d. Đề nghị và điểm:
I.4.4Phương pháp chiết Soxhlet[5]
Hệ thống máy Soxhlet gồm ba bộ phận chính được nối với nhau là: bình cầu chứa dung môi được nung trên bếp điện có thể điều chỉnh nhiệt độ; phần ở giữa là bộ
phận chứa mẫu bột cây, bộ phận này gồm ba ống thủy tinh thông với nhau; phần trên cùng là hệ thống ngưng tựu hơi.
Mẫu được cho vào túi và để vào ống D. Sau đó cho dung môi vào, dung môi sẽ thấm ướt bột cây rồi chạy xuống bình cầu theo ống thông nhau E. Lưu ý để dung môi vào bình cầu không được quá 2/3 thể tích bình. Lúc này mở nước chảy hoàn lưu và tiến hành đun. Hơi dung môi bốc lên sẽ theo ống B, gặp lạnh hơi sẽ bi ngưng tựu xuống ống D. Dung môi thấm vào bột cây và chiết những chất hữu cơ nào có thể hòa tan vào dung môi. Khi dung môi ngưng tựu đến mức cao nhất trong ống E thì toàn bộ dung môi bị rút hết xuống bình cầu. Các chất được hút xuống nằm lại tại đó và chỉ có dung môi bay hơi lên để tiếp tục quá trình chiết. Sau khi hoàn tất đuổi dung môi ta thu được cao chiết.
CHƯƠNG II: THỰC NGHIỆM
II.1 ĐỊA ĐIỂM, THỜI GIAN, THIẾT BỊ, NGUYÊN LIỆU VÀ HÓA CHẤT
II.1.1 Địa điểm và thời gian
Việc tiến hành nghiên cứu được thực hiện tại phòng thí nghiệm Hóa sinh, Bộ môn Hóa học, Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ
Thời gian thực hiện: từ 01/12/2012 đến 30/05/2013 II.1.2 Thiết bị, nguyên liệu, dụng cụ và hóa chất
II.1.2.1 Thiết bị và dụng cụ
Bộ chưng cất tinh dầu nhẹ Clevenger
Cân điện tử SARTORRIUS 210 g 0,0001 g Hệ thống GC – MS THERMO SCIENTIFIC Máy cô quay EYELA CCA - 1110
Nhiệt kế 200C Bình tam giác 250 ml Bercher 100ml, 250 ml Microburrette 25 ml Đũa thủy tinh
Pipet 5 ml, 10 ml, 25 ml Bình cầu 250 ml
Ống đong 10 ml, 25 ml Bình lóng 250 ml Bếp điện Gali
II.1.2.2 Nguyên liệu và hóa chất
Nguyên liệu
Hình 6: Mẫu Bạc hà khô Hình 7: Mẫu Bạc hà đã cắt nhỏ Mẫu Bạc hà dùng trong thí nghiệm là mẫu lá Bạc hà khô do cơ sở giống cây trồng Bình Châu cung cấp (24 - Điện Biên Phủ, quận Bình Tân, TP. HCM).
Qua sự định danh Bộ môn Sinh học – Khoa Khoa học Tự nhiên, Trường Đại học Cần Thơ và tham chiếu trong quyển “Những cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam” loài Bạc hà được sử dụng khảo sát thực nghiệm có tên gọi khoa học là Mentha arvensis L. var. piperascens (Malinv.)
Hóa chất Cồn 96o (25 ml) Nước cất Acetone (50 ml) Phenolphthalein (5 ml)
Dung dịch KOH 0,1N trong alcol (100 ml)
Dung dịch HCl 0,1N (200 ml) Đá bọt (5 g) Diethyl eter
II.2 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
Để đạt được yêu cầu nghiên cứu của đề tài, em tiến hành thực hiện các bước sau: - Thu mua và xử lý nguyên liệu
- Ly trích tinh dầu bằng phương pháp chiết lôi cuốn hơi nước với các điều kiện khảo sát là thời gian ly trích, nhiệt độ ly trích và lượng dung môi ly trích.
- Phân tích thành phần hóa học chính trong tinh dầu bằng máy sắc ký ghép khối phổ (GC – MS).
II.2.1 Xử lý nguyên liệu
Mẫu Bạc hà khô sau khi mua về được loại bỏ tạp lẫn như cỏ, rơm hoặc các lá cây khác. Tiếp theo tách lấy lá Bạc hà, sau đó cắt nhỏ mẫu khoảng 1-2 cm và được bảo quản trong túi nilon ở nhiệt độ phòng.
II.2.2 Ly trích tinh dầu bằng phương pháp lôi cuốn hơi nước[7]
Cân 20 g mẫu Bạc hà khô đã cắt nhỏ cho vào bình cầu 1000 ml, rót nước cất vào bình sao cho thể tích nước trong bình không vượt quá 2/3 thể tích của bình cầu. Nếu cho nước quá nhiều thì trong quá trình đun xác mẫu trong bình cầu sẽ trào lên bộ phận hứng lấy tinh dầu. Lắp bình cầu vào hệ thống gồm ống hứng tinh dầu và ống sinh hàn. Bình cầu được đun cách dầu silicon để nhiệt độ tỏa đều, ổn định hơn và không gây vỡ bình cầu khi đun quá lâu. Điều chỉnh nhiệt độ của bếp điện sao cho tránh dầu sôi mạnh có thể tràn ra ngoài. Sau quá trình ly trích, hỗn hợp tinh dầu thu được gồm tinh dầu Bạc hà và nước. Thực hiện chiết hỗn hợp với dung môi diethyl eter để loại bỏ nước thu lấy phần dung môi. Làm khan bằng Na2SO4, sau đó tiến hành cô quay thu hồi dung môi, được tinh dầu Bạc hà. Cân sản phẩm thu được từ đó tính hiệu suất của quá trình ly trích. Đồng thời cũng phân tích thành phần mẫu tinh dầu thu được bằng GC – MS.
Hình 8: Sơ đồ các bước thực hiện ly trích tinh dầu Bạc hà bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
II.2.3 Xác định một số chỉ tiêu hóa – lý của tinh dầu Bạc hà
Mẫu tinh dầu thu được sau khi ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước sẽ được xác định các chỉ tiêu sau:
Nguyên liệu
Ly trích bằng lôi cuốn hơi nước
Hỗn hợp tinh dầu
Nước Dung môi
Cô quay thu hồi diethyl ether Dung môi Nước Tinh dầu bạc hà thô + Làm khan bằng Na2SO4 + Lọc
+ Chiết lại hỗn hợp với diethyl ether
+ Làm khan bằng Na2SO4 + Lọc
+ Cô quay thu hồi dung môi
+ Chiết hỗn hợp với diethyl ether để loại bỏ tạp chất
+ Loại bỏ cỏ, lá cây tạp + Cắt nhỏ
II.2.3.1 Đánh giá cảm quan[6,7]
Phân tích sơ bộ chất lượng của tinh dầu bằng cảm quan. Nghĩa là nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài như mùi, vị, màu sắc, độ trong suốt...
Qua nghiên cứu những dấu hiệu bên ngoài này có thể phán đoán và đánh giá sơ bộ về chất lượng của tinh dầu và mục đích sử dụng tinh dầu.
II.2.3.1.1 Màu sắc và độ trong suốt[6,7]
Xác định màu sắc và độ trong suốt của tinh dầu bằng cách cho tinh dầu vào một ống thủy tinh trong suốt không có màu có dung tích 20 ml, thỉnh thoảng lắc và quan sát rồi ghi nhận xét về tính chất, cường độ của màu và độ trong suốt (ví dụ: vàng nhạt, nâu sẫm...). Nếu tinh dầu còn vẩn đục và không trong suốt chứng tỏ còn tạp chất và nước.
II.2.3.1.2 Mùi[6,7]
Mùi là một trong những biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có một mùi đặc trưng. Dựa vào mùi có thể biết được chất lượng và mục đích sử dụng của nó.
Để xác định mùi, nhỏ một giọt tinh dầu lên tờ giấy lọc hoặc bôi một ít vào mu bàn tay rồi ngửi cách chỗ có tinh dầu 20 - 30 mm; cứ 15 phút ngửi 1 lần trong một giờ. Ghi nhận xét về bản chất và cường độ mùi (thơm dịu, hăng, xốc...).
II.2.3.1.3 Vị[6,7]
Vị cũng là một biểu hiện bên ngoài quan trọng của tinh dầu. Mỗi một loại tinh dầu có mùi vị riêng. Để xác định vị, dùng phương pháp nếm, nếm xong ghi nhận xét bản chất (ngọt, đắng…) và cường độ của vị (dịu, thoảng…).
II.2.3.2 Xác định chỉ số acid[3,6,7]
Chỉ số acid biểu diễn bằng lượng miligam KOH cần thiết dùng để trung hòa acid tự do có trong 1 gam tinh dầu. Biết được chỉ số acid có thể xác định được lượng acid tự do trong tinh dầu.
Chỉ số acid phụ thuộc vào phương pháp khai thác, mức độ tươi và thời gian bảo quản của tinh dầu. Khi bảo quản lâu chỉ số acid của tinh dầu sẽ tăng lên do bị oxi hóa và ester trong tinh dầu bị phân giải.
RCOOH + KOH → RCOOK + H2O
Từ lượng kiềm để trung hòa acid tự do, tính được chỉ số acid.
Để xác định cân chính xác một lượng tinh dầu khoảng 2 gam, hòa tan bằng ethanol 96, cho vài giọt phenolphtalein rồi chuẩn độ bằng dung dịch KOH 0,1N đến khi xuất hiện màu hồng ổn định trong 2-3 giây.
Chỉ số acid được tính bằng công thức:
m V 5,61 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
IA=
Trong đó:
5,61 là lượng miligam KOH chứa trong 1 ml KOH 0,1N. V : thể tích ml KOH 0,1N dùng để chuẩn độ mẫu thí nghiệm. m: lượng tinh dầu dùng thí nghiệm (g).
II.2.3.3 Xác định chỉ số savon hóa[3,6,7]
Chỉ số xà phòng là số miligam KOH cần thiết để trung hòa tất cả các acid tự do và acid kết hợp có trong 1 gam tinh dầu.
Cách xác định
Cân chính xác khoảng 0,3 gam tinh dầu vào bình tam giác 250 mL, cho vào đó 6 mL KOH 0,1 N trong alcol. Tiến hành song song với mẫu không có dầu. Đem 2 bình đun cách thủy qua ống sinh hàn, cho sôi nhẹ trong khoảng 45 phút để tinh dầu thủy phân hoàn toàn. Để nguội, thêm vào đó 2 mL nước cất, 2-3 giọt phenolphthalein, dung dịch chuyển sang màu hồng, chuẩn độ bằng HCl 0,1 N trong alcol cho đến khi mất màu hồng.
Tiến hành chuẩn độ mẫu trắng trước khi chuẩn mẫu thật.
Tính kết quả: m ) V (V 5,61 = I 1 2 S Trong đó:
1mL KOH 0,1 N tương đương với 5,61 mg KOH IS: Chỉ số xà phòng
V1 : số mL HCl 0,1N dùng chuẩn độ bình không V2 : số mL HCl 0,1N dùng chuẩn độ bình chứa mẫu
m: khối lượng tinh dầu lấy làm thí nghiệm.
II.2.3.4 Chỉ số ester[3,6,7]
Là số mg KOH cần thiết để xà phòng hoá hết lượng glycerid có trong một gam tinh dầu, chỉ số ester là hiệu số giữa chỉ số xà phòng hóa và chỉ số acid. Chỉ số ester càng cao thì lượng glycerin có trong tinh dầu càng nhiều.
IE = IS – IA
II.2.4 Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến hàm lượng và thành phần tinh dầu Bạc hà
Tiến hành khảo sát 3 yếu tố làm ảnh hưởng đến hàm lượng và thành phần tinh dầu: thời gian ly trích, nhiệt độ và thể tích dung môi dùng ly trích. Sau khi đã có các điều kiện ly trích tối ưu, tôi tiến hành ly trích một mẫu ở những điều kiện tối ưu để làm mẫu so sánh thành phần hóa học với 3 mẫu tối ưu.
Nguyên tắc: cố định hai yếu tố và thay đổi một yếu tố để chọn được điều kiện tối ưu cho yếu tố đó. Sau đó thực hiên tương tự cho 2 yếu tố còn lại. Cuối cùng tính phần trăm theo khối lượng tinh dầu thu được và phân tích thành hóa học bằng GC - MS.
II.2.4.1 Khảo sát thời gian ly trích[4,6,7,8]
Cố định 2 yếu tố nhiệt độ và lượng dung môi ly trích và thay đổi thời gian ly trích ở những giai đoạn 40 phút, 50 phút, 60 phút, 1 giờ 15 phút và 1 giờ 30 phút. Thời gian được bắt đầu tính từ lúc ta thu được giọt tinh dầu đầu tiên ngưng tụ nhỏ xuống ống hứng tinh dầu. Cân và phân tích thành phần mẫu tinh dầu để so sánh hàm lượng và thành phần tinh dầu ở mỗi thời gian ly trích khác nhau từ đó chọn được mức thời gian tối ưu nhất. Phân tích thành phần hóa học của mẫu thời gian tối ưu (M1) bằng GC – MS.
II.2.4.2 Khảo sát lượng dung môi ly trích[4,6,7,8]
Với thời gian ly trích tối ưu đã chọn, tiếp tục cố định nhiệt độ. Ta khảo sát quá trình ly trích tinh dầu với những thể tích dung môi là 200 ml, 300 ml, 400 ml, 500 ml, 600ml. Cân và phân tích thành phần mẫu tinh dầu để so sánh hàm lượng và thành phần tinh dầu ở những lượng dung môi dùng ly trích khác nhau từ đó chọn được mức thể tích tối ưu nhất. Phân tích thành phần hóa học của mẫu thể tích tối ưu (M3) bằng GC –
II.2.4.3 Khảo sát nhiệt độ ly trích[4,6,7,8]
Bật bếp điện trước 30 phút (tùy theo nhiệt độ tăng ở mỗi bếp đun sử dụng) để nhiệt độ cần tiến hành khảo sát ổn định. Cắm nhiệt kế vào trong dầu silicon và luôn theo dỗi nhiệt độ của dầu. Sau đó mới tiến hành khảo sát ở thời gian và thể tích dung môi tối ưu vừa tìm được. Ta thực hiện ly trích tinh dầu ở những khoảng nhiệt độ 120C, 130C, 140C, 150C, 160C. Cân và phân tích thành phần mẫu tinh dầu để so sánh hàm lượng và thành phần tinh dầu ở những khoảng nhiệt độ ly trích khác nhau từ đó chọn được nhiệt độ tối ưu nhất. Phân tích thành phần hóa học của mẫu nhiệt độ tối ưu (M2) bằng GC – MS.
II.2.4.4 Khảo sát sự ảnh hưởng của thời gian, nhiệt độ và thể tích dung môi đến thành phần hóa học[7]
Tiến hành ly trích một mẫu tinh dầu Bạc hà khảo sát (M4) ở điều kiện thời gian tối ưu, nhiệt độ tối ưu và lượng dung môi tối ưu. Sau đó phân tích thành phần hóa học bằng GC – MS và so sánh phần trăm các cấu tử trong tinh dầu của mẫu này với 3 mẫu thu được ở mỗi điều kiện ly trích thời gian tối ưu (M1), nhiệt độ tối ưu (M2) và lượng dung môi tối ưu (M3). Từ đó có kết luận về sự ảnh hưởng của 3 yếu tố thời gian, nhiệt độ và thể tích dung môi đến thành phần hóa học của tinh dầu Bạc hà.
II.2.5 Xác định thành phần hóa học chính của tinh dầu Bạc hà bằng phương pháp sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) [4,6,7,8]
Tinh dầu Bạc hà thu được sau khi ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước được phân tích thành phần hóa học bằng máy sắc ký ghép khối phổ (GC – MS) THERMO SCIENTIFIC. Cột sử dụng trong phân tích là cột có kí hiệu TG – SQC (15 m x 0,25 mm x 0,25 m), khí mang là heli, với các điều kiện chạy phân tích như sau:
II.2.5.1 Điều kiện sắc ký
Hình 9: Chương trình nhiệt độ Ram 1:Nhiệt độ đầu ở 60C, giữ 2 phút (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Ram 2: tăng lên 120C với tốc độ 5C /phút, giữ 1 phút Ram 3: tăng lên 135C với tốc độ 3C /phút, giữ 1 phút Ram 4: tăng lên 200C với tốc độ 10C /phút, giữ 3 phút
II.2.5.2 Điều kiện khối phổ
Nguồn ion hóa EI:
Nhiệt độ bắn phá ion: 200C Nhiệt độ stranferline: 230C Chế độ quét: Fullscan Khối quét: 40-400 amu
Tiêm mẫu:
Chế độ tiêm mẫu chia dòng Tỉ lệ chia dòng: 42
Thể tích mẫu tiêm: 1 l
Hình 11: Điều kiện Injecter
II.2.5.3 Xác định thành phần hóa học tinh dầu Bạc hà
Thành phần tinh dầu được xác định như sau:
Xác định thời gian lưu của các chất trên GC giống với thời gian lưu của những chất đã biết trước.
Đối chiếu phổ khối lượng thu được với phổ gốc trong thư viện phổ NIST, từ đó định danh các cấu tử trong tinh dầu Bạc hà.
CHƯƠNG III: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
III.1 XÁC ĐỊNH CÁC CHỈ TIÊU HÓA LÝ CỦA TINH DẦU BẠC HÀ
III.1.1 Đánh giá cảm quan
Tinh dầu Bạc hà ly trích bằng phương pháp chưng cất lôi cuốn hơi nước thu được có tính chất sau:
Hình 12: Tinh dầu bạc hà
Màu: trong suốt hơi vàng nhạt. Mùi: có mùi thơm dịu tự nhiên của cây Bạc hà.
Vị: có vị cay thơm, tính mát.
III.1.2 Xác định chỉ số acid (IA)
Xác định chỉ số acid như phương pháp đã trình bày, thực hiện đo ba lần được kết quả như sau:
Bảng 6: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số acid
Số lần Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Khối lượng tinh dầu (g) 1,0030 1,0032 1,0042 1,0035 Thể tích KOH 0,1 N (ml) 0,3200 0,3200 0.3000 0,3133 IA 1,75
III.1.3 Xác định chỉ số savon hóa (IS)
Bảng 7: Kết quả chuẩn độ xác định chỉ số savon và chỉ số ester
Lần 1 Lần 2 Lần 3 Trung bình Khối lượng tinh dầu (g) 1,0034 1,0030 1,0030 1,0031 Thể tích HCl 0,1 N chuẩn độ mẫu (ml) 17,6 17,5 17,4 17,5 Thể tích HCl 0,1 N chuẩn mẫu trắng (ml) 14,6 14,7 14,5 14,6 IS 16,22 IE 14,47
Về mặt ý nghĩa của các chỉ số, chỉ số acid thấp cho thấy tinh dầu Bạc hà thu được vẫn đảm bảo chất lượng (mùi và thành phần tinh dầu) của một tinh dầu mới ly trích. Mặt khác, chỉ số ester lớn chứng tỏ hàm lượng ester trong tinh dầu Bạc hà nhiều. Đây là một trong nhũng các cấu tử chính góp phần tạo mùi thơm của tinh dầu Bạc hà nhiều. Như vậy quá trình ly trích bằng phương pháp trên ít làm thay đổi tính chất cũng như thành phần của tinh dầu.
III.2 KHẢO SÁT CÁC YẾU TỐ ẢNH HƯỞNG ĐẾN HIỆU