Trong thử nghiệm này, gây phù bàn chân sau của chuột bằng cách tiêm dưới da ở bề mặt gan bàn chân sau của chuột 0,1 ml dịch treo 0,8% carrageenan, pha trong nước cất hay dung dịch NaCl đẳng trương. Cách pha dung dịch treo: cho carrageenan vào một cối nhỏ, cho dần nước vào và nghiền bằng chầy cho phân tán đều. Để nửa giờ cho phồng lên rồi hãy dùng, chi pha trước khi dùng, vì nếu để lâu carrageenan sẽ lắng xuống.
Trong quá trình viêm gây bởi carrageenan, mức độ viêm tối đa ở
khoảng thời gian 3-4 giờ. Nên để đánh giá mức độ viêm, do thể tích bàn chân
tới khớp cổ chân trước và 3 giờ sau khi tiêm carrageenan. Trừ một số đặc
điểm nêu trên, thử nghiệm trên phù chân chuột gây bằng carrageenan được tiến hành tương tự như phù chân chuột gây bằng kaolin.
Carrageenan (viscarin) là chất sulfopolygalactosid, chiết xuất từ
Chondrus crispus, có tác dụng gây viêm.
CHƯƠNG 2. ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1. ĐỐI TƯỢNG NGHIÊN CỨU
2.1.1. Nguyên liệu
Đối tượng nghiên cứu là bộ phận trên mặt đất của cây Lạc tân phụ (A.rivularis) do Phạm Quốc Tuấn, Phương Thiện Thương, Nguyễn Đức Hùng thu thập ở các sườn núi, khe suối tại xã Bản Khoang, huyện Sapa, tỉnh Lào Cai vào tháng 8,11,12/2010, tháng 1,7,9/2011. Mẫu cây được giám định tên
khoa học bởi TS. Dương Đức Huyến, ThS. Đỗ Văn Hải – Viện Sinh thái và
Tài nguyên sinh vật và CN. Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu. Các mẫu tiêu bản mẫu có hoa, quả được lưu trữ tại Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật và Viện Dược liệu, số hiệu mẫu là Phamquoctuan02 ngày 21/09/2011.
Thử độc tính cấp và tác dụng chống viêm cấp bằng cao chiết toàn phần từ bộ phận trên mặt đất của cây Lạc tân phụ với hiệu suất 16,62%.
2.1.2. Hóa chất, dung môi
- Hóa chất sử dụng trong nghiên cứu đạt tiêu chuẩn phân tích theo
Dược Điển Việt Nam IV.
- Indomethacin chuẩn do Viện kiểm nghiệm cung cấp.
- Các dung môi MeOH, EtOH, Cloroform, EtOAc, n-BuOH, n-hexan…
- Sắc ký cột dùng silica gel cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm.
- TLC bản mỏng tráng sẵn pha thuận silica gel 60 F254S, pha đảo RP-18 F254 (Merk).
- Sắc ký cột pha thuận: chất nhồi cột silica gel (230-400 mesh,
Rankem-Ấn độ); sắc ký cột pha đảo chất nhồi cột YMC RP-18 (30-50 μm,
Fuji Silysia Chemical Ltd., Nhật);
- Sắc ký gel dùng loại Sephadex LH20 (Amersham Biosciences).
- Dung môi chiết suất, triển khai sắc ký cột: + MeOH và EtOH công nghiệp;
+ n-hexan, EtOAc, MeOH; + MeOH, nước cất.
2.1.3. Động vật nghiên cứu
- Động vật thử độc tính cấp: chuột nhắt trắng có trọng lượng 20-22 g, đạt tiêu chuẩn thí nghiệm do Viện Vệ sinh dịch tễ cung cấp.
- Động vật thử tác dụng chống viêm cấp: chuột cống trắng cả hai giống, trọng lượng từ 160 – 200g, khỏe mạnh do Học viện Quân Y cung cấp.
- Động vật được nuôi dưỡng theo chế độ tiêu chuẩn tại phòng nuôi động vật thí nghiệm của Viện Dược liệu và Trường Đại học Dược Hà Nội.
2.1.4. Một số thiết bị dùng trong nghiên cứu
- Máy ảnh kỹ thuật số. - Kính lúp.
- Kính hiển vi có gắn camera. - Cân phân tích Mettler Toledo. - Máy xác định điểm chảy. - Tủ ấm, tủ sấy, tủ lạnh.
- Các máy đo quang phổ tử ngoại khả kiến UV-Vis Viện Dược liệu. - Máy đo điểm chảy lần lượt được ghi trên máy: UV-1800 (Shimadzu), Gallenkamp (Sanyo) của Khoa Phân tích tiêu chuẩn Viện Dược liệu.
- Máy đo phổ hồng ngoại (IR), đo phổ khối (MS), máy đo phổ cộng
hưởng từ hạt nhân (1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, máy NMR Brucker–500
MHz tại Viện Hóa học, Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam).
2.2. PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.2.1. Phương pháp nghiên cứu thực vật
- Mẫu cây thu hái trong thời kỳ mang hoa, quả làm tiêu bản mẫu cây
khô.
- Mô tả đặc điểm thực vật bằng cách quan sát mắt thường, kính lúp, kính hiển vi. Đối chiếu với bản mô tả và khóa phân loại thực vật trong các tài liệu chuyên khảo về thực vật để xác định loài.
- So sánh đặc điểm hình thái của mẫu nghiên cứu với tiêu bản lưu trữ tại phòng tiêu bản Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật (Viện Khoa học và Kỹ thuật Việt Nam) để xác định tên khoa học.
- Mô tả giải phẫu: làm tiêu bản các bộ phận thân (thân khí sinh, thân
rễ), rễ, lá cây để phân tích đặc điểm cấu tạo. Các tiêu bản được nhuộm theo
phương pháp nhuộm kép (đỏ carmin và xanh methylen). Quan sát dưới kính hiển vi và chụp bằng máy ảnh kỹ thuật số.
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu hóa học
- Định tính các nhóm chất trong cây theo tài liệu + Bài giảng dược liệu tập I [2].
+ Thực tập dược liệu [2]. + Tài liệu [6], [29].
- Phân lập các chất theo phương pháp sắc ký cột [43].
- Nhận dạng các chất phân lập được dựa vào số liệu phổ UV, IR, MS, NMR có so sánh với dữ liệu trong thư viện phổ.
2.2.3. Phương pháp thử độc tính cấp
Thử độc tính cấp theo phương pháp ghi trong tài liệu [3], [5]. Tính LD50 theo phương pháp BEHRENS (1929) [5].
2.2.4.Phương pháp đánh giá tác dụng chống viêm cấp
Tác dụng chống viêm cấp của dược liệu được thử bằng mô hình gây
phù bằng theo Winter [4], [51]. Thí nghiệm được tiến hành như sau: Chuột cống trắng được chia ngẫu nhiên thành các lô:
- Lô chứng: dùng dung môi.
- Lô đối chiếu: dùng thuốc đối chiếu.
- Lô thử: dùng thuốc nghiên cứu.
Chuột được uống dung môi hoặc thuốc nghiên cứu hàng ngày vào một
giờ nhất định, trong vòng 7 ngày trước khi làm thực nghiệm. Thuốc đối chiếu chỉ dùng vào ngày làm thực nghiệm.
Ngày thứ 7, sau khi uống thuốc đo thể tích bàn chân sau phải chuột,
ngay sau đó tiêm tác nhân gây viêm là dung dịch carrageenin 1% trong nước muối sinh lý (0,05ml/ chuột) vào dưới da gan bàn chân sau phải của chuột.
Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột vào thời điểm 1 giờ, 3 giờ, 5 giờ, 7 giờ sau khi tiêm .
Quy trình tiến hành thí nghiệm được mô tả ở Hình 2.1
Uống thuốc hàng ngày Nhịn ăn 90 phút - Gây viêm - Uống thuốc V0 Ngày làm thực nghiệm V1 V3 V5 V7
Hình 2.1. Qui trình thí nghiệm tác dụng chống viêm
Chỉ tiêu theo dõi
+ Đo thể tích bàn chân sau phải của chuột.
+ Mức độ phù bàn chân sau phải chuột được tính theo công thức: V (%) = Vo Vo Vt 100 Trong đó: 18
- V: Mức độ phù chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. - Vo: Thể tích chân chuột trước khi gây viêm.
- Vt: Thể tích chân chuột tại thời điểm t giờ sau khi gây viêm. + % ức chế phù của các lô thử so với lô chứng được tính theo công thức:
I (%) = Vc Vt Vc Δ Δ Δ 100 Trong đó:
- I (%): Phần trăm ức chế phù của lô thử so với lô chứng. - Vc: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô chứng. - Vt: Mức độ phù chân chuột trung bình ở lô thử.
CHƯƠNG 3. KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 3.1. NGHIÊN CỨU VỀ THỰC VẬT
3.1.1. Về tên khoa học của loài
- Tiến hành phân tích, nghiên cứu đặc điểm hình thái của lá, thân rễ,
thân khí sinh, cấu tạo giải phẫu của hoa, quả và hạt của các mẫu do Phạm Quốc Tuấn, Nguyễn Đức Hùng thu thập ở các sườn núi, khe suối tại xã Bản Khoang, huyện Sa Pa, tỉnh Lào Cai vào các ngày 11/11/2010; 12/09/2011. Đối chiếu với khóa phân loại thực vật, hình vẽ của chi Astilbe Buchanan- Hamilton ex D. Don, Prodr. Fl. Nepal. 210. 1825 trong tài liệu [1] và các thực vật chí: Ấn Anh, Trung Quốc, Pakistan [24], [52]; mô tả thực vật, hình vẽ của
Astilbe rivularis trong Cây cỏ Việt Nam của Phạm Hoàng Hộ [6].
- Đối chiếu các tiêu bản số: K000674066, K000674067, K000674068 có tên khoa học Astilbe rivularis lưu trữ trong website của KEW royal botanic gardens [57].
Chúng tôi khẳng định các mẫu tiêu bản do chúng tôi thu thập thuộc loài
Astibe rivularis Buch.-Ham. ex D. Don, họ Thường sơn (Saxifragaceae).
- Kết quả nghiên cứu này được giám định lại bởi TS. Dương Đức
Huyến, ThS. Đỗ Văn Hải – Viện Sinh thái và Tài nguyên sinh vật với tiêu bản số Phạm Quốc Tuấn 001 22/11/2010 và CN. Ngô Văn Trại – Viện Dược liệu với tiêu bản số Phamquoctuan01 ngày 21/09/2011.
3.1.2. Đặc điểm hình thái
Cây thảo có thân rễ, đường kính 0,5-3 cm, có rễ nhỏ và nhiều rễ nhủ tơ,
sống lâu năm, thân khí sinh mang cụm hoa thẳng đứng cao 0,5 – 2,2 m, có
rãnh dọc khi khô, đôi khi có màu tím, mang lông dài màu nâu. Lá kép mọc ở thân rễ hoặc thân khí sinh, chụm 3 phức hợp hoặc 2-3 lần lông chim (ít khi 4 lần lông chim), mỗi nhánh lá kép thường mang 3-5 lá chét, hiếm khi 7 lá chét; lá kép có bẹ, mép bẹ lá có lông dài màu nâu đối với lá kép mọc ở thân khí
sinh hoặc mặt trước của bẹ lá mọc ở thân rễ có một lớp lông dài màu nâu ôm vào thân rễ; gốc cuống chung và gốc các cuống lá chét nhiều lông dài màu nâu mọc thành cụm (Hình 3.1).
A B A B D D C E
A.Thân khí sinh, B. Thân rễ mang lá, C. Thân rễ mang các rễ nhỏ, D.
Bẹ lá kép ôm vào thân rễ, E. Bẹ lá kép ôm vào thân khí sinh
Hình 3.1. Thân rễ và thân khí sinh mang lá kép
Lá chét có cuống rất ngắn hoặc dài 0,3-4 cm; riêng cuống lá chét ngọn dài đến 9 cm; phiến lá chét nguyên, đôi khi phân thùy; phiến lá hình trứng,
trứng ngược hoặc hình thoi – elip ở lá ngọn, hình trứng ở lá bên; kích thước
3,7-14,6 cm x 2,0-11,0 cm, có nhiều lông dài màu nâu ở mặt dưới và có nhiều lông tuyến dọc theo các gân; gốc lá cụt, hình tim, hình tim lệch, lệch, tròn đến hình nêm; mép lá có răng nhọn hai lần, không đều; ngọn lá nhọn thắt lại thành đuôi dài; hệ gân bên hình lông chim 7-8 đôi.
Chùy hoa dài 13-50 cm, có nhiều nhánh, các nhánh tận cùng dài từ 1 – 20 cm, có nhiều lông tuyến xoăn màu nâu; ở kẽ có lá bắc mỏng như màng, hình tam giác hẹp, kích thước 1,1-1,8 x 0,2-0,6 mm, có nhiều lông màu nâu, mép nguyên hoặc có răng nhọn (Hình 3.2).
B
A
C
A. Cụm hoa; B và C. Một phần cụm hoa
Hình 3.2. Cụm hoa
Hoa có 3 lá bắc; cuống hoa dài 0,8-1,8mm, có nhiều lông màu nâu. Đài
gồm 4-5 lá đài màu xanh hình trứng hoặc hình bầu dục đến tròn dài, kích
thước 1,2-1,8 x 0,8-1mm dạng gần như màng, hơi lồi ở mặt dưới, hơi lõm ở mặt trên, không có lông, 1 gân, dính liền với bầu ở gốc, không rụng; không
cánh hoa. Nhị hoa 4 - 5 đối diện với đài, chỉ nhị dài 1,5 mm, bao phấn 2 ô,
đính gốc. Bộ nhụy gồm 2 lá noãn hình bầu dục hợp lại ở gốc, mỗi lá noãn kéo dài thành một vòi nhụy ngắn 1 mm, núm nhụy hình đầu, bầu trên 2 mm, đính noãn bên (Hình 3.3).
A B C
D E F
A.Hoa; B. Lá đài và nhị; C. Các loại lá bắc, D. Bầu;
E. Bầu cắt ngang; F. Tách dọc một lá
Hình 3.3. Cấu tạo hoa
Quả gồm 2 đại, dài khoảng 2,5 mm. Hạt nhỏ, nhiều, màu nâu, dài khoảng 2,0-2,5 mm, có cánh ở hai đầu vì vỏ hạt kéo dài, thuôn, có nếp nhăn hoặc hơi nhăn, bóng (Hình 3.4). Ra hoa, kết quả tháng 9 – 12.
A B C D
A. Cụm quả; B. Quả chưa mở; C. Quả đã mở; D. Hạt
Hình 3.4. Quả và hạt 3.1.3. Cấu tạo giải phẫu
3.1.3.1. Cấu tạo lá
a) Cuống lá
Cấu tạo giống thân cây khí sinh nhưng đối xứng qua mặt phẳng gồm:
Mô mềm vỏ ngoài, mô mềm vỏ trong, trong tế bào mô mềm có chứa tinh thể calci oxalat hình cầu gai. Vòng mô cứng xếp thành một vòng uốn lượn. Một vòng các bó li be-gỗ. Mỗi bó thường có một bó gỗ và 1-3 bó li be
1 2 3 4 5 6 7 A B C 26
C D E
[[
1.Biểu bì; 2.Mô mềm vỏ; 3. Mô cứng; 4. Mô mềm ruột cuống lá; 5. Li be; 6. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat
A. Vi phẫu cuống lá chét cắt; B. Biểu bì, mô mềm vỏ, calci oxalat; C. Mô cứng, libe, gỗ; D. Gỗ; E. Mô mềm
Hình 3.5. Vi phẫu cuống lá chét cắt ngang
b) Phiến lá
Lá chét cắt ngang có cấu tạo giống với cuống lá gồm có biểu bì, mô mềm vỏ, mô mềm ruột, vòng mô cứng và vòng bó li be-gỗ nhưng vòng mô cứng và vòng các bó li be-gỗ bị đứt đoạn ở phía trên của gân giữa, trong các tế bào mô mềm thường có tinh thể calci oxalat hình cầu gai.
2 3 4 5 6 7 A B C 27
D E
1. Biểu bì; 2. Mô mềm vỏ; 3. Mô cứng; 4. Mô mềm trong; 5. Li be; 6. Gỗ; 7. Tinh thể calci oxalat. A. Vi phẫu lá chét cắt ngang; B. Biểu bì, mô mềm vỏ;
C. Mô mềm vỏ chứa calci oxalat; D. Libe, gỗ, mô mềm trong; E. Mô mềm
Hình 3.6. Vi phẫu lá chét
3.1.3.2. Cấu tạo thân khí sinh
Cấu tạo giống cuống lá gồm: biểu bì; mô mềm vỏ; vòng mô cứng gần như liên tục; các bó li be-gỗ xếp thành vòng uốn lượn gồm 24-30 bó, cứ một bó to ở chỗ lồi của thân, xếp ở phía ngoài xen kẽ một bó nhỏ xếp ở trong, giữa li be và gỗ là thượng tầng. Giữa các bó li be-gỗ là tia ruột, các tia này có thể đi từ trong mô mềm ruột đến mô mềm vỏ, nhưng phần lớn bị chặn bởi mô cứng. Trong mô mềm vỏ và mô mềm ruột có tinh thể calci oxalat hình cầu gai. 1 2 3 4 5 6 7 8 9 A B 28
C D
1. Biểu bì; 2. Tinh thể calci oxalat; 3. Mô mềm vỏ; 4. Mô cứng; 5. Li be; 6. thượng tầng; 7. Tia ruột; 8. Gỗ; 9. Mô mềm ruột
A. Vi phẫu rễ cắt ngang; B. Biểu bì, mô mềm vỏ chứa tinh thể calci oxalat; C. Tế bào mô mềm vỏ, tinh thể calci oxalat; D. Mô cứng, libe, gỗ
Hình 3.7. Vi phẫu thân khí sinh
3.1.3.3. Cấu tạo thân rễ
Ngoài cùng là bần gồm 2-3 lớp tế bào, mô mềm vỏ có chứa tinh thể
calci oxalat hình cầu gai, các bó li be- gỗ, mỗi bó có cung mô cứng ở phía
ngoài và bó li be-gỗ xếp chồng ở trong.
1 2 3 4 5 6 7 A B C D
1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Tinh thể calci oxalat; 4. Mô cứng; 5. Li be; 6. Gỗ cấp 1; 7. Mô mềm ruột
A. Vi phẫu thân rễ cắt ngang; B. Bần, mô mềm vỏ có tế bào chứa tinh thể calci oxalat; C. Bần, mô mềm vỏ; D. Tế bào mô mềm vỏ, tinh thể
calci oxalat; E. Bó libe – gỗ
Hình 3.8. Vi phẫu thân rễ
3.1.3.4. Cấu tạo rễ
Cắt ngang qua rễ thấy từ ngoài vào trong gồm: Bần: gồm nhiều lớp tế bào bần; Mô mềm vỏ trong đó có nhiều tinh thể calci oxalat hình cầu gai; Li
be cấp 2 gồm 17-22 bó ở phía ngoài có 3-9 tầng sợi xen kẽ với mô mềm li be,
phía trong là một đám lớn các tế bào mô mềm li be; Tầng phát sinh li be-gỗ;
Gỗ cấp 2: trong đó có nhiều mạch gỗ, sợi gỗ và mô mềm gỗ; Giữa các bó li be-gỗ là tia ruột, tia ruột có thể vào sâu đến gần tâm hoặc chỉ có ở phần li be.
1. Bần; 2. Mô mềm vỏ; 3. Tinh thể ci oxalat; 4. Sợi; 5. Li be cấp 2;
3.2. NGHIÊN CỨU THÀN
phụ
3.2.1.1. Định tính glycosid tim [2]
* Chiết xuất
ược liệu đã tán nhỏ cho vào bình nón dung tích 250 ml + 100