Thí nghiệm 1: Đánh giá khả năng chịu mặn của bộ giống/dòng lúa trong điều kiện phòng thí nghiệm.
* Chuẩn bị dung dịch muối
Hòa tan 0, 8, 10 g NaCl vào 1 lít dinh dƣỡng Yoshida (đã pha sẵn) để đạt đƣợc các dung dịch dinh dƣỡng có độ mặn tƣơng ứng là: 0‰, 8‰, 10‰. Thể tích dung dịch cho mỗi độ mặn là 3 lít.
* Chuẩn bị dụng cụ và hạt giống
- Khay nhựa chứa dung dịch muối (kích thƣớc 34x28x7 cm).
- Khay xốp có lỗ (kích thƣớc 22,5x10x1 cm), mỗi khay có 100 lỗ (đƣờng kính lỗ 1,5 cm), phía dƣới đáy có bọc lớp lƣới nilon.
- Hạt giống đƣợc xử lý bằng cách ngâm trong nƣớc 530C trong 15 phút để phá vỡ miên trạng của hạt. Ngâm hạt giống 24 giờ trong đĩa petri có lót giấy thấm và tiếp tục ủ ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ cho hạt nảy mầm.
* Các bƣớc tiến hành
- Khi rễ đã mọc mầm khoảng 1 cm cho hạt giống cần thử vào khay xốp có lót lớp nilon phía dƣới, mỗi lỗ của vỉ xốp cho vào hai hạt giống đã mọc mầm, mỗi giống cho vào mƣời lỗ (2 hạt/lỗ), đặt tấm xốp vào trong khay. Trong 3 ngày đầu khay nhựa chứa nƣớc để cây phát triển bình thƣờng. Sau 3 ngày, khi cây đã ổn định thay vào nƣớc là các dung dịch dinh dƣỡng Yoshida có thêm muối theo đúng yêu cầu. Chuẩn pH mỗi ngày về 5,0, sau mỗi 8 ngày thay vào dung dịch muối mới có độ mặn tƣơng ứng. Ghi nhận diễn biến của mặn bằng EC (đơn vị của dung dịch dS m-1) (EC là nồng độ dung dịch muối NaCl).
Công thức qui đổi EC đơn vị “dS m-1” thành “‰”: ‰ = EC x 0,64
- Sau khi đối chứng chết (giống chuẩn nhiễm IR28) tiến hành đánh giá, phân cấp mức độ chống chịu mặn qua quan sát sinh trƣởng dựa vào thang điểm đánh giá của IRRI (1979), (Bảng 2.2) của các giống.
Bảng 2.2 Tiêu chuẩn đánh giá mức độ chống chịu mặn theo IRRI, 1997
Cấp Mô tả triệu chứng Đánh giá
1 Cây phát triển bình thƣờng, không có triệu chứng trên lá
Chống chịu tốt
3 Cây phát triển tƣơng đối bình thƣờng, nhƣng chóp lá hoặc phân nửa của lá có vết trắng, lá hơi cuốn lại
Chống chịu
5 Phát triển chậm lại, hầu hết lá bị cuốn, chỉ có một vài lá có thể kéo dài ra
Chống chịu trung bình
7 Ngƣng phát triển, hầu hết những lá khô đi, một vài chồi bị chết
Nhiễm
9 100% cây chết hoặc khô Rất nhiễm
Hình 2.1 Khay chứa lúa thử mặn
Trồng những cây còn sống sau khi thử mặn để thu hạt thử mặn ở vụ sau.
Thí nghiệm 2: Đánh giá khả năng chịu mặn của các hạt thu đƣợc sau một thế hệ. Thí nghiệm đƣợc tiến hành nhƣ thí nghiệm 1.
Chiều dài và hình dạng hạt gạo
Để đo chiều dài hạt gạo dùng thƣớc nhựa vuông góc (chữ L) có vạch đơn vị mm. Mỗi giống lấy 10 hạt gạo (30 hạt cho mỗi giống), cố định các hạt nối đuôi nhau trên đƣờng thẳng để đo chiều dài và khích nhau về chiều ngang để đo chiều rộng hạt rồi lấy giá trị trung bình. Phân loại chiều dài và hình dạng hạt gạo theo tiêu chuẩn đánh giá phẩm chất hạt gạo của IRRI (1988), đƣợc trình bày ở Bảng 2.3.
Bảng 2.3 Tiêu chuẩn đánh giá chiều dài và hình dạng hạt gạo (IRRI, 1988)
Cấp Chiều dài hạt gạo Hình dạng hạt
1 Rất dài > 7,5 mm Thon dài D/R > 3,0
3 Dài 6,61-7,5 mm Trung bình D/R 2,1-3,0
5 Trung bình 5,51-6,6 mm Bầu D/R 1,1-2,0
7 Ngắn ≤ 5,5 mm Tròn D/R ≤1,0
Ghi chú: D/R: Tỷ lệ giữa chiều dài và chiều rộng hạt
Hàm lượng protein
Tiến hành theo phƣơng pháp Lowry O.H et al., (1951). * Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch ly trích
- Dung dịch NaOH 0,1N.
- Dung dịch A (Na2CO3 2% + Na-K-tatrate 0,05% + NaOH 0,1N. - Dung dịch B (CuSO4 0,1%).
- Dung dịch C (A:B = 45:5). - Dung dịch Folin 1N. * Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 10 mg bột gạo + 1 ml NaOH 0,1N. - Lắc ít nhất 2 giờ hay để qua đêm. * Bƣớc 3: Pha loãng mẫu và đo
- Khuấy mẫu sau đó ly tâm mẫu 14.000 vòng/phút trong 3 phút.
- Hút 100 µl cho vào ống 10 ml. Đối với mẫu blank, thay dung dịch ly trích bằng 100 µl NaOH 0,1N.
- Thêm 1 ml nƣớc cất, lắc đều. - Thêm 500 µl dung dịch C.
- Thêm 50 µl Forlin 1N , trộn đều và để yên trong 30 phút.
- Lắc đều mẫu, sau đó cho vào Cuvette và đo ở bƣớc sóng 580 nm. * Bƣớc 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả
-Pha dung dịch gốc Bovine serum albumin (BSA). - Đƣờng chuẩn có dạng:
Y = aX + b
- Trong đó: Y là Độ hấp thụ OD.
X là Lƣợng protein có trong mẫu đem đo.
- Hàm lƣợng protein đƣợc tính theo công thức: Phần trăm Protein (%P) = X100
m
Với : m là trọng lƣợng thực của mẫu m = 100
14 100 H%) - (100 10 H%: Độ ẩm của mẫu Hàm lượng amylose
Theo phƣơng pháp Cagampang and Rodriguez (1980). * Bƣớc 1: Chuẩn bị dung dịch
- Ethanol 95% - HCL 30% - NaOH 1N
- Dung dịch Iod (0,2% I2 và 2% KI) * Bƣớc 2: Chuẩn bị mẫu
- Cân 50 mg bột nhũ đã nghiền mịn cho vào ống 50 ml. - Thêm 0,5 ml ethanol 95% lắc nhẹ cho tan đều.
- Thêm 9,5 ml NaOH 1N. Để qua đêm ở nhiệt độ phòng. * Bƣớc 3: Pha loãng mẫu và đo mẫu
- Rút 100 µl dung dịch mẫu cho vào bình định mức 25 ml (đối với mẫu thử thay dung dịch mẫu bằng 100 µl NaOH 1N).
- Thêm nƣớc cất khoảng nửa bình, lắc đều. - Thêm 250 µl HCL 30% lắc đều.
- Thêm 250 µl dung dịch Iod, lắc đều. - Thêm nƣớc cất đến vạch định mức.
- Chuyển sang ống 50 ml và lắc đều, để yên 30 phút.
* Bƣớc 4: Dựng đƣờng chuẩn và tính kết quả Đƣờng chuẩn có dạng Y= aX + b Trong đó: Y: Độ hấp thụ OD
X: lƣợng amylose có trong 1 ml mẫu, đọc từ máy (mg/ml)
Tính hàm lƣợng amylose theo công thức: % Amylose = 100 5
, 0
X
Đánh giá hàm lƣợng amylose theo thang đánh giá của IRRI (1988), Bảng 2.4
Bảng 2.4 Phân nhóm lúa theo hàm lƣợng amylose (IRRI, 1988)
STT Phân nhóm Amylose(%) Cấp độ
1 Nếp 1-2 Rất thấp
2 Lúa dẻo cơm 8-20 Thấp
3 Lúa mềm cơm 20-25 Trung bình
4 Lúa cứng cơm >25 Cao
Độ trở hồ
Theo phƣơng pháp của Jenning et al., (1979)
- Chuẩn bị hai mẫu cho mỗi giống đƣợc thử, mỗi mẫu lấy 6 hạt gạo, cạo sạch lớp cám, chọn hạt không bị nứt, để vào đĩa petri.
- Thêm 10 ml KOH 1,7% vào mỗi đĩa.
- Sắp xếp các hạt dang đều ra để mỗi hạt có đủ chỗ nở lan ra. - Đậy đĩa petri, để yên khoảng 23 giờ ở nhiệt độ phòng.
- Đánh giá độ trở hồ của hạt gạo theo Jenning et al., (1979), đƣợc trình bày ở Bảng 2.5.
Bảng 2.5 Bảng phân cấp độ trở hồ (Jenning et al., 1979)
Cấp Độ lan rộng Độ trở hồ
1 Hạt gạo còn nguyên. Cao
2 Hạt gạo phòng lên. Cao
3 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên hay rõ nét. Cao
4 Hạt gạo phòng lên, viền còn nguyên và nở rộng. Trung bình 5 Hạt rã ra, viền hoàn toàn nở rộng. Trung bình
6 Hạt tan ra hòa chung với viền. Thấp
Cấp trung bình sẽ đƣợc tính theo công thức: Cấp trở hồ = N n xi Trong đó: xi: cấp độ trở hồ n: số hạt có cấp độ trở hồ xi N: số hạt thử nghiệm Độ bền thể gel
Theo phƣơng pháp của Tang et al., (1991). * Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu
- Tách vỏ trấu và đo độ ẩm hạt gạo.
- Nghiền mịn và cân mẫu (100 mg với ẩm độ 12%). * Bƣớc 2: Hòa tan mẫu
- Thêm 0,2 ml ethanol 95% có chứa 0,025 thymol blue. - Thêm 2 ml KOH 0,2N. Sau đó khuấy đều bằng máy vortex.
- Đậy nắp kỹ và đun trong nồi cách thủy (nhiệt độ là 100oC) khoảng 5 phút. - Lấy ra, để yên trong 5 phút và sau đó làm lạnh trong tủ lạnh khoảng 20 phút.
* Bƣớc 3: Đọc và ghi kết quả
- Để ống nghiệm nằm ngang trên bề mặt phẳng, để gel chảy từ từ, sau một giờ tiến hành đo chiều dài thể gel (từ đáy đến mí của thể gel).
- Đánh giá độ bền thể gel theo thang điểm của IRRI (1996) ở Bảng 2.6.
Bảng 2.6 Phân cấp độ bền thể gel (IRRI, 1996)
Cấp Chiều dài thể gel (mm) Loại độ bền thể gel
1 80 – 100 Rất mềm
3 61 – 80 Mềm
5 41 – 60 Trung bình
7 35 – 40 Cứng
Thí nghiệm 4: Trắc nghiệm khả năng kháng rầy của giống chống/dòng lúa chịu mặn.
Cách tiến hành
+ Chuẩn bị khay bùn: Bùn đƣợc cho vào khay, khay bùn đƣợc chuẩn bị trƣớc một ngày để mặt bùn đƣợc khô ráo, thuận tiện cho việc gieo hạt.
+ Thực hiện: Sử dụng giống lúa chuẩn kháng BN2 và giống chuẩn nhiễm TN1 làm đối chứng và các giống lúa muốn thử rầy. Dùng kẹp gắp các hạt lúa vừa nảy mầm cho vào khay bùn mịn có kẻ hàng, mỗi hàng gắp 15 hạt lúa. Khi mạ đƣợc 2-3 lá mầm thì tiến hành thả rầy 1-2 tuổi với mật độ 3-5 con/cây và theo dõi đánh giá.
+ Chỉ tiêu theo dõi: Tiến hành lấy chỉ tiêu khi giống chuẩn nhiễm TN1 vừa chết hết do rầy gây hại, khả năng kháng rầy đƣợc đánh giá theo tiêu chuẩn đánh giá quốc tế IRRI (1981) ở Bảng 2.7.
Bảng 2.7 Đánh giá khả năng kháng rầy theo tiêu chuẩn quốc tế (IRRI, 1981)
Thí nghiệm 5: điện di protein tổng số các giống chống/dòng lúa đƣợc chọn.
Phương pháp điện di protein tổng số
Đƣợc tiến hành theo phƣơng pháp điện di protein SDS-PAGE (Sodium Dodecyl Sunfate Polyacrylamide Gel Electrophoreis).
* Bƣớc 1: Chuẩn bị mẫu
− Lấy 10 hạt gạo nghiền mịn, cân chính xác 3 mg tinh bột vào ống tuýp. − Thêm 100 µl dung dịch ly trích vào mỗi ống tuýp, để qua đêm.
− Khuấy cho đều, sau đó ly tâm 14.000 vòng/phút trong 3 phút. * Bƣớc 2: Đổ gel
Đổ gel theo công thức đƣợc trình bày nhƣ Bảng 2.8.
Cấp bệnh Đánh giá Biểu hiện
0 Rất kháng Không thiệt hại
1 Kháng Thiệt hại nhẹ
3 Hơi kháng Lá thứ 1 và thứ 2 của hầu hết các cây bị vàng 1 phần 5 Hơi nhiễm Cây vàng, phân nữa số cây héo hoặc chết
7 Nhiễm Hơn phân nữa số cây chết, còn lại còi cọc nặng 9 Rất nhiễm Tất cả mọi cây đều chết
Bảng 2.8. Công thức pha dung dịch tạo một gel
Hóa chất (1 gel) 12% gel phân tách
(ml)
5% gel cô mẫu (ml) Nƣớc cất 1,6 0,68 30% Acrylamide 2,0 0,17 1,5M Tris H (pH= 8,8) 1,3 - 1M Tris HCl (pH=6,8) - 0,13 10% SDS 0,1 0,04 10% Amonium persulfate 0,05 0,01 TEMED 0,002 0,001 * Bƣớc 3: Tiến hành điện di
− Bơm 10 µl dung dịch ly trích protein vào mỗi giếng của gel. − Cho 1 giọt chất chỉ thị màu Bromophenol vào mỗi gel.
− Chỉnh đến 20 V đối với gel cô mẫu và 60 V đối với gel phân tách. − Ngừng điện di khi chất chỉ thị cách đáy gel từ 0,5-1 cm.
* Bƣớc 4: Nhuộm và rửa gel
− Gel đƣợc nhuộm bằng dung dịch Cooomassie Brilliant Blue R-250 0,2%, lắc nhẹ trong 30-45 phút.
− Loại bỏ thuốc nhuộm. − Rửa gel bằng Microwave.
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN