2. Những nghiên cứu về hoá họ c
2.3.2. Về thành phân hoá học
2.3.2.I. Xác định hàm lượng tinh dầu trong quả [15]
- Nguyên tắc : Tách tinh dầu ra khỏi dược liệu bằng phương pháp cất kéo hơi nước. Từ lượng tinh dầu thu được so với khối lượng dược liệu ta tính được
hàm lượng tinh dầu trong dược liệu.
Hàm lượng tinh dầu trong dược liệu được tính theo công thức sau: + Áp dụng cho tinh dầu có tỉ trọng lớn hơn 1
X°/o = ^—^ x lO O
b
Trong đó:
a: thể tích dầu đọc sau khi cất (ml) b: Khối lượng dược liệu đã trừ độ ẩm (g) c: thể tích Toluen (TT) cho vào tinh dầu
- Dụng cụ:
. Nồi cất tinh dầu . Ong hứng . Bình gạn . Bình đựng
- Cách tiến hành và kết quả (Bảng): Cân dược liệu chính xác 1000 g dược liệu, cho vào nồi cất tinh dầu hồi lưu (có cải tiến). Cho nước vào vừa đủ ngập dược liệu, cất kéo hơi nước cho đến khi hàm lượng tinh dầu không tăng lên nữa (khoảng 5-6 giờ), để ngoại, đọc kết quả hàm lượng tinh dầu thu được (tiến hành 7 mẻ). Kết quả ở bảng sau
Bảngl: Kết quả xác định hàm lượng tinh dầu trong quả SỐTT Khối lượng dược liệu (g) Thể tích tinh dầu (ml) Độ ẩm % (Thể tích Toluen) Hàm lượng tinh dầu % 1 1000 241.5 11.5 24.431 2 1000 243.5 12.6 24.661 3 1000 243 12.7 24.613 4 1000 241 11.3 24.375 5 1000 242.4 11.2 24.515 6 1000 244.6 11.9 24.755 7 1000 244 12.3 24.704 Giá trị trung bình 1000 242.85 11.92 24.57
- Cách xác định độ ẩm trong quả
Cho vào bình cầu đã được làm khô 200ml toluen, 2ml nước, Lắp dụng cụ ( đã được sấy khô). Cất khoảng 2giờ. Để nguội trong 30 phút, đọc thể tích nước cất được ở ống hứng, chính xác đến 0.05 ml
Thêm vaò bình cầu cân dược liệu lOg . Đun nóng nhẹ trong 15 phút, khi toluen đã bắt đầu xôi thì điều chình nhiệt độ để cất với tốc độ 2 giọt trong 1 giây, khi đã cất được phần lớn nước sang ống hứng thì nâng tốc độ cất lên 4 giọt trong một giây. Tiếp tục cất khi cho đến mực nước cất được trong ống hứng không tăng lên nữa. Dùng 5-10 ml toluen rửa ống sinh hàn, cất thêm 5 phút nữa, tách bộ phận cất ra khỏi nguồn nhiệt. Nếu còn có những giọt nước đọng lại trên thanh ống sinh hàn thì dùng 5 ml toluen để rửa kéo xuống. Khi lớp nước và lóp toluen đã được phân tách hoàn toàn, đọc thể tích nước trong ống hứng, độ ẩm của dựơc liệu được tính theo công thức sau:
V — V
x%= 2 ' xioo
p
V1: số ml nước cất đựơc sau lần cất đầu V2: số ml nước cất được sau lần cất thứ 2 p : số g mẫu đã cân đem thử
x% = — — xioo
10
= 12%
Nhận xét: Hàm lượng tinh dầu trong quả khô tuyệt đối của Xuyên tiêu là 24,57%, và độ ẩm của dược liệu tính đựơc là 11,92%
+ Phân tích tinh dầu bằng sắc ký lớp mỏng và GC/MS • Phương pháp SKLM
* Dung cụ:
• Bình triển khai
• Đèn tử ngoại, phát các bước xạ có bước sóng 254 nm và bước sóng dài 366 nm.
• Tủ sấy điều nhiệt để hoạt hoá và sấy bản mỏng và sắc ký đồ • Tủ hút hoi độc.
• Máy ảnh tốt
• Tủ lạnh để bảo quản những thuốc thử dễ hỏng • Micropipet nhiều cỡ
• Bản mỏng tráng sẵn chất hấp phụ • Dung môi triển khai
Toluen : Ethyl acetat (9 : 1)
ánh sáng thường Bước sóng 254 nm
• Phân tích tỉnh dầu Zanthoxylum sp bằng phương pháp GCMS 1. Chuẩn bị dung dịch thử:
Hoà 1 ịil tinh dầu vào n-Hexan (Merck), lắc kỹ được dung dịch có nồng độ 0,1%.
2. Điều kiện chạy máy sắc ký khí khối phổ: máy sắc ký khí khối phổ Shimadzu QP2010.
Cột sắc ký khí DB- 5 MS (30 m X 0.25mm ID)
Khí mang He
Tỉ lệ m/z từ 40 - 200
Nhiệt độ Detector : 200°c.
Chương trình nhiệt độ: 55 - 200°c ; tốc độ tăng 7°c/phút. Thể tích tiêm mẫu: 1 |il
Hệ số tách dòng: 40.
3. Đánh giá kết quả:
Xác định và tính tỉ lệ % các chất trong tổng số 20 chất bay hơi có trong tinh
Hình 2: Sắc ký đồ sắc ký khí khối phổ tinh dầu Zanthoxylum sp
Bảng 2 : Kết quả phân tích tinh dầu sơ bộ bằng GCMC STT Tên hợp chất Định cao pic Hàm lượng % tinh dầu Ghi chú 1 .ALPHA.-PINENE 8.181 8.94 2 .beta.-Myrcene 10.536 4.90 3 L- Phellandrene 11.266 31.06 1 4 •DELTA.3-Carene 11.344 0.57 5 .ALPHA. TERPINENE 11.738 0.43 6 L-Phellandrene 12.094 0.99 7 Bomylene 12.321 19.24 3 8 .beta.-Phellandrene 12.385 20.50 2 9 Cis-Ocimene 12.695 2.56 10 .DELTA.3-Carene 13.233 7.29 11 •DELTA.-CARENE 15.132 0.21 12 Linalool 15.738 0.32 13 NEO-ALLO-OCIMENE 16.640 0.23 14 4-Terpineol 18.022 0.25 15 .BETA.FENCHYL ALCOHOL 18.359 0.33
16 Decanal (CAS) n-Decanal 18.596 0.17
17 n-Octyl acetate 18.673 0.21
18 Nerol 19.447 0.24
19 Linalyl acetate 21.475 0.97
- Kết quả phân tích thành phần tinh dầu sau khi cất bằng GCMS đã xác định 20 thành phần tinh dầu trong Zanthoxylum sp. Cho Pic phổ và hàm lượng phần trăm cao nhất là L- Phellandrene, .beta.-Phellandrene và Bomylene.
23.2.2. Định tính các nhóm chất chính trong dược liệu A. Các nhóm chất trong quả
Khi phân tích hoá học tinh dầu, trong phần định tính xác định các nhóm chất chính chúng tôi tiến hành trên các mẫu của quả Mạckhèn
• Đinh tính Flavonoid
Lấy 20g dược liệu cho vào bình dung tích 250ml có nút mài, thêm vào đó cồn etylic 90° cho ngập dược liệu, lắc và để yên qua đêm. Lọc qua giấy lọc gấp nếp lọc lấy dịch lọc, cô đặc cách thuỷ cho còn 15ml để tiến hành các phản ứng.[7]
# Phản ứng với hơi amoniac NH3
Nhỏ 1-2 giọt dịch chiết trên lên mảnh giấy lọc để khô, quan sát dưới ánh sáng thường có màu vàng nhạt, sau đó hơ lên miệng lọ amoniac đặc thấy màu vàng đậm lên rõ rệt, khi đó soi dưới đèn tử ngoịa thấy co huỳnh quang màu vàng sáng. Kết quả: (++) phản ứng dương tính thời gian hiện màu nhanh hơn, cường độ màu trung bình.
# Phản ứng Cyanidin:
Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm một ít bột Mg, nhỏ vào đó vài giọt HC1 đậm đặc. Đun cách thuỷ vài phút lớp dịch chiết xuất hiện màu hồng nhạt.
Kết quả: (++) phản ứng dương tính thời gian hiện màu nhanh, cường độ màu trung bình
# Phản ứng với FeCl3 5%
Lấy 2ml dịch chiết cho vào ống nghiệm, thêm vào đó 2-3 giọt DD FeCl35%
Kết quả: (++) phản ứng dương tính thời gian hiện màu nhanh, cường độ màu trung bình
Nhân xết: từ kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định trong dược liệu có chứa Flavonoid.
# Đinh tính Courmarin:
Lấy 20g nguyên liệu cho vào bình dung tích 250ml có nút mài, thêm vào đó cồn etylic 90° cho ngập dược liệu, lắc và để yên qua đêm. Lọc lấy dịch chiết, cô đặc cách thuỷ cho còn 20ml để tiến hành các phản ứng: [7]
# Phản ứng mở, đóng vòng lacton
Cho vào 2 ống nghiệm, mỗi ống 1 -2ml dịch chiết cồn từ dược liệu, ống thứ 1 cho thêm 0,5ml NaOH 10%, rồi đun cách thuỷ cả 2 ống (ống có Courmarin thường có màu vàng xuất hiện). Để nguội, thêm vào mỗi ống 4ml nước cất, nếu ống thứ 1 trong hơn ống thứ 2 nhưng sau đó acid hoá mà đục hoặc có kết quả như
ống thư 2 thì sơ bộ xác định có courmarin.
Nhân xét: kết quả định tính , sơ bộ nhận định trong dược liệu có Courmarin
# Phản ứng ghép đôi với muối Diazoni
Cho vào ống nghiệm l-2ml dịch courmarin trong cồn, thêm 3ml DD Na2C 03 2%. Đun cách thuỷ rồi để nguội thêm vào dung dịch vài giọt thuốc thử
Diazo, có thể dùng thuốc thử Diazi của Paranitroanilin hoặc của acid Sulíanilic màu bền và màu thay đổi tuỳ theo cấu trúc từ vàng, cam, đỏ cam, hồng, đỏ.
- Vi thăng hoa: Từ dịch chiết trên, cô bay hơi hết dung môi, sau đó cho cắn vào nắp kim loại, đậy nắp kín bằng một phiến kính phía trên có bông ướt, hơ nắp
kim loại trên ngọn lửa đèn cồn 20-30 phút, lấy phiến kính ra để nguội, giỏ một giọt dung dịch KI và soi trên kính hiện vi. Thấy tinh thể hình kim.
• Định tính Anthranoid
- Phản ứng Bomtraeger [7] + Định tính dạng tự do:
Cho 0,5g bột dược liệu vào ống nghiệm lớn lOml, thêm 5ml nước cất. Đun trực tiếp với nguồn nhiệt cho đến sôi. Lọc dịch chiết còn nóng qua giấy lọc cho dịch chiết vào bịnh gạn dung tích 50ml, làm nguội dịch lọc thêm 5ml Cloroíòrm , lắc nhẹ. Gạn bỏ lớp nước giữ lớp cloroíorm để làm phản ứng:
# Lấy lml dịch ơoroíòrm cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm lml dung dịch AmoniaclO% lắc nhẹ, lóp nước sẽ có màu đỏ sim. Nếu lớp cloroírom có màu vàng chứng tỏ trong dược liệu có chứa acid chrysophanic, thêm tiếp tục từng giọt dung dịch NaC)H10%, lắc nhẹ, lớp dung môi hữu cơ sẽ mất màu vàng, còn lớp nước sẽ đỏ thẫm hơn lúc ban đầu
# Lấy lml dịch chiết cloroííom cho vào ống nghiệm nhỏ. Thêm lml DD NaC)H10%, lắc nhẹ, Lớp nước sẽ có màu đỏ sim.
Nhân xét: kết quả định tính, sơ bộ nhận định trong duợc liệu không có anthranoid
• Định tính alcaloid
- Cho lOg bột dược liệu vào cốc thuỷ tinh, thấm ẩm dược liệu bằng dung dịch H2S043%. Sau 15 phút chuyển dược liệu đã thấm ẩm qua bình ngấm kiệt
cho tiếp DD H2S043% ngâm qua đêm rồi chiết bằng phương pháp ngấm kiệt, thu được dịch chiết acid. Kiềm hoá dịch chiết acid bằng dung dịch NH4OH đậm đặc đến pH= 9-10 (thử bằng chỉ thị màu vàng năng)
# DD đã kiềm hoá chiết 3 lần bằng cloroữom, lần đầu 15ml, 2 lần sau mỗi lần 5ml. Gộp các dịch chiết lại, cô cách thuỷ bay hơi cloroírom còn khoảng 6ml rồi chia đều vào 3 ống nghiệm. Cô tiếp đến cắn.
# Cho vaò 3 ống nghiệm chứa cắn mỗi ống lml DD H2S043%, lắc cho tan hết cặn rồi cho thêm vào: [7]
. ống 1: 2-3 giọt thuốc thử Mayer thấy xuất hiẹn tủa trắng.
. Ống2: 2-3 giọt thuốc thử Dragendorff thấy xuất hiện tủa vàng cam. . Ống3: 2-3 giọt thuốc thử Bouchardat thấy xuất hiện tủa nâu.
Nhân xét: Từ kết quả định tính trên, sơ bộ nhận định trong dược liệu có chứa alcaloid.
• Định tính Saponin
Lấy 20g dược liệu đã tán nhỏ cho vào bình có dung tích 250ml, thêm vào đó lOOml cồn etylic 75°, lắc mạnh trong 15', để qua đem lọc lấy dịch chiết làm các phản ứng sau: [7]
# Phản ứng Sankowski: Lấy lml dịch chiết cho vào ống nhgiệm, cô các thuỷ đến khô, hoà tan cắn trong cồn etylic 90°, nhỏ từ từ theo thành ống nhgiệm DD acid H2S04 đặc xuất hiện vàng đỏ nâu, màu đỏ chuyển dần lên dịch chiết ở phía
trên có màu xanh.
# Phản ứng Rozentaler: Lấy lml dịch chiết vào ống nhgiệm, thêm vài giọt thuốc thử Vanilinl% trong HC1 và hâm nóng, quan sát thấy xuất hiện màu hoa cà.
# Quan sát hiện tượng tạo bọt: Lấy lml dịch chiết cho vào ống nghiệm và thêm 5ml nước cất, lắc mạnh trong 5 phút, để yên thấy bọt bền vững.
# Tạo bọt ở pH khác nhau: Lấy 2 ống nghiệm, 1 ống đựng 5ml HC1 0,1N còn ống kia đựng 5ml DD NaOH 0,1N, cho vào mỗi ống 0,5ml dịch chiết, lắc cả 2 ống trong 5 phút thấy cột bọt 2 ống cao bằng nhau và có độ bền vững như nhau. Nhân xét: Sơ bộ kết luận trong mẫu nghiên cứu không có Saponin triterenoid.
Bảng 3 : tóm tắt kết quả định tính của quả Zanthoxylum
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả
Kết luận sơ bộ
1 Flavonoid Pư Cyanidin +++ Có Flavonoid
Pư với kiềm +++
Pư với FeCl35% +++
2 Coumarin Pư mở đóng vòng ++ Có Coumarin
lacton
Pư Diazo hoá ++
Pư vi thăng hoa —
3 Anthranoỉd Pư Bortraeger — Không có
Anthranoid
4 alcaloỉd T.T Mayer — Không có alcaloid
T.T Bouchardat _
T.T Đragenorff —
5 Saponỉn Pư Sankowski — Không có Saponin
Pư Rozentaler _
Tạo bọt —
Ghi cl
(+): phản ứng dương tính, thời gian hiện màu chậm, cường độ màu yếu
(++): Phản ứng dưong tính, thời gian hiẹn màu nhanh, cường độ màu trung bình (+++): phản ứng dương tính, thời gian hiện màu ngắn, cường độ màu mạnh. (-): phản ứng âm tính
Kết luận: Định tính được trong quả dược liệu có Flavonoid, Coumarin và không có Anthranoid, Alcaloid và Saponin.
B. Các nhóm chất trong rễ
Các bước tiến hành giống mục A
Bảng 4 : tóm tắt kết quả định tính của rễ Zanthoxylum
STT Nhóm chất Phản ứng định tính Kết quả
Kết luận sơ bộ
1 Flavonoid Pư Cyanidin — Không có
Pư với kiềm _ Flavonoid
Pư với FeCl35% —
2 Coumarin Pư mở đóng vòng
lacton
Pư Diazo hoá Pư vi thăng hoa
++
++
Có Coumarin
3 Anthranoid Pư Bortraeger — Không có
Anthranoid 4 alcaloỉd T.T Mayer T.T Bouchardat T.T Đragenorff +++ +++ ++,+ Có alcaloid
5 Saponin Pư Sankowski
Pư Rozentaler Tạo bọt ++ ++ ++ Có Saponin Ghi c
(+): phản ứng dương tính, thời gian hiện màu chậm, cường độ màu yếu
(++): Phản ứng dưong tính, thời gian hiẹn màu nhanh, cường độ màu trung bình (+++): phản ứng dương tính, thòi gian hiện màu ngắn, cường độ màu mạnh. (-): phản ứng âm tính
Qua kết quả trên chung tôi thấy nhóm chất Flavonoid là nhóm chất cho phản ứng rõ nhất trong dược liệu quả và trong rễ là nhóm chất Acaloid là nhóm chất cho phản ứng rõ nhất. Do đó chung tôi đi sau vào nghiên cứu nhóm chất Flavonoid.
c. Phân tích sơ bộ một nhóm chất chính trong dược liệu- Nhóm Flavonoid- Chiết xuất Flavonoid toàn phần - Chiết xuất Flavonoid toàn phần
Lấy dược liệu 2g ngâm bằng ethanol 90° cho ngập dược liệu, đậy kính, ngâm ở nhiệt độ phòng. Sau 14 ngày rút dịch chiết đầu, dược liệu được vắt kiệt dung môi, bã còn lại thêm ethanol chiết tiếp lần 2. Dịch chiết thu được cất thu hồi dung môi dưới áp suất giảm bằng máy cất quay ở 40°c được dịch chiết đậm đặc khoảng 150 ml đi cô đặc cách thuỷ đến cắn, hoà tan cắn với nước cất nóng 20 ml làm 3 lần lọc nóng qua giấy lọc, dịch lọc lắc với Cloroform, phần nước còn lại để chiết tách ílavonoid toàn phần bằng ethylacetat. Từ dịch chiết còn lại sau khi lắc với Ethylacetat, chúng tôi đã thu được chất kết tinh màu vàng nhạt, ký hiệu sơ đồ 1
- Tiến hành SKLM Flavonoid toàn phần * Các bước tiến hành:
+ Chuẩn bị chất chấm SK: Dịch chiết tách Flavonoid toàn phần
+ Chất hấp phụ: bản mỏng tráng sẵn Silicagen GF 254 chuẩn ở hãng MERCK. Bản mỏng được hoạt hoá ở 110°c trong lgiờ, cắt thành bản 2 xio (cm)
+ Cô đặc dịch chiết rồi dùng mao quản chấm lên bản mỏng Silicagen + Dung môi triển khai:
Toluen: ethylacetat: acid íormic: nước (6:15:2:1)
+ Thuốc thử hiện màu: hơi amoniac, phun bằng Vanilin trong ethanol và H2S04 đặc
Sau khi triển khai SK, bản mỏng được để ngoài không khí hoặc sấy nhẹ cho bay hơi hết dung môi. Hệ dung môi này là hệ cho kết quả tách tốt nhất với 7 vết Flavonoid.
# Kết quả phân tích ảnh chụp ở ánh sáng thường
Bảng 5: Giá tri Rf và độ đậm các vết Flavonoid
Vết Rf(x 100) Màu Độ đậm VI 12,8 Vàng da cam +++ V2 22,8 Vàng da cam +++ V3 27,1 Vàng da cam +++ V4 34,3 Vàng da cam +++ V5 45,7 Vàng da cam + V6 55,7 Vàng da cam ++ V 7 65,7 Vàng da cam +++
# Kết quả phân tích chụp ảnh ở ánh sáng tử ngoại, phát các bước xạ có bước sóng ngắn 254nm.
Bảng 6: Giá trị Rf và độ đậm các vết Flavonoid ở ánh sáng tử ngoại 254nm
Vết Rf(x 100) Màu Độ đậm VI 11.4 Vàng da cam ++ V2 22,8 Vàng da cam ++ V3 27,1 Vàng da cam ++ V4 34,2 Vàng da cam ++