 0.4%. Mặt khác, nếu so sánh hàm lượng CS tạo thành ở mẫu sử dụng 0.2% enzyme neutrase so với mẫu sử dụng với tỷ lệ enzyme neutrase 0.1% thì hàm lượng CS thu được của các mẫu này không khác nhau về ý nghĩa thống kê.
Kết quả trên có thể lý giải như sau: Khi không sử dụng enzyme, ở nhiệt độ 450C vẫn có một lượng CS tạo thành là do protein bị thủy phân bởi nhiệt độ. Tuy vậy, khi tăng tỷ lệ enzyme sử dụng làm tăng quá trình phân cắt protein của sụn cá dẫn đến
91 92 93 94 95 96 97 98 99 100 0 0.1 0.2 0.3 0.4 Hàm lượn g CS t ương đố i (% so vớ i cực đại) Tỷ lệ enzyme (%)
giải phóng ra CS làm hàm lượng CS tạo thành trong dung dịch tăng. Tuy vậy, khi tỷ lệ enzyme tăng cao sẽ làm giảm hàm lượng CS tạo thành.
Từ các phân tích ở trên cho thấy ở tỷ lệ enzyme bổ sung 0.1% có khả năng thủy phân sụn cá mập là tốt nhất. Do vậy, tỷ lệ enzyme neutrase bổ sung 0.1% được lựa