[1], [12], [13]
Một số đề tài nghiên cứu sử dụng chondroitin sulphat:
Năm 2006, S.C. Shin, S.J. You, B.K. An và C. W. Kang – Trung tâm Nghiên cứu Tài nguyên động vật, Cao đẳng chăn nuôi – Hàn Quốc đã công bố kết quả công trình nghiên cứu “Nghiên cứu chiết xuất mucopolysaccharide-protein có chứa Chondroitin sulphat từ sụn gà”. Kết quả nghiên cứu cho thấy điều kiện tối ưu của việc chiết xuất bằng phương pháp đun nóng là ở 1000C trong 120 phút với sản lượng 40.09% và hàm lượng CS của sụn là 28.46%. Đối với alcalase, điều kiện tối ưu 2% alcalase trong 120 phút thì năng suất thủy phân là 75.87% và hàm lượng CS là 26,61%. Việc sử dụng enzyme để chiết xuất CS có năng suất cao hơn so với đun nóng. Đồng thời, kết luận rằng trong sụn gà có chứa một lượng chondroitin sulphat đáng kể.
Năm 2014, đề tài nghiên cứu sản xuất Chondroitin sulphat từ khí quản vịt của Vittayanont, M. and Jaroenviriyapap, T – Bộ môn Công nghệ thực phẩm, Khoa Nông nghiệp, Đại học Prince of Songkla, Hatyai, Songkhla, Thái Lan. Tiến hành nghiên cứu xử lý khí quản vịt bằng kiềm (NaOH 0.01 – 0.5M, ở 40C trong khoảng 1 – 6h), enzyme (alcalase 0.1 – 0.5%, ở 550C, pH = 8, 1 – 6h) và đun nóng (1 – 120 phút). Các mẫu được đun nóng được thủy phân bằng papain ở điều kiện 0.0625 – 1% trong 1 – 10h. Kết quả nghiên cứu cho thấy 80% CS được chiết xuất ở điều kiện 0.025% papain trong 10h. Các hydrolysate đông khô từ khí quản sụn chứa 10.6% CS thu được 39% sau khi kết tủa protein.
Hiện nay, trên thế giới đã có rất nhiều nghiên cứu tách chiết CS từ các nguồn nguyên liệu như da của cá Labeo rohita, sụn cá mập, sụn của cá mực, sụn gà, sụn bò…Cho đến nay, tại Việt Nam vấn đề nghiên cứu thu nhận CS còn rất mới mẻ và chưa phổ biến.
Hàm luợng CS được thu nhận khác nhau từ các nguồn nguyên liệu sụn khác nhau, tuy nhiên chúng biến động trong khoảng 10.0 – 28.3%, phần lớn chứa các loại CS4 và CS6.
Phân tử CS rất đa dạng và phức tạp, cho nên mới chỉ tổng hợp được các mạch oligosaccharide ngắn có trình tự giống một đoạn mạch CS như một số CS tetrasaccharide (4 gốc đường đơn) có khả năng kích thích sự phát triển và phân hoá của neron thần kinh, còn phân tử disaccharide thì không có tác dụng trên. Vì vậy, CS được tách chiết từ các nguồn nguyên liệu tự nhiên.
CHƯƠNG II. VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. NGUYÊN VẬT LIỆU
Bột sụn cá mập
Sụn cá mập khô được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn và bảo quản ở 40C trong suốt thời gian làm đề tài.
Hình 2.1. Hình ảnh về sụn cá mập
Enzyme neutrase: Neutrase là một protease có nguồn gốc từ vi khuẩn
B.amyloliquefaciens. Neutrase do hãng Novozyme – Đan Mạch cung cấp. Neutrase
dạng bột có đặc tính: hoạt độ 5000UI/g, nhiệt độ thích hợp 40 – 600C, pH thích hợp 5.5 – 7.5.
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU [4], [11] 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học 2.2.1. Phương pháp phân tích hóa học
+ Xác định độ ẩm: Độ ẩm được xác định bằng phương pháp sấy đến trọng
+ Xác định hàm lượng nitơ tổng số: Xác định hàm lượng nitơ tổng số bằng
phương pháp Kjeldahl theo TCVN 3705 – 1990.
+ Xác định hàm lượng khoáng: Xác định hàm lượng khoáng của sụn cá mập
bằng phương pháp nung ở 6000C.
2.2.2. Xác định hoạt độ enzyme neutrase theo phương pháp Anson a. Nguyên tắc a. Nguyên tắc
Dùng protein casein hoặc Hb (Hemoglobin) làm cơ chất xác định hoạt độ thủy phân protein của enzyme protease trên cơ sở định lượng sản phẩm được tạo thành trong phản ứng bằng phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau. Dựa vào đồ thị chuẩn tyrosine để định lượng tương ứng với lượng sản phẩm tạo thành dưới tác dụng của enzyme protease.
Hoạt độ enzyme của chế phẩm được biểu diễn bằng “Đơn vị hoạt độ proteolytic”.Một đơn vị hoạt độ proteolytic (PU) là lượng enzyme mà trong một phút ở 300C có khả năng thủy phân protein tạo thành các sản phẩm hòa tan trong acid tricloacetic cho phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau tương ứng với một µmol tyrosine.
Hoạt độ riêng của chế phẩm được biểu diễn bằng số đơn vị hoạt độ proteolytic trên 1mg protein của chế phẩm (số PU/mg protein).
b. Hóa chất và thiết bị
Dung dịch casein 2%: Hòa tan 2g casein vào 90 ml đệm Britton và Robinson pH 7.2. Nếu pH dung dịch thấp hơn 7.2 thì dùng NaOH 1N để điều chỉnh, dẫn đệm đến 100ml.
Thuốc thử Folin – Ciocalteau được pha loãng bằng nước cất theo tỷ lệ 1/5 trước khi sử dụng. Dung dịch chuẩn tyrosine 1µmol/ml, Na2CO3 0.4M, acid tricloacetic 0.4M.
c. Cách tiến hành
Chuẩn bị hai ống nghiệm sạch, ống thí nghiệm và ống đối chứng.
Ống thí nghiệm: cho vào 1ml dung dịch cơ chất đã đạt được 300C và 1ml dung dịch enzyme protease đã đạt tới 300C giữ đúng 10 phút ở 300C sau đó cho ngay vào 5ml dung dịch acid tricloacetic 0.4M lắc đều và giữ 30 phút ở 300C. Lọc và lấy 1ml dịch lọc cho vào ống nghiệm khác để làm phản ứng màu với thuốc thử Folin – Ciocalteau như sau: lấy một ống nghiệm sạch, thêm vào 5ml dung dịch Na2CO3 0.4M lắc đều và cho thêm 1ml thuốc thử Folin đã được pha loãng 5 lần lắc đều, giữ 20 – 30 phút ở nhiệt độ phòng. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ống đối chứng: sau khi cho 1ml dung dịch enzyme cho ngay vào 5ml dung
dịch acid tricloacetic 0.4M rồi cho vào 1ml dung dịch cơ chất. Các bước tiếp theo tiến hành giống như ống nghiệm. Sau đó so màu trên máy quang điện kế với kính lọc màu đỏ ở bước sóng 660nm.
d. Tính kết quả
Lấy hiệu số mật độ quang đọc trên thiết máy của mẫu thí nghiệm và mẫu đối chứng và mẫu đối chứng. Dựa vào đồ thì chuẩn tyrosine tính lượng tyrosine tương ứng.
Hoạt độ protease tính bằng công thức:
𝑃𝑈/𝑚𝑙 =µmol/ml x 7 10 Trong đó:
7: Tỷ lệ thể tích của hỗn hợp phản ứng với dung dịch enzyme (1ml dung dịch cơ chất cộng 1 ml dung dịch enzyme cộng 5ml dương dịch caid tricloacteic).
2.2.3. Định lượng Chondroitin sulfate theo phương pháp sử dụng xanh methylen
a. Nguyên tắc
Xanh methylen là một loại thuốc nhuộm cation khi tương tác với chondroitin sulphat sẽ làm giảm độ hấp thụ của xanh methylen. Việc giảm sự hấp thụ tỷ lệ thuận với nồng độ của chondroitin sulphat có trong dung dịch. Sự thay đổi độ hấp thụ là do CS đã tương tác với phân tử màu xanh methylen.
b. Cách tiến hành
Chuẩn bị hóa chất:
- Pha xanh methylen: Cân chính xác 15 mg xanh methylen, hòa tan trong 75 ml nước cất và định mức lên 100 ml trong bình định mức 100 ml lắc đều trong 5 phút. Sau đó, chuyển 25 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến 100 ml. Thu được dịch xanh methylene có nồng độ 37.5 µg/ml.
- Chuẩn bị dung dịch CS chuẩn: Cân chính xác 100 mg CS chuẩn 92.42%, hòa tan trong nước cất và định mức lên 100 ml. Sau đó, chuyển 5 ml dịch trên vào bình định mức 100 ml định mức lên 100 ml và lắc đều. Thu được dịch CS chuẩn có nồng độ 50 µg/ml.
- Chuẩn bị mẫu kiểm tra hàm lượng CS: Dịch thu được sau thủy phân, lấy 5ml chuyển vào bình định mức 100 ml và định mức đến 100ml.
Cách tiến hành:
Chuẩn bị 3 bình định mức 50 ml, gồm mẫu trống, mẫu chuẩn và mẫu kiểm tra hàm lượng CS. Cho vào mỗi bình 10 ml xanh methylen, thêm 2 ml dịch thủy phân vào mẫu kiểm tra hàm lượng CS, 2 ml dung dịch CS chuẩn vào mẫu chuẩn và mẫu trống là 2 ml nước cất. Sau đó, định mức lên 50 ml, lắc đều trong vòng 30 phút và đo ở bước sóng 664nm.
c. Tính kết quả
Công thức tính hàm lượng CS khảo nghiệm: 𝐶𝑆 = 𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑡
𝑂𝐷𝑏 − 𝑂𝐷𝑠𝑡× 𝐺𝑡× 𝑃 Trong đó:
- 𝑂𝐷𝑏: Độ hấp thụ của mẫu trống.
- 𝑂𝐷𝑡: Độ hấp thụ của mẫu kiểm tra hàm lượng CS.
- 𝑂𝐷𝑠𝑡: Độ hấp thụ của mẫu CS chuẩn.
- 𝐺𝑡: Khối lượng CS chuẩn sử dụng (mg)
- P: Phần trăm độ tinh khiết của chondroitin sulphat tiêu chuẩn (92.42%)
- CS: Hàm lượng CS trong mẫu (mg/10g mẫu)
2.2.4. Phương pháp bố trí thí nghiệm
2.2.4.1. Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Quy trình dự kiến thu nhận Chondroitin sulphat
Quá trình tham khảo tài liệu, đề tài dự kiến qui trình thu nhận Chondroitin sulfate từ sụn cá mập được trình bày ở hình 2.2. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hình 2.2. Quy trình dự kiến thu nhận chondroitin sulphat từ sụn cá mập
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân
Bất hoạt enzyme
Kết tủa protein hòa tan bằngTCA
Ly tâm
Kết tủa CS thô bằng ethanol
Sấy khô
Chondroitin sulfate thô Ly tâm
Dịch thủy phân
Ly tâm Dịch chứa CS thô
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi
thu mua được vận chuyển về phòng thí nghiệm CNCB tiến hành xử lý sụn. Sụn cá mập sau khi thu nhận được tách bỏ thịt, làm khô để sử dụng làm nguyên liệu thủy phân thu CS. Trước khi thủy phân, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với tốc độ 25000 vòng/phút trong thời gian 30 phút.
+ Xử lý: Sụn cá được xử lý bằng cách đun nóng ở nhiệt độ 1000C trong 1 giờ.
+ Thủy phân: Sử dụng enzyme Neutrase để thủy phân các mối liên kết peptit
để giải phóng CS. Vì CS thường gắn với protein bằng liên kết o – glycosid tạo thành phức proteoglycan.
+ Bất hoạt enzyme: Kết thúc quá trình thủy phân, tiến hành bất hoạt enzyme
bằng cách đun nóng ở 900C trong thời gian 15 phút.
+ Ly tâm: Loại bỏ phần bã, ly tâm 6000 v/phút để thu dịch thủy phân. + Kết tủa protein hòa tan: Sử dụng TCA để kết tủa hoàn toàn protein hòa
tan trong dung dịch.
+ Ly tâm: Tiến hành ly tâm để loại bỏ kết tủa protein hòa tan trong dung dịch
và thu dịch chứa CS.
+ Kết tủa CS thô: CS không hòa tan trong ethanol nên sử dụng ethanol để
tủa CS. Sau đó, tiến hành ly tâm để thu chế phẩm CS.
+ Sấy khô: Sau khi tủa dịch bằng ethanol thu được CS đem đi sấy lạnh để thu
được CS thô.
2.2.4.2. Bố trí thí nghiệm xác định chế độ xử lý sụn cá mập
Từ tham khảo các nghiên cứu trước đây, đồ án thử nghiệm xử lý sụn cá theo quy trình trình bày ở hình 2.3. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Thuyết minh quy trình
+ Sụn cá mập khô: được thu mua tại cảng cá Hòn Rớ - Nha Trang. Sau khi thu
+ Tách thịt: Quá trình tách sụn cá mập được tiến hành theo hai chế độ xử lý sụn khác nhau:
- Chế độ 1: Tiến hành đun sụn ở 1000C trong 30 phút. Sau đó, làm nguội và tách bỏ thịt cá.
- Chế độ 2: Sụn cá được ngâm trong nước trong 30 phút, không đun và được tách bỏ thịt.
+ Xay nhỏ: Sau khi tách bỏ thịt, sụn cá mập được xay nhỏ bằng máy xay với
tốc độ 25000 vòng/phút trong thời gian 20 phút.
+ Sấy khô: Sấy ở nhiệt độ 700C và bảo quản ở 40C suốt thời gian làm đề tài. + Đánh giá: Sụn cá mập sau khi sấy khô, tiến hành đánh giá cảm quan để chọn
được chế độ xử lý sụn tốt nhất. Sau đó, tiến hành phân tích hóa học sụn cá.
Hình 2.3. Sơ đồ xử lý sụn cá mập Sụn cá mập Tách thịt theo chế độ khác nhau Xay nhỏ Sấy khô Đánh giá Chọn chế độ xử lý sụn
Đun sụn ở 1000C trong 30 phút Không đun, ngâm nước 30 phút
2.2.4.3. Xác định các thông số của quy trình
Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Hình 2.4. Xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân ở điều kiện nhiệt độ 450C trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme bổ sung 0.1%, chỉ thay đổi thay đổi pH ở các mức: pH tự nhiên; 6; 6.5; 7; 7.5. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó,
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở pH khác nhau
5.5 6.5 7 7.5
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân Tự nhiên
tiến hành ly tâm ở 6000v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.4 xác định pH thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.5. Xác định tỷ lệ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân
Thuyết minh sơ đồ (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở tỷ lệ enzyme khác nhau (%)
0 0.1 0.3 0.4
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân 0.2
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích và ở nhiệt độ 450C trong thời gian 2h với tỷ lệ enzyme bổ sung khác nhau, mẫu 1: mẫu đối chứng 0% E, mẫu 2: bổ sung 0.1% E, mẫu 3: 0.2% E, mẫu 4: 0.3% E, mẫu 5: 0.4% E. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.5 xác định nồng độ enzyme thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Hình 2.6. Xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân
Sụn cá mập
Xử lý
Thủy phân ở nhiệt độ khác nhau (0C)
40 45 55 60
Bất hoạt hoạt enzyme
Xác định hàm lượng CS theo phương pháp xanh methylen Ly tâm
Dịch thủy phân 50
Thuyết minh sơ đồ
Xử lý sụn cá mập bằng cách đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH tối thích trong thời gian 2h và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân ở 400C, mẫu 2: 450C, mẫu 3: 500C, mẫu 4: 550C, mẫu 5: 600C. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 vòng/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Ta có sơ đồ bố trí thí nghiệm 2.6 xác định nhiệt độ thích hợp cho quá trình thủy phân.
Xác định thời gian thích hợp cho quá trình thủy phân
Xử lý sụn cá mập bằng phương pháp đun nóng ở 1000C trong thời gian 1h với 5 mẫu, mỗi mẫu 10g sụn và tỷ lệ nước so với nguyên liệu 10%.
Tiến hành quá trình thủy phân sụn cá mập bằng enzyme neutrase ở pH, nhiệt độ và tỷ lệ enzyme bổ sung thích hợp. Trong đó, mẫu 1: thủy phân trong 2h, mẫu 2: 3h, mẫu 3: 4h, mẫu 4: 5h, mẫu 5: 6h. Kết thúc quá trình thủy phân, bất hoạt enzyme ở 900C trong 15 phút. Sau đó, tiến hành ly tâm 6000 v/phút để thu dịch có chứa CS và xác định hàm lượng CS theo phương pháp Methylene Blue. Tiến hành theo sơ đồ bố