2.1.1 Dụng cụ, hóa chất và thiết bị thí nghiệm
Đĩa Petri, ống nghiệm, bình tam giác, chai thủy tinh, beaker thủy tinh, micropipet, bọc nilon, đèn cồn, đũa cấy, kẹp cấy, thước Vernier caliper (150x0,02 mm), kim mũi giáo, giấy thấm, kéo, hóa chất, lame, lamelle, băng keo trong, nước cất, cotton blue và sổ ghi chép.
Tủ thanh trùng ướt, tủ thanh trùng khô, lò chưng cách thủy, tủ cấy, tủ úm, kính soi nổi, kính hiển vi, đèn cận cực tím, đèn huỳnh quang, cân điện tử và máy đo pH.
Hóa chất sử dụng cho các thí nghiệm gồm cồn 700 và cồn 960.
2.1.2 Vật liệu thí nghiệm
Nguồn nấm Aspergillus niger và Colletotrichum sp. được nhận từ Bộ môn Bảo Vệ Thực Vật, Khoa Nông nghiệp và Sinh học Ứng dụng, trường Đại Học Cần Thơ.
Nguồn dịch trích: lá neem (Azadirachta indica), lá lược vàng (Callisia fragrans). Hóa chất CaCl2.2H2O được cung cấp từ phòng thí nghiệm Nedo của Bộ môn.
Môi trường được sử dụng trong thí nghiệm
Môi trường Potato Dextrose Agar (PDA) (Atlas, 2004)
Khoai tây 200 g Đường dextrose 20 g Agar 20 g Nước cất 1000 ml pH 6,7 2.2 PHƯƠNG PHÁP THÍ NGHIỆM
Thí nghiệm được thực hiện tại phòng thí nghiệm phòng trừ sinh học và khu nhà lưới thuộc Bộ môn Bảo vệ Thực vật, Khoa Nông nghiệp & Sinh học Ứng dụng, trường Đại học Cần Thơ từ tháng 03 năm 2013 đến tháng 12 năm 2013.
Phương pháp thực hiện gồm 3 thí nghiệm cho mỗi loại nấm.
2.2.1 Thí nghiệm 1: Khảo sát ảnh hưởng của nồng độ và các thời gian xử lý của CaCl2 và dịch trích thực vật đến sự phát triển khuẩn ty nấm Aspergillus niger
và Colletotrichum sp. trong điều kiện in vitro
Mục đích thí nghiệm: đánh giá hiệu quả của hai loại dịch trích thực vật và CaCl2
18
Bảng 2.1: Nồng độ CaCl2 và dịch trích thực vật được sử dụng trong thí nghiệm 1
Số thứ tự Tên thuốc/dịch trích thực vật Nồng độ
Nồng độ 1 Nồng độ 2 Nồng độ 3 1 CaCl2 20 mM 40 mM 60 mM
2 Lá neem 2% 4% 6%
3 Lá lược vàng 2% 4% 6%
Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 10 nghiệm thức (hai loại dịch trích, hóa chất CaCl2 và một nghiệm thức đối chứng) và 6 lần lặp lại. Loại dịch trích thực vật và nồng độ dịch trích được trình bày trong Bảng 2.1. Nghiệm thức đối chứng là môi trường PDA không có chứa dịch trích thực vật.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm (Nguyễn Thị Mỹ Xuyên, 2012).
Thực vật được sử dụng làm dịch trích sẽ được thu vào buổi sáng (khoảng 7h30), lá neem được chọn làm dịch trích là những lá có màu xanh đậm (lá tương đối già), đối với lược vàng chọn những lá xanh đậm, còn nguyên vẹn, không bị rách hoặc nhiễm nấm bệnh. Thực vật sau khi thu về sẽ được rửa sạch đất cát, sau đó để ráo nước và cân thực vật với khối lượng 30 g (trọng lượng tươi) rồi nghiền với 30 ml nước cất thanh trùng trong cối và chày thủy tinh đã thanh trùng khô. Sau đó, rót phần dịch trích thu được qua giấy lọc Whatman (có đường kính lỗ lọc 0,5 µm) vào 1 cốc thủy tinh đã thanh trùng khô (dịch trích trong cốc thủy tinh đạt nồng độ đậm đặc 100%). Dùng bọc nilong bao cả bộ cốc thủy tinh và giấy lọc bên trên (Dhinggra và Sinclair, 1995).
Nấu tan môi trường PDA. Khi chai môi trường đạt nhiệt độ khoảng 55-60oC (có thể cầm được chai môi trường bằng tay) thì đưa 2, 4 và 6 ml dịch trích thực vật đã chuẩn bị sẵn (lượng dịch trích này được trích ra từ cốc thủy tinh đậm đặc 100%) vào chai thủy tinh tương ứng chứa 98, 96 và 94 ml môi trường PDA sẽ đạt được nồng độ ở Bảng 2.1, lắc chai môi trường để dịch trích hòa tan đều vào môi trường. Sau đó, môi trường trong chai sẽ được đổ vào các đĩa Petri (10 ml môi trường/đĩa petri). Sau khi môi trường đặc lại, đặt các khoanh khuẩn ty nấm đã chuẩn bị vào chính giữa đĩa petri (Dhinggra và Sinclair, 1995) (Hình 2.1).
19
Hình 2.1: Sơ đồ bố trí thử nghiệm hiệu quả của dịch trích thực vật đối với nấm gây bệnh sau thu hoạch.
Chỉ tiêu ghi nhận: ghi nhận đường kính khuẩn lạc của nấm vào các thời điểm 24, 48, 72, 96... giờ sau đặt khoanh khuẩn ty. Chỉ tiêu được ngừng ghi nhận khi khuẩn lạc của nấm phát triển đến mép đĩa petri.
Hiệu quả của hóa chất được tính theo công thức: (ĐKKLđc – ĐKKLi)
HQT (%) = x 100 ĐKKLđc
Trong đó: ĐKKLđc: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức đối chứng ĐKKLi: Đường kính khuẩn lạc của nghiệm thức thuốc i.
2.2.2 Thí nghiệm 2: Đánh giá hiệu quả của việc xử lý CaCl2, dịch trích lá neem và dịch trích lá lược vàng trước khi lây bệnh nhân tạo trên trái
Vì một đặc điểm quan trọng đối với nông sản sau thu hoạch là rất nhiều loại mầm bệnh sẽ xâm nhiễm và gây hại sau khi rửa trái và tồn trữ. Mầm bệnh này có thể bắt nguồn từ chính các vật liệu tồn trữ hoặc từ một trái đã mang mầm bệnh ẩn. Kết quả của thí nghiệm này có ý nghĩa thực tiễn đối với các trái cây xuất khẩu.
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện với 12 lặp lại, 1 trái/ lặp lại. Chọn các trái đồng đều về kích thước, màu sắc và được xử lý bằng cồn 70o trước khi thí nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Talibi và ctv. (2011), Nguyễn Thị Mỹ Xuyên (2012) và Yu và ctv. (2012).
Mục đích thí nghiệm: ghi nhận hiệu quả của CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng ức chế sự phát triển của bệnh khi mầm bệnh chưa hiện trên trái.
Môi trường đã có dịch trích thực vật theo nồng độ tính sẵn Khoanh khuẩn ty nấm gây bệnh
(đường kính khoảng 7 mm)
20
Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (gồm hai dịch trích, hóa chất CaCl2 và nghiệm thức đối chứng không xử lý) và 12 lặp lại (1 trái/lặp lại).
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Aspergillus niger nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 6% và hóa chất CaCl2 20 mM.
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Colletotrichum sp. nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 4% và hóa chất CaCl2 20 mM.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm (Nguyễn Thị Mỹ Xuyên, 2012).
Dịch trích thực vật được thu và pha nồng độ tương tự như thí nghiệm 1. Phương pháp xử lý dịch trích và lây bệnh trên trái: Trái sẽ được xử lý CaCl2, dịch trích là neem và lá lược vàng theo nồng độ trước, lần lượt nhúng từng trái vào nồng độ dịch trích và CaCl2 đã chuẩn bị sẵn, mỗi trái nhúng khoảng 20 giây, sao cho cả trái thấm đều dịch trích và CaCl2, sau đó trái sẽ để trong bọc nilong riêng có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều kiện nhiệt độ 250C, sau 24 giờ xử lý dịch trích bắt đầu tiến hành chủng bệnh, tất cả các dụng cụ đã được thanh trùng. Đầu tiên, tạo vết thương trên trái bằng cách dùng một bó kim ghim (gồm 9 cây kim) châm lên phần mô trái với độ sâu 2 mm (đối với Aspergillus niger châm 4 điểm trên thân trái,
Colletotrichum sp. châm 4 điểm trên thân và 1 điểm trên cuống trái). Sau khi châm để trái khoảng 30 phút thì bắt đầu tiến hành chủng bệnh. Tiếp đến, dùng pipet hút 10-15 ml nước cất thanh trùng cho vào đĩa nấm nguồn đã làm thuần và pha tạo huyền phù. Sau đó, dùng lame đếm hồng cầu để đếm mật số bào tử trong huyền phù (mật số 106 bào tử/ml), xong dùng pipet hút 1 ml huyền phù bào tử nấm nhỏ lên những vết thương trên trái. Sau đó để trái vào bọc nilon và buột chặt lại ủ ở điều kiện 250C trong một ngày rồi chuyển về điều kiện phòng (28-300C) để theo dõi quá trình phát triển của bệnh qua các thời điểm.
Chỉ tiêu ghi nhận: bắt đầu ghi nhận đường kính vết bệnh trên trái ở các thời điểm tính từ thời điểm trái bắt đầu xuất hiện triệu chứng đầu tiên. Ghi nhận cho đến khi trái đường kính vết bệnh của các vết thương trên trái giao nhau.
Hiệu quả ức chế (%) đường kính vết bệnh được tính theo công thức của Yu và ctv. (2012):
TBDKVBđc - TBDKVBi
HQT (%) = x 100 TBDKVBđc
Trong đó: TBDKVBĐC: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức đối chứng TBDKVBi: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức thuốc i.
21
2.2.3 Thí nghiệm 3: Đánh giá hiệu quả của việc xử lý CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng sau khi lây bệnh nhân tạo trên trái
Các thí nghiệm sẽ được thực hiện với 12 lặp lại, 1 trái/lặp lại. Chọn các trái đồng đều về kích thước, màu sắc và được xử lý bằng cồn 70o trước khi thí nghiệm. Các thí nghiệm được thực hiện theo phương pháp của Talibi và ctv. (2011), Nguyễn Thị Mỹ Xuyên (2012) và Yu và ctv. (2012).
Mục đích thí nghiệm: ghi nhận hiệu quả của hóa chất CaCl2, dịch trích lá neem và lá lược vàng trong việc ức chế sự phát triển của nấm bệnh khi mầm bệnh đã hiện diện trên trái.
Thực hiện thí nghiệm:
Thí nghiệm được bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên gồm 4 nghiệm thức (gồm hai dịch trích, CaCl2 và nghiệm thức đối chứng xử lý với nước cất vô trùng) và 12 lặp lại (1 trái/lặp lại).
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Aspergillus niger nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 6% và hóa chất CaCl2 20 mM.
- Từ thí nghiệm 1: đối với nấm Colletotrichum sp. nghiệm thức CaCl2 và dịch trích được chọn là lá neem 6%, lược vàng 4% và hóa chất CaCl2 20 mM.
Chuẩn bị nguồn nấm: nấm được nuôi cấy trong đĩa petri khoảng 10-15 ngày trước khi tiến hành thí nghiệm (Nguyễn Thị Mỹ Xuyên, 2012).
Dịch trích thực vật được thu và pha nồng độ tương tự như thí nghiệm 1. Phương pháp lây bệnh và xử lý dịch trích trên trái: tất cả các dụng cụ đã được thanh trùng. Đầu tiên, tạo vết thương trên trái bằng cách dùng một bó kim ghim (gồm 9 cây kim) châm lên phần mô trái với độ sâu 2 mm (đối với Aspergillus niger châm 4 điểm trên thân trái, Colletotrichum sp. châm 4 điểm trên thân và 1 điểm trên cuống trái). Sau khi châm để trái khoảng 30 phút bắt đầu tiến hành chủng bệnh. Tiếp đến, dùng pipet hút 10-15 ml nước cất thanh trùng cho vào đĩa nấm nguồn đã làm thuần và pha tạo huyền phù. Sau đó, dùng lame đếm hồng cầu để đếm mật số bào tử trong huyền phù (mật số 106 bào tử/ml), xong dùng pipet hút 1 ml huyền phù bào tử nấm nhỏ lên những vết thương trên trái. Sau đó để trái vào bọc nilon và buột chặt lại ủ ở điều kiện 250C. Sau khi lây bệnh khoảng 12-24 giờ, trái sẽ được xử lý dịch trích và CaCl2 theo nồng độ, lần lượt nhúng từng trái vào nồng độ dịch trích và CaCl2 đã chuẩn bị sẵn, mỗi trái nhúng khoảng 20 giây, sao cho cả trái thấm đều dịch trích và hóa chất CaCl2. Sau khi xử lý dịch trích xong, trái sẽ để trong bọc nilong riêng có bổ sung ẩm độ và ủ ở điều kiện nhiệt độ phòng (28-300C).
Chỉ tiêu ghi nhận: bắt đầu ghi nhận đường kính vết bệnh ở các thời điểm tính từ thời điểm trái bắt đầu xuất hiện triệu chứng đầu tiên. Ghi nhận cho đến khi trái đường kính vết bệnh của các vết thương trên trái giao nhau.
22
Hiệu quả ức chế (%) đường kính vết bệnh được tính theo công thức của Yu và ctv. (2012):
TBDKVBđc - TBDKVBi
HQT (%) = x 100 TBDKVBđc
Trong đó: TBDKVBĐC: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức đối chứng TBDKVBi: trung bình đường kính vết bệnh của nghiệm thức thuốc i.
2.2.4 Xử lý số liệu thống kê
23
CHƯƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1 KẾT QUẢ KHẢO SÁT HIỆU QUẢ PHÒNG TRỊ CỦA CaCl2, DỊCH TRÍCH LÁ NEEM VÀ LÁ LƯỢC VÀNG ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS TRÍCH LÁ NEEM VÀ LÁ LƯỢC VÀNG ĐỐI VỚI NẤM ASPERGILLUS
NIGER GÂY HẠI TRÊN TRÁI CAM SÀNH SAU THU HOẠCH
3.1.1 Khả năng hạn chế của dịch trích thực vật và dung dịch CaCl2 đối với sự phát triển khuẩn ty nấm trong điều kiện invitro
Nhìn chung, kết quả ghi nhận vào bốn thời điểm 24 giờ, 48 giờ, 72 giờ và 96 giờ sau thử nghiệm ở Bảng 3.1 cho thấy đa số các nghiệm thức có xử lý với dịch trích và CaCl2 đều có khả năng hạn chế đường kính khuẩn ty nấm Aspergillus niger. Tuy nhiên, khả năng hạn chế đường kính khuẩn ty ở các nghiệm thức có xử lý dịch trích và CaCl2 ở các thời điểm quan sát là khác nhau.
Tại thời điểm 24 giờ sau thử nghiệm (GSTN), chỉ có duy nhất nghiệm thức dịch trích lá neem 6% thể hiện hiệu quả hạn chế đường kính khuẩn ty nấm so với nghiệm thức đối chứng không xử lý, lần lượt là 19,7 mm và 25,1 mm. Các nghiệm thức có xử lý dịch trích còn lại có đường kính khuẩn ty tương đương và khác biệt không ý nghĩa so với đối chứng. Ở thời điểm quan sát tiếp theo (48 GSTN), kết quả ghi nhận tương tự thời điểm 24 GSTN, nghiệm thức neem 6% tiếp tục thể hiện hiệu quả cho đường kính khuẩn ty là 36,7 mm. Đến thời điểm 72 và 96 GSTN, ngoại trừ hai nghiệm thức xử lý bằng CaCl2 40 mM và 60 mM, các nghiệm thức còn lại đều thể hiện khả năng ức chế sự phát triển khuẩn ty nấm Aspergillus niger. Cụ thể, ở 72 GSTN, nghiệm thức neem 6% tiếp tục cho đường kính khuẩn ty nhỏ nhất (57,7 mm), kế đến là dịch trích lá lược vàng 6% (59 mm), dịch trích lá lược vàng 4% (61,3 mm) và dịch trích lá neem 4% (61,8 mm), sau cùng là dịch trích lá neem 2% (62,6 mm) và dịch trích lá lược vàng 2% (62,8 mm), CaCl2 20mM (61,4 mm); đều thấp hơn có ý nghĩa so với nghiệm thức đối chứng (70,3 mm). Ở 96 GSTN, đường kính khuẩn ty của các nghiệm thức lần lượt là dịch trích lá neem 6% (72,3 mm), dịch trích lá lược vàng 6% (75,3 mm), dịch trích lá lược vàng 4% (76,8 mm) và dịch trích lá neem 4% (75,2 mm), sau cùng là dịch trích lá neem 2% (75,7 mm) và dịch trích lá lược vàng 2% (76,6 mm), CaCl2 20 mM (78,2 mm); cũng đều thấp hơn có ý nghĩa so nghiệm thức đối chứng (85,3 mm) (Bảng 3.1).
24
Bảng 3.1: Đường kính (mm) khuẩn ty của nấm Aspergillus niger trong điều kiện in vitro
Nghiệm thức Đường kính khuẩn ty qua các thời điểm quan sát Loại dịch trích Nồng độ 24 GSTN 48 GSTN 72 GSTN 96 GSTN Lá neem 2% 23,3 bc 42,5 c 62,6 c 75,7 bc 4% 22,5 c 41,8 c 61,8 cd 75,2 bc 6% 19,7 d 36,7 d 57,7 e 72,3 c Lá lược vàng 2% 23,6 bc 43,4 c 62,8 c 76,6 bc 4% 23,6 bc 42,4 c 61,3 cd 76,8 bc 6% 22,8 bc 41,0 c 59,0 de 75,3 bc CaCl2 20 mM 22,3 c 40,7 c 61,4 cd 78,2 b 40 mM 25,4 b 48,0 b 70,8 b 88,0 a 60 mM 29,5 a 56,1 a 77,8 a 84,5 a Đối chứng nước cất 25,1 bc 42,8 c 70,3 b 85,3 a Mức ý nghĩa * * * * CV (%) 8,73 6,97 4,17 5,04
Ghi chú *: số liệu khác biệt ở mức ý nghĩa 5 % ns : khác biệt không ý nghĩa thống kê Trong cùng một cột, những số có cùng chữ số theo sau thì khác biệt không ý nghĩa ở mức 5 %.
Hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty nấm Aspergillus niger trong điều kiện in vitro được thể hiện ở Bảng 3.2. Tại thời điểm 24 GSTN, nghiệm thức dịch trích lá neem 6% có hiệu quả ức chế 21,61%, là nghiệm thức xử lý duy nhất cho hiệu quả khác biệt có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức không xử lý. Các nghiệm thức còn lại có hiệu quả ức chế nằm trong khoảng 0,00 – 10.98% và khác biệt không ý nghĩa so với đối chứng.
Ở thời điểm 48 GSTN, tất cả các nghiệm thức xử lý đều không thể hiện được hiệu quả khi so với nghiệm thức đối chứng không xử lý (Bảng 3.2).
Đến thời điểm 72 GSTN, ngoại trừ hai nghiệm thức xử lý với CaCl2 40 mM và 60 mM, các nghiệm thức xử lý còn lại cho hiệu quả ức chế sự phát triển của khuẩn ty và khác biệt so với đối chứng ở mức ý nghĩa 5%. Các nghiệm thức dịch trích lá neem 2%; 4%; 6% và dịch trích lá lược vàng 2%; 4%; 6% có hiệu quả ức chế tương đương nhau và lần lượt là 10,93%; 11,93%; 18,06%; 10,50%; 12,65% và 15,98%. Nghiệm thức xử lý với CaCl2 20 mM cho hiệu quả ức chế đường kính