Tác dụng chống viêm cấp của dược liệu được thử bằng mô hình gây
phù bằng theo Winter [4], [51]. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô chứng: dùng dung môi.
- Lô đối chiếu: dùng thuốc đối chiếu.
- Lô thử: dùng thuốc nghiên cứu.
Chuột được uống dung môi hoặc thuốc nghiên cứu hàng ngày vào một
giờ nhất định, trong vòng 7 ngày trước khi làm thực nghiệm. Thuốc đối chiếu chỉ dùng vào ngày làm thực nghiệm.
Ngày thứ 7, sau khi uống thuốc đo thể tích bàn chân sau phải chuột,
ngay sau đó tiêm tác nhân gây viêm là dung dịch carrageenin 1% trong nước muối sinh lý (0,05ml/ chuột) vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột.
Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột vào thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ sau khi tiêm .
Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở Hình 2.1
Uống thuốc hàng ngày Nhịn ăn 90 phút - Gây viêm - Uống thuốc V0 Ngày làm thực nghiệm V1 V3 V5 V7
Hình 2.1. Qui trình thí nghiệm tác dụng chống viêm
Chỉ tiêu theo dõi
+ Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột.
+ Mức độ phù bàn chân sau phải chuột được tính theo công thức: V (%) = Vo Vo Vt 100 Trong đó: 18
- V: Mức độ phù chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. - Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
- Vt: Thể tích chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. + % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng được tính theo công thức:
I (%) = Vc Vt Vc Δ Δ Δ 100 Trong đó:
- I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng. - Vc: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng. - Vt: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô thử.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1. Về tên khoa học của loài
- Tiến hành phân tích, nghiên cứu đặc điểm hình thái của lá, thân rễ,
thân khí sinh, cấu tạo giải phẫu của hoa, quả và hạt của các mẫu do Phạm Quốc Tuấn, Nguyễn Đức Hùng thu thập ở các sườn núi, khe suối tại xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào các ngày 11/11/2010; 12/09/2011. Đối chiếu với khóa phân loại thực vật, hình vẽ của chi Astilbe Buchanan- Hamilton ex D. Don, Prodr. Fl. Nepal. 210. 1825 trong tài liệu [1] và các thực vật chí: Ấn Anh, Trung Quốc, Pakistan [24], [52]; mô tả thực vật, hình vẽ của
Astilbe rivularis trong Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [6].
- Đối chiếu các tiêu bản số: K000674066, K000674067, K000674068 có tên khoa học Astilbe rivularis lưu trữ trong website của KEW royal botanic gardens [57].
Chúng tôi khẳng định các mẫu tiêu bản do chúng tôi thu thập thuộc loài
Astibe rivularis Buch.-Ham. ex D. Don, họ Thường sơn (Saxifragaceae).
- Kết quả nghiên cứu này được giám định lại bởi TS. Dương Đức
Huyến, ThS. Đỗ Văn Hải – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với tiêu bản số Phạm Quốc Tuấn 001 22/11/2010 và CN. Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu với tiêu bản số Phamquoctuan01 ngày 21/09/2011.
3.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây thảo có thân rễ, đường kính 0,5-3 cm, có rễ nhỏ và nhiều rễ nhủ tơ,
sống lâu năm, thân khí sinh mang cụm hoa thẳng đứng cao 0,5 – 2,2 m, có
rãnh dọc khi khô, đôi khi có màu tím, mang lông dài màu nâu. Lá kép mọc ở thân rễ hoặc thân khí sinh, chụm 3 phức hợp hoặc 2-3 lần lông chim (ít khi 4 lần lông chim), mỗi nhánh lá kép thường mang 3-5 lá chét, hiếm khi 7 lá chét; lá kép có bẹ, mép bẹ lá có lông dài màu nâu đối với lá kép mọc ở thân khí
sinh hoặc mặt trước của bẹ lá mọc ở thân rễ có một lớp lông dài màu nâu ôm vào thân rễ; gốc cuống chung và gốc các cuống lá chét nhiều lông dài màu nâu mọc thành cụm (Hình 3.1).
A B A B D D C E
A.Thân khí sinh, B. Thân rễ mang lá, C. Thân rễ mang các rễ nhỏ, D.
Bẹ lá kép ôm vào thân rễ, E. Bẹ lá kép ôm vào thân khí sinh
Hình 3.1. Thân rễ và thân khí sinh mang lá kép
Lá chét có cuống rất ngắn hoặc dài 0,3-4 cm; riêng cuống lá chét ngọn dài đến 9 cm; phiến lá chét nguyên, đôi khi phân thùy; phiến lá hình trứng,
trứng ngược hoặc hình thoi – elip ở lá ngọn, hình trứng ở lá bên; kích thước
3,7-14,6 cm x 2,0-11,0 cm, có nhiều lông dài màu nâu ở mặt dưới và có nhiều lông tuyến dọc theo các gân; gốc lá cụt, hình tim, hình tim lệch, lệch, tròn đến hình nêm; mép lá có răng nhọn hai lần, không đều; ngọn lá nhọn thắt lại thành đuôi dài; hệ gân bên hình lông chim 7-8 đôi.
Chùy hoa dài 13-50 cm, có nhiều nhánh, các nhánh tận cùng dài từ 1 – 20 cm, có nhiều lông tuyến xoăn màu nâu; ở kẽ có lá bắc mỏng như màng, hình tam giác hẹp, kích thước 1,1-1,8 x 0,2-0,6 mm, có nhiều lông màu nâu, mép nguyên hoặc có răng nhọn (Hình 3.2).
B
A
C
A. Cụm hoa; B và C. Một phần cụm hoa
Hình 3.2. Cụm hoa
Hoa có 3 lá bắc; cuống hoa dài 0,8-1,8mm, có nhiều lông màu nâu. Đài
gồm 4-5 lá đài màu xanh hình trứng hoặc hình bầu dục đến tròn dài, kích
thước 1,2-1,8 x 0,8-1mm dạng gần như màng, hơi lồi ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên, không có lông, 1 gân, dính liền với bầu ở gốc, không rụng; không
cánh hoa. Nhị hoa 4 - 5 đối diện với đài, chỉ nhị dài 1,5 mm, bao phấn 2 ô,
đính gốc. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn hình bầu dục hợp lại ở gốc, mỗi lá noãn kéo dài thành một vòi nhụy ngắn 1 mm, núm nhụy hình đầu, bầu trên 2 mm, đính noãn bên (Hình 3.3).
A B C
D E F
A.Hoa; B. Lá đài và nhị; C. Các loại lá bắc, D. Bầu;
E. Bầu cắt ngang; F. Tách dọc một lá
Hình 3.3. Cấu tạo hoa
Quả gồm 2 đại, dài khoảng 2,5 mm. Hạt nhỏ, nhiều, màu nâu, dài khoảng 2,0-2,5 mm, có cánh ở hai đầu vì vỏ hạt kéo dài, thuôn, có nếp nhăn hoặc hơi nhăn, bóng (Hình 3.4). Ra hoa, kết quả tháng 9 – 12.
A B C D
A. Cụm quả; B. Quả chưa mở; C. Quả đã mở; D. Hạt
Hình 3.4. Quả và hạt 3.1.3. Cấu tạo giải phẫu
3.1.3.1. Cấu tạo lá
a) Cuống lá
Cấu tạo giống thân cây khí sinh nhưng đối xứng qua mặt phẳng gồm:
Mô mềm vỏ ngoài, mô mềm vỏ trong, trong tế bào mô mềm có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Vòng mô cứng xếp thành một vòng uốn lượn. Một vòng các bó li be-gỗ. Mỗi bó thường có một bó gỗ và 1-3 bó li be
1 2 3 4 5 6 7 A B C 26
C D E
[[
1.Biểu bì; 2.Mô mềm vỏ; 3. Mô cứng; 4. Mô mềm ruột cuống lá; 5. Li be; 6. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat
A. Vi phẫu cuống lá chét cắt; B. Biểu bì, mô mềm vỏ, calci oxalat; C. Mô cứng, libe, gỗ; D. Gỗ; E. Mô mềm
Hình 3.5. Vi phẫu cuống lá chét cắt ngang
b) Phiến lá
Lá chét cắt ngang có cấu tạo giống với cuống lá gồm có biểu bì, mô mềm vỏ, mô mềm ruột, vòng mô cứng và vòng bó li be-gỗ nhưng vòng mô cứng và vòng các bó li be-gỗ bị đứt đoạn ở phía trên của gân giữa, trong các tế bào mô mềm thường có tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
2 3 4 5 6 7 A B C 27
D E
1. Biểu bì; 2. Mô mềm vỏ; 3. Mô cứng; 4. Mô mềm trong; 5. Li be; 6. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat. A. Vi phẫu lá chét cắt ngang; B. Biểu bì, mô mềm vỏ;
C. Mô mềm vỏ chứa calci oxalat; D. Libe, gỗ, mô mềm trong; E. Mô mềm
Hình 3.6. Vi phẫu lá chét
3.1.3.2. Cấu tạo thân khí sinh
Cấu tạo giống cuống lá gồm: biểu bì; mô mềm vỏ; vòng mô cứng gần như liên tục; các bó li be-gỗ xếp thành vòng uốn lượn gồm 24-30 bó, cứ một bó to ở chỗ lồi của thân, xếp ở phía ngoài xen kẽ một bó nhỏ xếp ở trong, giữa li be và gỗ là thượng tầng. Giữa các bó li be-gỗ là tia ruột, các tia này có thể đi từ trong mô mềm ruột đến mô mềm vỏ, nhưng phần lớn bị chặn bởi mô cứng. Trong mô mềm vỏ và mô mềm ruột có tinh thể calci oxalat hình cầu gai. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 28
C D
1. Biểu bì; 2. Tinh thể calci oxalat; 3. Mô mềm vỏ; 4. Mô cứng; 5. Li be; 6. thượng tầng; 7. Tia ruột; 8. Gỗ; 9. Mô mềm ruột
A. Vi phẫu rễ cắt ngang; B. Biểu bì, mô mềm vỏ chứa tinh thể calci oxalat; C. Tế bào mô mềm vỏ, tinh thể calci oxalat; D. Mô cứng, libe, gỗ
Hình 3.7. Vi phẫu thân khí sinh
3.1.3.3. Cấu tạo thân rễ
Ngoài cùng là bần gồm 2-3 lớp tế bào, mô mềm vỏ có chứa tinh thể
calci oxalat hình cầu gai, các bó li be- gỗ, mỗi bó có cung mô cứng ở phía
ngoài và bó li be-gỗ xếp chồng ở trong.
1 2 3 4 5 6 7 A B C D
1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Tinh thể calci oxalat; 4. Mô cứng; 5. Li be; 6. Gỗ cấp 1; 7. Mô mềm ruột
A. Vi phẫu thân rễ cắt ngang; B. Bần, mô mềm vỏ có tế bào chứa tinh thể calci oxalat; C. Bần, mô mềm vỏ; D. Tế bào mô mềm vỏ, tinh thể
calci oxalat; E. Bó libe – gỗ
Hình 3.8. Vi phẫu thân rễ
3.1.3.4. Cấu tạo rễ
Cắt ngang qua rễ thấy từ ngoài vào trong gồm: Bần: gồm nhiều lớp tế bào bần; Mô mềm vỏ trong đó có nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai; Li
be cấp 2 gồm 17-22 bó ở phía ngoài có 3-9 tầng sợi xen kẽ với mô mềm li be,
phía trong là một đám lớn các tế bào mô mềm li be; Tầng phát sinh li be-gỗ;
Gỗ cấp 2: trong đó có nhiều mạch gỗ, sợi gỗ và mô mềm gỗ; Giữa các bó li be-gỗ là tia ruột, tia ruột có thể vào sâu đến gần tâm hoặc chỉ có ở phần li be.
1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Tinh thể ci oxalat; 4. Sợi; 5. Li be cấp 2;
3.2. NGHIÊN CỨU THÀN
phụ
3.2.1.1. Định tính glycosid tim [2]
* Chiết xuất
ược liệu đã tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 250 ml + 100 ml cồn
+ 3 ml chì acetat 30%, khuấy đều.
c đầu tiên vào ống nghiệm, thêm một giọt chì acetat, nếu xuất hiện tủa thì ngừng lọc, thêm
cal
6. Tầng phát sinh li be-gỗ; 7. Tia ruột; 8. Gỗ cấp 2
Hình 3.9. Vi phẫu rễ H PHẦN HÓA HỌC 3.2.1. Định tính các nhóm chất trong lá và rễ Lạc tân - 10 g d 25o/ngâm 24h. - Gạn dịch chiết
- Lọc qua giấy lọc gấp nếp. Nhỏ vài giọt dịch lọ
khoản
ạn lớp cloroform vào cốc có mỏ
c hơi trên nồi cách thủy cho đến khô. Cắn thu được làm các ph
id (phản ứng Liebermann) [2]
ứa cắn glycosid tim + 1 ml anhydric acetic, lắc
ất lỏng trong ống. Ở giữa mặt tiếp xúc giữa 2 lớp chất lỏng sẽ xuấ
ắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90o. Lắc đều
cho tan h ốc thử Balject mới pha không thấy xuất
hiện đ
a cắn glycosid tim 0,5 ml ethanol 90o. Lắc
đề giỏ thuốc thử natri nitroprussiat 0,5% và 2 giọt
g 1 ml chì acetat, khuấy đều, lọc lại và cứ tiếp tục thử đến khi dịch lọc không còn tủa với chì acetat là lúc lượng chì đã đủ.
- Chuyển toàn bộ dịch lọc vào một bình gạn 100 ml. Chiết glycosid tim bằng cách lắc với cloroform 2 lần, mỗi lần 8 ml. G
đã sấy khô. Gộp các dịch chiết cloroform. Nếu dịch chiết còn lẫn nước thì lọc lại qua bông.
- Chia đều dịch chiết vào 6 ống nghiệm đã được sấy khô. Đặt các ống nghiệm lên giá và bố
ản ứng định tính.
* Các phản ứng định tính
+ Phản ứng khung stero
+ Cho ống nghiệm ch cho tan hết cắn.
+ Nghiêng ống 45o, cho từ từ theo thành ống 0,5 ml acid sulfuric đặc,
tránh xáo trộn ch
t hiện một vòng màu tím đỏ. Lớp chất lỏng phía dưới có màu hồng, lớp trên màu xanh lá → Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận được trong lá có khung steroid
+ Phản ứng vòng lacton 5 cạnh
Phản ứng Balject
Cho vào ống nghiệm chứa c ết cắn. Nhỏ từng giọt thu ỏ cam → Phản ứng âm tính.
Phản ứng Legal
Cho vào ống nghiệm có chứ u cho tan hết cắn. Nhỏ từng
dung
3.2.1.2. Định tính tanin [2]
* Chiết xuất
ỏ cho vào bình nón dung tích 50 ml + 20 un sôi khoảng 2 phút. Để nguội, lọc.
* Các
ch FeCl3 5% (TT) → xuất
đen hoặc nâu nhạt → Phản ứng dương tính.
tính.
3.2.1.3
o. Ngâm khoảng 2 h (hoặc đun sôi cách
n giấy lọc, để khô rồi hơ lên miệng lọ NH3 đặc,
t chuyển sang màu vàng → Phản ứng dương tính.
dịch NaOH 10%. Lắc đều không thấy xuất hiện màu đỏ cam → Phản ứng âm tính.
Nhận xét: Sơ bộ kết luận trong lá không có vòng lacton 5 cạnh.
Lấy 1,0 g dược liệu đã tán nh ml nước cất, đ
phản ứng định tính
+ Ống 1: lấy 2 ml dịch lọc + 2 giọt dung dị hiện màu hoặc tủa màu xanh
+ Ống 2: lấy 2 ml dịch lọc + 2 giọt chì acetat 10% (TT) → xuất hiện tủa bông Phản ứng dương tính.
+ Ống 3: lấy 2 ml dịch lọc + 5 giọt dung dịch gelatin 1% → xuất hiện tủa bông trắng → Phản ứng dương
. Định tính flavonoid [2], [22]
* Chiết xuất
5g bột dược liệu + 50 ml cồn 90 thủy trong 5 phút).
Lọc qua giấy lọc (nếu là bột) hoặc qua bông nếu là dược liệu thái nhỏ.
* Các phản ứng định tính
+ Phản ứng với hơi NH3
Nhỏ giọt dịch chiết lê quan sát sự thay đổi của vết chấ
+ Phản ứng dung dịch kiềm loãng
Cho dịch chiết vào ông nghiệm + vài giọt dung dịch kiềm loãng (KOH, NaOH
nghiệm + ít bột magnesi kim loại, rồi nhỏ từ từ vài giọ
g nghiệm + vài giọt FeCl3 xuất hiện tủa màu xanh đ
ệm, kiềm hóa bằng dung dịch kiềm (NaOH
t luận trong lá chứa flavonoid
3.2.1.4
ược liệu + 10 ml acid sulfuric 1N, đun đến sôi, để nguội. Lọc vào bì
ml dung dịch H2SO4 1N (hoặc HCl 1N), chia dịch
hòa ta
thử Mayer không thấy chuyển sang màu trắng đến
vàng →
…), lắc dung dịch chuyển màu vàng → Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng Shinoda
Cho dịch chiết vào ông
t HCl đậm đặc từ màu vàng sang màu đỏ → Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng với FeCl3
Cho dịch chiết vào ốn en → Phản ứng dương tính.
+ Phản ứng diazo hóa
Cho dịch chiết vào ống nghi
, KOH, Na2CO3…). Thêm vài giọt thuốc thử diazoni (TT), lắc đều (có
thể làm nóng trên nồi cách thủy trong vài phút dung dịch chuyển sang màu đỏ → Phản ứng dương tính.
Nhận xét: Sơ bộ kế
. Định tính alkaloid [2], [20]
* Chiết xuất
1g bột d
nh gạn, kiềm hóa bằng dung dịch NH4OH đặc. Sau đó lắc với ether
(hoặc cloroform) 2-3 lần, mỗi lần 5 ml. Gạn lấy dung môi hữu cơ rồi bốc hơi cách thủy đến khô thu được cắn alkaloid base.
* Các phản ứng định tính
Hòa tan cắn bằng 2-3 n thành 3 ống nghiệm
+ Ống nghiệm 1:
Cho 1-2 giọt thuốc Phản ứng âm tính
+ Ống nghiệm 2:
Cho 1-2 giọt thuốc thử Bouchardat không thấy tủa màu nâu đến đỏ nâu →
ử Dragendorff không thấy xuất hiện màu vàng cam đ
ong lá không có alkaloid 3.2.1.5
l acid sulfuric 1N. Đun trực tiếp đến sôi. Để nguội,
dược liệu nên một nắp chai bằng nhôm. Hơ nhẹ trên đèn cồn