Từ những mẫu nước thải thu được tại làng nghề sản xuất bánh Pía Sóc Trăng, 18 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Các dòng vi khuẩn phân lập ròng, được đặt tên là Tx, My, Qz (trong đó T, M, Q lần lượt là ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập được của nước thải Tân Huê Viên, Mỹ Trân, Quảng Trân và x, y, z là số thứ tự các dòng) (Bảng 10). Các dòng vi khuẩn này có khả năng phân hủy tinh bột và sử dụng tinh bột làm nguồn carbon cho quá trình phát triển.
Bảng 9. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. STT Dòng vi khuẩn Địa điểm thu mẫu
1 T6 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 2 T7 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 3 T10 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 4 M0 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 5 M4 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 6 M5 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 7 M10 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 8 M12 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 9 Q0 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 10 Q3 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 11 Q4 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 12 Q5 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 13 Q6 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 14 Q7 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 15 Q8 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 16 Q9 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng
17 Q10 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 18 Q11 Quảng Trân - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng
4.1.2 Đặc điểm hình thái khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn đã phân lập đƣợc.
Từ mẫu cấy trãi trên môi trường phân lập đặc hiệu có bổ sung chất kháng nấm Cyclohexamide 0,1% chọn ra những khuẩn lạc khác nhau cấy phân lập qua từng đĩa môi trường bổ sung tinh bột.
Sau khi phân lập ròng tiến hành cấy các dòng vi khuẩn này lên đĩa petri có chứa môi trường bổ sung tinh bột để quan sát và mô tả các đặc điểm khuẩn lạc. Thời gian trung bình để các dòng vi khuẩn phát triển thành khuẩn lạc trên môi trường phân lập là 20 giờ.
Mười tám dòng vi khuẩn phân lập với khuẩn lạc có nhiều đặc điểm khác nhau được mô tả dựa vào hình dạng, màu sắc, dạng bìa, độ nổi và kích thước khuẩn lạc (Bảng 11).
Bảng 10. Đặc tính khuẩn lạc vi khuẩn phân lập sau 24 giờ cấy.
STT Dòng vi khuẩn Màu sắc khuẩn lạc Hình dạng khuẩn lạc Đƣờng kính (mm) Dạng Bìa Độ nổi
1 T6 Vàng Không đều Răng cưa Lài 2,0 – 4,0
2 T7 Trắng đục Tròn Nguyên Lài 1,0
3 T10 Trắng đục Tròn Nguyên Lài 1,5
4 M0 Vàng nhạt Tròn Răng cưa Lài 2,5
5 M4 Trắng đục Tròn Nguyên Lài 1,0
6 M5 Trắng trong Tròn Nguyên Lài 1,2
7 M10 Trắng đục Tròn Nguyên Lài 1,5
8 M12 Trắng đục Tròn Nguyên Mô 2,0
9 Q0 Trắng đục Tròn Nguyên Lài 1,0
11 Q4 Trắng trong Tròn Nguyên Lài 1,0
12 Q5 Vàng Tròn Răng cưa Lài 4,0
13 Q6 Vàng nhạt Không đều Chia thùy Lài 2,0 – 3,0
14 Q7 Trắng đục Tròn Nguyên Mô 6,0
15 Q8 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,5
16 Q9 Nâu nhạt Không đều Chia thùy Lài 2,0 – 4,0
17 Q10 Trắng đục Tròn Nguyên Mô 1,5
18 Q11 Vàng nhạt Tròn Nguyên Lài 1,5
Hình dạng khuẩn lạc:
15 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng tròn (chiếm 83,33%). 3 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng không đều (chiếm 16,67%).
Đa dạng về màu sắc khuẩn lạc trong đó có:
8 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng đục (chiếm tỉ lê 44,44%). 3 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu trắng trong (chiếm 16,67%).
6 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc màu vàng và vàng nhạt (chiếm 33,33%). Chỉ có 1 dòng có khuẩn lạc màu nâu nhạt (chiếm 5,56 %).
Dạng bìa khuẩn lạc:
12 dòng vi khuẩn có khuẩn lạc dạng bìa nguyên (chiếm 66,67%) 4 dòng vi khuẩn có dạng bìa răng cưa (chiếm 22,22%).
2 dòng vi khuẩn có dạng bìa chia thùy (chiếm 11,11%).
Độ nổi:
Phần lớn các dòng vi khuẩn có độ nổi lài là 15 dòng (chiếm 83,33%). Một số ít dòng vi khuẩn có độ nổi mô là 3 dòng (chiếm 16,67%).
Kích thước khuẩn lạc của vi khuẩn trên môi trường nuôi cấy đặc hiệu và được ủ ở
Hình 11. Khuẩn lạc phát triển trên môi trƣờng bổ sung tinh bột sau 24 giờ
Ghi chú: Dòng Q7 có khuẩn lạc màu trắng đục, độ nổi mô, bìa nguyên
Dòng Q5 có khuẩn lạc màu vàng, độ nổi lài, bìa răng cưa, có tâm nhô Dòng Q8 có khuẩn lạc màu vàng nhạt, độ nổi lài, bìa nguyên
Dòng M10 có khuẩn lạc màu trắng đục, độ nổi lài, bìa nguyên
Q7 Q5
4.1.3. Đặc điểm tế bào vi khuẩn trên môi trƣờng phân hủy tinh bột
Các dòng vi khuẩn phân lập được chủ yếu có dạng cầu đôi, ngoài ra còn có dạng que ngắn và que dài. Đa số các dòng chuyển động và Gram âm.
Bảng 11. Đặc tính các dòng vi khuẩn đƣợc phân lập STT Dòng vi khuẩn Hình dạng Kích thƣớc vi khuẩn Gram1 Chuyển động2 Chiều rộng (µm) Chiều dài (µm) 1 T6 Cầu đôi 0,68 1,37 – + 2 T7 Cầu đôi 0,85 1,71 + + 3 T10 Que ngắn 0,85 1,20 – + 4 M0 Que ngắn 0,85 2,22 + – 5 M4 Cầu đôi 0,85 1,71 – + 6 M5 Que ngắn 1,03 1,71 – + 7 M10 Cầu đôi 1,03 2,05 – – 8 M12 Cầu đôi 0,85 1,71 – + 9 Q0 Cầu đôi 0,85 1,71 – – 10 Q3 Cầu đôi 1,03 2,05 – – 11 Q4 Cầu đôi 0,85 1,71 – + 12 Q5 Que ngắn 1,37 3,42 – – 13 Q6 Que ngắn 1,20 2,56 – + 14 Q7 Que ngắn 1,03 2,05 + + 15 Q8 Que ngắn 1,37 3,76 + – 16 Q9 Que dài 0,85 4,10 – + 17 Q10 Cầu đôi 1,03 2,05 – + 18 Q11 Que ngắn 0,68 1,20 + +
Hình dạng vi khuẩn có:
9 dòng vi khuẩn dạng cầu đôi (chiếm 50%). 8 dòng vi khuẩn dạng que ngắn (chiếm 44,44,%). 1 dòng vi khuẩn dạng que dài (chiếm 5,56%).
Khả năng chuyển động:
12 dòng vi khuẩn có khả năng chuyển động (chiếm 66,67%) 6 dòng vi khuẩn không chuyển động (chiếm 33,33%).
Kết quả nhuộm Gram: trong 18 dòng vi khuẩn phân lập được, đa số các dòng
thuộc nhóm Gram âm.
13 dòng vi khuẩn Gram âm (chiếm 72,22%) 5 dòng thuộc nhóm Gram dương (chiếm 27,78%).
Hình 12. Hình nhuộm Gram Độ phóng đại vật kính X100
Ghi chú: Dòng Q7 là vi khuẩn Gram dương.
Dòng Q5 là vi khuẩn Gram âm.
Q5 Q7
4.2. Đặc tính sinh hóa của các dòng vi khuẩn đã phân lập 4.2.1. Thử nghiệm Catalase 4.2.1. Thử nghiệm Catalase
Kết quả kiểm tra hoạt tính của enzyme catalase
Hiện tượng sủi bọt khí xuất hiện khi nhỏ vài giọt H2O2 30% lên bề mặt khuẩn lạc
ròng của các dòng vi khuẩn đã phân lập được.
Kết quả cho thấy tất cả các dòng vi khuẩn đều cho kết quả dương tính với enzyme catalase (chiếm tỉ lệ 100%) chứng tỏ 18 dòng vi khuẩn đều hiếu khí.
Hình 13. Hiện tƣợng sủi bọt khí khi cho H2O2 tiếp xúc với bề mặt khuẩn lạc Q5
Q9
4.2.2. Thử nghiệm Methyl red
Sau khi chủng 18 dòng vi khuẩn đã phân lập vào môi trường Glucose phosphate
(MR-VP broth) ủ ở 37oC trong 4 ngày, nhỏ 100µl thuốc thử Methyl red vào mỗi ống
nghiệm.
Dựa vào sự thay đồi màu sắc của các ống nghiệm, quan sát ta thấy: pH:
Trong 18 dòng vi khuẩn có 4 dòng môi trường chuyển sang màu đỏ (chiếm 22,22%), màu cam là 7 dòng (chiếm 38,89%), màu vàng là 6 dòng (chiếm 33,33%) và chỉ có duy nhất 1 dòng màu trắng ngà (chiếm 5,56%).
Theo kết quả như trên thì 4 dòng vi khuẩn có môi trường chuyển sang màu đỏ cho phản ứng dương tính với thuốc thử Methyl red chứng tỏ acid tích lũy trong môi trường ngày càng nhiều hơn. Còn lại 14 dòng đều cho kết quả âm tính là do các vi
sinh vật đã chuyển hóa các sản phẩm acid và kết quả là làm cho pH trong môi trường
chuyển dần về trung tính.
Hình 14. Phản ứng màu của các dòng vi khuẩn khi nhỏ thuốc thử Methyl red
Ghi chú: ĐC là ống đối chứng chỉ có môi trường MR-VP broth mà không có chủng vi khuẩn.
4.2.3. Hoạt tính Lipase
Chỉ số OD của các dòng vi khuẩn để chủng vào môi trường dao động trong khoảng 0,055 – 0,075 được đo ở bước sóng 610nm.
Sau khi chủng 1ml các dòng vi khuẩn trên vào các ống chứa môi trường MSB có
bổ sung 0,5ml dầu ăn và ủ ở 37oC trong 4 ngày, tiến hành đo mực dầu và đo OD từng
dòng vi khuẩn. Ghi nhận kết quả (Bảng 13).
Bảng 12. Giá trị đo OD và đo mực dầu của các dòng vi khuẩn
STT Dòng vi khuẩn OD ban đầu OD sau 4 ngày ủ 37o C Đo mực dầu (mm) 1 ĐC 0,012 0,018 7,0 2 T6 0,063 0,044 7,0 3 T7 0,074 0,125 6,0 4 T10 0,060 0,094 7,0 5 M0 0,068 0,089 7,0 6 M4 0,069 0,114 6,5 7 M5 0,066 0,097 6,5 8 M10 0,064 0,109 6,5 9 M12 0,063 0,045 7,0 10 Q0 0,057 0,362 5,5 11 Q3 0,059 0,281 6,0 12 Q4 0,060 0,062 7,0 13 Q5 0,061 0,086 7,0 14 Q6 0,075 0,491 5,0 15 Q7 0,068 0,569 5,0 16 Q8 0,071 0,373 5,5 17 Q9 0,065 0,035 7,0 18 Q10 0,067 0,126 6,5
19 Q11 0,069 0,121 6,5
Ghi chú: ĐC là ống đối chứng chứa môi trường MSB bô sung 0,5ml dầu ăn (mực dầu 7,0 mm) mà không có chủng vi khuẩn.
Hoạt tính enzyme lipase của các dòng vi khuẩn được kiểm định qua thử nghiệm kết hợp giữa đo mực dầu và đo chỉ số OD, kết quả như sau:
Nhìn chung đa số các dòng vi khuẩn đều có hoạt tính enzyme lipase là 14 dòng vi
khuẩn (Q7, Q6, Q8, Q0, Q3, T7, Q10, Q11, M4, M5, M10, T10, M0, Q5) chiếm tỉ lệ
77,78%. Trong đó dòng Q7 có hoạt tính enzyme lipase cao nhất.
Còn lại 4 dòng vi khuẩn (M12, T6, Q4, Q9) không có hoạt tính enzyme lipase chiếm tỉ lệ 22,22%.
Từ kết quả trên cho thấy dòng vi khuẩn Q7 có khả năng tăng trưởng nhanh làm đục môi trường MSB có bổ sung dầu ăn nên chỉ số OD tăng cao (0,068 - 0,569) và mực dầu thấp hơn so với lúc đầu (7 mm – 5 mm) do phân giải lượng lipid trong dầu ăn. Chứng tỏ dòng vi khuẩn Q7 có hoạt tính enzyme lipase cao nhất so với các dòng vi khuẩn còn lại (Hình 16).
Hình 15. Các dòng vi khuẩn trong môi trƣờng MSB bổ sung dầu ăn ủ 4 ngày ở 37o
C
Ghi chú: ĐC là ống đối chứng chứa môi trường MSB bô sung 0,5ml dầu ăn (mực dầu 7,0 mm) mà không có chủng vi khuẩn.
4.3. Kết quả khảo sát hoạt tính Amylase
Sau khi cấy và ủ ở nhiệt độ phòng (30oC), khuẩn lạc phát triển sau 18 giờ. Sau 24
giờ nhận diện rõ vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (hay còn gọi là vòng phân hủy) (Hình 17). Tuy nhiên, vòng phân hủy tinh bột có thể nhận rõ hơn và đo được khi làm tràn mẫu vi khuẩn với dung dịch Lugol (Hình 18). Phần môi trường chứa tinh bột chưa bị phân hủy bởi enzyme amylase sẽ cho màu tím xanh với dung dịch Lugol, riêng vùng sáng là do tinh bột đã bị phân hủy do đó không cho phản ứng màu với Lugol.
Theo kết quả nghiên cứu của Sasmita Mishra và Niranjan Behera (2008), Sekar Sudharhsan et al. (2007) thì khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tạo ra một vòng sáng rộng xung quanh khuẩn lạc và vòng sáng này không cho phản ứng màu với dung dịch Lugol. Sự hiện diện của vòng phân hủy tinh bột bao quanh khuẩn lạc có thể cho kết quả đánh giá ban đầu các dòng vi khuẩn có hay không có khả năng phân hủy tinh bột.
Tuy nhiên, đường kính vòng phân hủy tinh bột giữa các dòng vi khuẩn khác nhau, tùy thuộc vào khả năng phân hủy tinh bột của chúng.
Sau một ngày chủng thì 7 dòng trong 18 dòng vi khuẩn phân lập được bắt đầu xuất hiện vòng sáng và tăng dần qua các ngày.
Hình 16. Độ đục và mực dầu của dòng Q7 trƣớc và sau khi ủ trong 4 ngày ở 37o C so với ống đối chứng (ĐC) Chủng VK Ủ 4 ngày 37oC
Hình 17. Khuẩn lạc tạo vòng phân hủy sau 24 giờ
Q5 Q7
Hình 18. Đĩa đƣợc nhuộm Lugol để thấy vòng phân hủy tinh bột sau 68 giờ ĐC Q7 ĐC Q9 Q5 M12 M4 Q11 Q8 ĐC
Khả năng của các dòng vi khuẩn được khảo sát có thể đánh giá sơ bộ qua tỉ lệ giữa đường kính của vòng sáng xung quanh khuẩn lạc (D) và đường kính của khuẩn lạc (d). Các dòng Q7, Q5, Q9, Q6, M0, M10, T6 có đường kính trung bình vòng phân hủy cao từ 19 mm đến 52 mm và có tỉ lệ D/d > 1,0. Các dòng vi khuẩn còn lại hầu hết có đường kính nhỏ với tỉ lệ D/d=1,0.
Hình 19. Biểu đồ so sánh tỉ lệ đƣờng kính vòng phân hủy và đƣờng kính khuẩn lạc của các dòng vi khuẩn
Ghi chú: Trị trung bình có các mẫu tự đầu cột giống nhau biểu thị sự khác biệt không có ý nghĩa thống kê (P≤0,5).
Qua hình 19 cho thấy với 7 dòng vi khuẩn được xét đến có tỉ lệ D/d càng cao thì hoạt tính enzyme amylase càng cao. Hoạt tính enzyme amylase của các dòng vi khuẩn được khảo sát qua việc nhuộm Lugol, kết quả như sau:
Dòng Q6 có hoạt tính enzyme amylase thấp nhất với tỉ lệ D/d trung bình đạt được
là 1,09 khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn khác.
Trong đó hoạt tính enzyme amylase cao nhất là dòng vi khuẩn Q7 với tỉ lệ D/d
trung bình đạt được là 1,78 khác biệt có ý nghĩa so với các dòng vi khuẩn còn lại. Ngoài ra, dòng Q7 và Q5 là hai dòng vi khuẩn có đường kính trung bình của vòng phân hủy lớn và tăng sinh khối nhanh.
4.4. Kết quả xác định thời gian tăng trƣởng của một số dòng phân hủy tinh bột
Từ kết quả khảo sát hoạt tính enzyme amylase, hai dòng vi khuẩn có tỉ lệ D/d≥1,30 là dòng Q7 và dòng Q5 được chọn lựa để khảo sát mật số tế bào sống của chúng theo thời gian nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng MSB bổ sung tinh bột như là nguồn Carbon duy nhất ở pH = 7,0.
Chỉ số OD của hai dòng vi khuẩn Q5 và Q7 chủng vào môi trường lần lượt là 0,061và 0,068 được đo ở bước sóng 610nm.
Hình 20. Đĩa đếm khuẩn lạc của hai dòng vi khuẩn bằng phƣơng pháp nhỏ giọt sau 24 giờ
Q7 Q5
Hình 21. Biểu đồ biểu diễn sự tƣơng quan giữa mật số tế bào và thời gian nuôi cấy của dòng vi khuẩn Q7 và Q5
7.42 9.46 9.34 9.12 7.58 9.6 9.76 9.67 7 7.5 8 8.5 9 9.5 10 10.5 0h 24h 48h 72h M ật s ố t ế bào vi k hu ẩn (L ogC F U /m l)
Thời gian nuôi cấy
Dòng Q5 Dòng Q7
Khi nuôi cấy trong môi trường dinh dưỡng lỏng trên máy lắc, cả hai dòng vi khuẩn có đường cong tăng trưởng, thời gian mật số tế bào vi khuẩn trong một đơn vị thể tích đạt cực đại tương ứng với thời gian tăng trưởng tối ưu của hai dòng vi khuẩn có sự khác biệt như sau:
Dòng vi khuẩn Q5 có mật số tế bào tăng lên sau khi chủng vào môi trường dinh
dưỡng và đạt giá trị cực đại là 9,46 (LogCFU/ml) ở 24h, sau đó giảm dần sau 48h và 72h.
Riêng dòng vi khuẩn Q7 lại có mật số tế bào tăng rất nhanh sau 24h và tiếp tục
tăng cho đến khi đạt cực đại ở 48h là 9,76 (LogCFU/ml). Sau đó mật số tế bào này giảm dần đến sau 72h.
4.5. Kết quả nhận diện dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột
Dòng vi khuẩn Q7 có khả năng phân hủy tinh bột tốt, ngoài ra còn có khả năng phân hủy lipid nên được chọn giải trình tự.
Phổ điện di trên gel agarose cho thấy dòng vi khuẩn Q7 có băng (band) ở vị trí