3. Nhiệm vụ nghiên cứu
1.2.3.Giá trị về dược liệu của các loài Poplyporaceae
Nấm hương (Lentinula edodes) chứa khá nhiều đạm và đặc biệt giàu khoáng chất, vitamin, chẳng hạn như vitamin C, B, tiền vitamin D, canxi, niacin, nhôm, sắt, magiê... Nó có khoảng 30 enzym và tất cả các axit amin tối cần cho cơ thể (tức là những acid amin mà cơ thể không tổng hợp được). Nấm cũng có một số alcool hữu cơ mà khi nấu chín, các alcool này biến đổi, tạo thành mùi thơm đặc biệt của nó. Thành phần hoá học: Trong 100g nấm đã sấy khô có12,5g chất đạm, 1,6 g chất béo, 60g chất đường, 16 mg can-xi, 240 mg kali và 3,9g sắt, các vitamin [2].
Các nhà khoa học đã chiết xuất được chất Lentinan và Lentinula Edodes mycelium (LEM) từ nấm hương. Đây là 2 chất chính tạo nên tác dụng dược lý của loại nấm này. Một nghiên cứu tại Nhật cho thấy, những bệnh nhân ung thư đang hóa trị nếu dùng thêm Lentinan thì hiệu quả hóa trị sẽ tăng lên, khả năng sống sót cao hơn và sự tiến triển của ung thư sẽ bị kìm hãm. Vì vậy ở Nhật, Lentinan đã được chấp nhận như một liệu pháp phụ trợ trong tiến trình dùng hóa trị liệu.
Nấm Vân Chi có tên khoa học là Trametes versicolor, đây là loại nấm dược liệu quý hiện đã được sử dụng tại Trung Quốc từ cách đây trên 2000 năm và hiện nay đã có thể nuôi trồng thành công với kỹ thuật đơn giản tại Việt Nam. Các nhà khoa học tìm thấy trong nấm Vân Chi loại hợp chất đa đường PSK (polysaccharide loại Krestin) và loại đạm-đa đường PSP (polysaccharopeptid PSP) có tác dụng ức chế tế bào ung thư và nâng cao hoạt tính miễn dịch của cơ thể. Vì vậy người ta dùng nấm Vân Chi để chữa bệnh viêm gan do virút HBV và hạn chế quá trình phát
triển của ung thư gan và nhiều loại ung thư khác. Trametes hirsuta cùng một chi với nấm Vân chi, có tác dụng kháng nấm, kháng khuẩn. [2]
Polyporus officinalis Fries là một nấm không có chân, vị thoạt tiên hơi ngọt, dần trở nên đắng và chát… Nó không có mùi nhưng gây bứt rứt mạnh trong họng khi ta hít phải bụi của nó. Đó là một chất tẩy mạnh gây đau bụng dữ dội, buồn nôn, nôn, mà nay gần như không được sử dụng nữa. [4]
Bạch linh hay phục linh- tên khoa học: Poria cocos Wolf.. thường mọc trên cây thông, có tác dụng lợi tiểu, tăng khả năng miễn dịch, có tác dụng kháng ung thư, an thần, có tác dụng hạ đường huyết, bảo vệ gan và chống lóet bao tử. Nước sắc Phục linh có tác dụng ức chế đối với tụ cầu vàng, trực khuẩn đại tràng, trực khuẩn biến dạng. Cồn ngâm kiệt thuốc có tác dụng giết chết xoắn khuẩn. [2]
Trư Linh (Polyporus umbellatus (Pers.)) thường mọc ở độ cao 1200–1500m, có tác dụng chữa tiểu tiện, thông lợi, phù thũng, tiêu chảy, đái rắt, tiểu đục. [2]
Fomes officinalis Ames là một loại nấm mọc gỗ được tìm thấy trên các thân cây sống hay đã chết trong rừng cây kim ở các khu vực phía bắc của Trung Quốc, Thái Bình Dương, tây bắc Hoa Kỳ, Canada và châu Âu. Được những người Hy Lạp cổ đại sử dụng để điều trị bệnh lao, một số người dân bản địa dùng để điều trị thủy đậu. Người Trung Quốc sử dụng để điều trị ho và hen suyễn. [33]
1.3. Đối tượng nghiên cứu1.3.1 Phân loại khoa học 1.3.1 Phân loại khoa học
Giới (regnum) : Nấm (Fungi)
Ngành (divisio) : Basidiomycota
Lớp (class) : Basidiomycetes
Bộ (ordo) : Polyporales
Họ (familia) : Polyporaceae
Chi (genus) : Nigrofomes
Tên tương tự: Polyporus melanoporus Mont., Fomes melanoporus (Mont.) Cooke, Phellinus melanoporus (Mont.) G. Cunn., Polyporus endophaeus Berk.,
Polyporus melanoporus Lloyd
1.3.2. Đặc điểm sinh học [33]
Quả có dạng hình dấu ngoặc, không có cuống. Nấm này mọc trên gỗ, thường gắn trực tiếp vào cây. Rộng khoảng 15 cm, dày 3 khoảng cm, bề mặt phía trên hơi mịn, sờ thấy nháp, phân thành các vòng trần, có vân màu trắng ở mép ngoài, có vỏ dai chắc. Màu quả thể khi non thường màu nâu. Đối với những quả thể già thường không có các vòng rõ ràng từ màu nâu xám chuyển sang màu nâu đen, nhưng màu trắng ở mép ngoài không thay đổi.
Hình 1.12: Nigrofomes melanoporus khi non và khi già
Thường mọc đơn, không ăn được. Chúng thường ký sinh trên các cây gỗ, gây ra bệnh thối trắng, giết chết cây chủ, sống một năm.
Lỗ chân lông vòng có đường kính bằng nhau khoảng 6-10 mm, ống cùng màu với bề mặt lỗ chân lông, sâu lên đến 0,5 cm.
Hình 1.13: Nigrofomes melanoporus. a. bào tử; b. sợi nấm sinh sản; c. xương sợi nấm; d. nang nấm
- Bào tử thường có dạng hình elip (hình trứng), màu nâu đỏ, kích thước 8-13 x 5,5-9 µm, chủ yếu là khoảng 10 x 6.5 µm.
- Đảm phồng, hình elip, trông ngắn, cụt, kích thước 12-32 × 6-10 µm, vách dày, màu nâu, các bào tử trong và bào tử ngoài được ngăn cách bởi các vách ngăn.
1.3.3. Phân bố
Nấm này đã được tìm thấy ở một vài vùng trên thế giới như New Zealand, Australia, Papua New Guinea, Malaysia, GQ, Costarica, Việt Nam.
1.3.4. Thành phần hóa học
Qua tìm hiểu tài liệu, cho đến nay chưa có công trình nào nghiên cứu về thành phần hóa học của các loài trong chi Nigrofomes cũng như loài Nigrofomes melanoporus.
Chương 2. THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu
2.1.1. Các phương pháp xử lý mẫu và chiết (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Mẫu nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.
2.1.2. Các phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất hợp chất
Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:
- Sắc ký cột được thực hiện trên chất hấp phụ silica gel theo cơ chế sắc ký hấp phụ và được sử dụng để phân tách các phần chiết, phân lập và tinh chế các hợp chất thiên nhiên, sử dụng silicagel cỡ hạt 230 - 400/mesh.
- Sắc ký lớp mỏng (TLC) được sử dụng để phân tích định tính các phần chiết, định hướng phân tách các phần chiết, đặc trưng các hợp chất và kiểm tra độ sạch của các hợp chất phân lập. Sắc ký lớp mỏng phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm. Phát hiện vệt chất bằng hơi iot và đèn tử ngoại ở bước sóng λ = 254 nm.
- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.
2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất
Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:
- Phổ hồng ngoại IR
- Phổ khối lượng phun mù electron (ESI - MS). - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR. - Phổ DEPT.
- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân HSQC, HMBC, - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân COSY, NOESY
2.2. Thực nghiệm.
2.2.1. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị2.2.1.1. Hoá chất 2.2.1.1. Hoá chất
Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton, nước cất.
2.2.2.2. Dụng cụ và thiết bị
Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3.
Phổ khối lượng EI-MS được ghi trên máy HP 5989 B-MS với năng lượng bắn phá ở 70 eV và phổ ESI-MS đo trên máy LC-MS-Trap-00127.
Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 500MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY được đo trên máy Bruker 125 MHz. Với tetrametylsilan (TMS) là chất chuẩn nội zero (δ = 0). Độ chuyển dịch hoá học δ được biểu thị bằng ppm. Tính bội của các tín hiệu 13C được xác định trên cơ sở các phổ DEPT 90 và DEPT 135.
2.2.2. Nghiên cứu các hợp chất 2.2.2.1. Thu mẫu
Mẫu Nigrofomes melannoporus được thu hái tại Vườn Quốc gia Pù Mát- Nghệ An vào tháng 11/2009, được TS Ngô Anh (thuộc khoa Sinh, trường Đại học Huế) định danh, tiêu bản (Vin- TSWu-200901) được lưu giữ tại khoa Sinh, Đại học Vinh.
2.2.2.2. Phân lập các hợp chất
Mẫu nấm phơi khô (1350 g) được ngâm ba lần với dung môi clorofom- metanol (1:1, v/v) ở nhiệt độ thường. Sau khi cất thu hồi dung môi bằng máy cất quay chân không các dịch chiết thu được cặn chiết với khối lượng 78 g (cao tổng). Để phân lập từng chất ra khỏi hỗn hợp đã sử dụng các phương pháp sắc kí cột, chất
hấp phụ dùng là silicagel Merck 60 pha thường có cỡ hạt 0,040 – 0,063 mm, các hệ dung môi rửa giải thích hợp và thường phải lặp lại nhiều lần.
Lượng căn chiết này được sắc ký cột silica gel (1 kg, 80 × 8 cm) với hệ dung môi rửa giải n-hexan-axeton (100:0, 50:1, 20:1, 10:1, 2:1, 1:1 mỗi hệ dung môi sử dụng 1 lít) thu được 10 phân đoạn.
Bảng 2.1. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột cao tổng
Số thứ tự Hệ dung môi Tỉ lệ Phân đoạn
1 Hexan:axeton 100:0 F1 2 Hexan:axeton 70:1 F2 3 Hexan:axeton 50:1 F3 4 Hexan:axeton 30:1 F4 5 Hexan:axeton 20:1 F5 6 Hexan:axeton 15:1 F6 7 Hexan:axeton 9:1 F7 8 Hexan:axeton 4:1 F8 9 Hexan:axeton 2:1 F9 10 Hexan:axeton 1:1 F10
Phân đoạn 3 có khối lượng 5,4 g được tiến hành sắc ký silica gel lần thứ hai với loại cột nhỏ (200 g, 40 × 5 cm), hệ dung môi rửa giải clorofom-metanol (100:0, 50:1, 10:1, 2:1, 1:1, mỗi hệ dung môi sử dụng 250mL) thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn F3-3 (74 mg) được tách bằng sắc ký cột được chất A (12 mg) và
Bảng 2.2. Hệ dung môi rửa giải sắc ký cột phân đoạn F3 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phân lập và tinh chế các hợp chất từ nấm Nigrofomes melannoporus được thực hiện theo sơ đồ 2.1.
Sơ đồ 2.1: Phân lập các hợp chất trong nấm Nigrofomes melannoporus
Số thứ tự Hệ dung môi Tỉ lệ Phân đoạn
1 Clorofom:metanol 100:0 F3-1 2 Clorofom:metanol 50:1 F3-2 3 Clorofom:metanol 30:1 F3-3 4 Clorofom:metanol 20:1 F3-4 5 Clorofom:metanol 10:1 F3-5 1350 g (mẫu khô)
ngâm chiết với MeOH
F1 F2 2.4 g F3 F4 F5 F6 Cao MeOH (78g) F7 F8 F9 F10 Hexan-axeton (100:0 - 1:1) A B F3-1 F3-2 F3-3 (58 mg) F3-4 F3-5
2.2.3. Dữ kiện về tính chất vật lý và phổ của hợp chất A
Hợp chất A (Madolin A): tinh thể không màu hình kim. Phổ UV (MeOH) λmax nm: 264. IR (KBr) νmax (cm-1): 2920, 2853, 1673, 1630, 1453, 1066. Phổ ESI-MS m/z 257 [M+Na]+. Phổ 1H-NMR (400MHz, CDCl3) (δ ppm): 9,37 (1H, s, CHO); 6,47 (1H, d, J =9,4 Hz, H-5); 2,95 (1H, dd, J = 8,1, 3,0 Hz, H-1); 2,77 (1H, dt, J = 13,3, 4,4, 3,9 Hz, H-3a); 2,38 (1H, td, J= 9,9, 3,6 Hz, H-3b); 2,23 (1H, dq, J= 14,4 Hz, H-2a); 2,15 (1H, m, H-9a); 1,90 (1H, m, H-8a); 1,68 (1H, dd, J = 10,10 Hz, H-6); 1,26 (1H, m, H-2b); 1,24 (3H, s, H-13), 1,19 (3H, s, H-12), 1,07-1,13 (1H, m, H-9b), 1,07-1,13 (1H, m, H-8b), 1,07-1,13 (1H, m, H-7), 0,93 (1H, s, H-15). Phổ 13C-NMR (400 MHz, CDCl3) (δ ppm): 193,6 (C-14), 154,6 (C-5), 144, 1(C-4), 62,9 (C-1), 59, 9 (C-10), 40,0 (C-9), 38,7 (C-7), 28,9 (C-6), 28,4 (C-12), 27,8 (C-2), 23,9 (C-11), 22,1 (C-8), 20,6 (C-3), 17,3 (C-15), 15,5 (C-13). Hợp chất B (dehydrovomifoliol) Dạng dầu màu vàng.
Phổ UVλmaxMeOHnm (logε): 237 (4,15). Phổ EI-MS m/z: 221 [M]+.
Phổ IRνmaxKBrcm-1:3441 (OH), 1667 (C=O), 1127 (C-O), 987 (C=C-H) cm-1. Phổ 1H-NMR (400 MHz, CD3OD) δ (ppm): 6,99 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-7), 6,42 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-8), 5,93 (1H, s, H-4), 2,60 (1H, d, J = 17 Hz, H-2b), 2,30 (3H, s, H-10), 2,27 (1H, d, J = 17 Hz, H-2a), 1,89 (3H, s, H-13), 1,05 (3H, s, H-12), 1,01 (3H, s, H-11); Phổ 13C-NMR (100 MHz, CD3OD) δ (ppm): xem bảng 3.2 .
Chương 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các hợp chất
Quả thể nấm N. melanoporus phơi khô (1350 g) được chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:CHCl3 ở nhiệt độ thường thu được cặn chiết với khối lượng 78 g (cao tổng). Lượng cặn chiết này được sắc ký trên cột silicagel, tách được các chất
A và B.
3.2. Xác định cấu trúc hợp chất A
Hợp chất A là tinh thể không màu hình kim. Phổ ESI-MS cho pic [M+Na+] 257 m/z tương ứng với công thức phân tử C15H22O2. Phổ hồng ngoại (IR) hấp thụ cực đại 2920 (OH), phổ 13C-NMR, DEPT cho thấy trong phân tử có 3 nhóm metyl, nhóm metylen, 5 nhóm methin và 3 cacbon bậc bốn. Nhóm –CH=C-CHO trong phân tử có tín hiệu hấp thụ trên phổ IR tại 1673 và 1630 cm-1, phổ UV ở 264 nm, trong phổ 1H-NMR tại δ 9,37 (1H, s, CHO) và 6,47 (1H, d, J =9,4 Hz) cùng với tín hiệu trên phổ 13C-NMR tại 193,6, 154,6 và 144,1, ngoài ra H-5 còn thể hiện sự tương tác với C-14 trong phổ HMBC và H-14 với H-5 trong COSY. Phổ NMR thể hiện sự có mặt của vòng dimetylcyclepropan với δH 1,68 (1H, dd, J = 10,10 Hz), 1,24 (3H, s), 1,19 (3H, s), 0,7-1,13 (1H, m), δC 38,7, 28,9, 28,4, 23,9, 15,5 và sự tương tác xa giữa H-12, 13 với C-6, 7 và với C-11. Ngoài ra tín hiệu phổ còn cho thấy trong phân tử có một vòng epoxi với δH 2,96 (1H, dd, J= 11,3 Hz), δC 62,8 và 59,9.
Bảng 3.1: Dữ kiện phổ 13C-NMR của hợp chất A (Madolin)
Cacbon DEPT Độ dịch chuyển hoá học (ppm)
Tài liệu Thực nghiệm
1 CH 62,8 62,9
2 CH2 27,7 27,8
3 CH2 20,5 20,6
5 CH 154,8 154,6 6 CH 28,8 28,9 7 CH 38,6 38,1 8 CH2 22,0 22,1 9 CH2 39,9 40,0 10 C 60,0 59,9 11 C 23,8 23,9 12 CH3 28,4 28,4 13 CH3 15,5 15,5 14 C 193,7 193,6 15 CH3 17,2 17,3
Dưới đây là các phổ đồ của hợp chất A
Hinh 3.2. Phổ IR của hợp chất A
Hinh 3.7. Phổ DEPT của hợp chất A
Hinh 3.10. Phổ NOESY của hợp chất A
\ Với sự phân tích phổ trên và so sánh vơi tài liệu [10] hợp chất này có tên madolin A [10]
3.2..Hợp chất B (dehydrovomifoliol) (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Hợp chất B thu được ở dạng dầu màu sáng, phổ tử ngoại UV hấp thụ cực đại ở 237 nm. Phổ khối lượng EI-MS cho pic ion phân tử ở m/z 222 [M]+ ứng với công thức phân tử C13H18O3.
Phổ 1H-NMR của hợp chất B cho thấy các tín hiệu của 1 proton vinyl ở δ
5,93 (1H, s, H-4), hai proton trans olefinic ở δ 6,42 (1H, d, J = 15,8, Hz, H-8) và 6,99 (1H, d, J = 15,8 Hz, H-7), thêm vào đó hai cặp dimetyl proton ở δ 1,01 (H-11) và 1,05 (H-12), 1 proton metyl ở δ 1,89 (H-13) nối với một liên kết đôi và 1 nhóm metyl ở δ 2,30 ppm sát với 1 nhóm carbonyl. Các tín hiệu kết cặp này ở δ 2,27 (d,
J = 17,0 Hz, H-3) và 2,60 (d, J = 17,0 Hz, H-3) gợi ý cho nhóm carbonyl nối với metylen này và cặp dimetyl được thế ở C-1.
Phổ 13C-NMR của hợp chất B cho thấy tín hiệu của 2 nhóm carbonyl ở δ
201,2 (C-9) và 201,5 (C-3), tín hiệu của 4 cacbon olefinic ở δ 128,8 (C-4), 132,5 (C-8), 149,1 (C-7) và 165,5 (C-5), và 1 cacbon oxi hoá ở δ 80,8 (C-6).
Bảng 3.2: Dữ kiện phổ 13C-NMR của hợp chất B (dehydrovomifoliol)
Cacbon DEPT Độ dịch chuyển hoá học (ppm)
1 C 43,5
2 CH2 51,3
3 C 201,5
5 CH 165,5 6 C 80,8 7 CH 149,1 8 CH 132,5 9 C 201,2 10 CH3 28,4 11 CH3 24,3 12 CH3 25,5 13 CH3 20,0
Dưới đây là các phổ đồ của hợp chất B
Hinh 3.18. Phổ 1H-NMR của hợp chất B
Từ các dữ liệu phổ và tài liệu tham khảo có thể xác định chất B là 3-oxo-6- hydroxy-ionon (dehydrovomifoliol) . Hợp chất này lần đầu tiên phân lập từ cây
Oryza sativa [36]. O O OH 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 2 1 11 13 Dehydrovomifoliol KẾT LUẬN
Nghiên cứu thành phần hoá học dịch chiết loài nấm Nigrofomes melannoporus từ Vườn Quốc gia Pù Mát,tỉnh Nghệ An, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:
- Quả thể nấm Nigrofomes melanoporus phơi khô (1350 g) được chiết với hỗn hợp dung môi MeOH:CHCl3 ở nhiệt độ thường thu được cặn chiết với khối lượng 78 g.
- Lượng căn chiết này được sắc ký cột silica gel với hệ dung môi rửa giải n- hexan-axeton thu được 10 phân đoạn.
- Phân đoạn 3 có khối lượng 5,4 g được tiến hành sắc ký silica gel lần thứ hai với loại cột nhỏ, hệ dung môi rửa giải clorofom-metanol thu được 5 phân đoạn. Phân đoạn F3-3 (58 mg) được tách bằng phương pháp sắc kí thu được chất A(12 mg) và B(17 mg).
- Bằng các phương pháp phổ hiện đại: phổ hồng ngoại IR, tử ngoại UV, phổ khối lượng (ESI-MS), phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR, 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC, COSY, NOESY để xác định cấu trúc các hợp chất tách được. Từ các kết quả phổ và các tài liệu tham khảo đã xác định được hai chất A và B.