a. Xác định hình thái của vi khuẩn
Quan sát những đặc tính của khuẩn lạc
Hình dạng
Màu sắc
Kích thước
Dạng bìa
Độ nổi
Quan sát khả năng chuyển động của vi khuẩn:
Chuẩn bị mẫu bằng phương pháp giọt ép rồi quan sát dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).
Nhỏ một giọt nước cất tiệt trùng lên kính mang vật.
Khử trùng kim cấy bằng ngọn lửa đèn cồn và để nguội.
Châm đầu kim cấy vào khuẩn lạc, sau đó chấm vào giọt nước trên kính mang vật.
Dùng kính đậy vật đậy lên giọt nước bằng cách để một cạnh của kính đậy vật tiếp
xúc với kính mang vật một góc 45o, rồi hạ kính đậy vật từ từ và nhẹ nhàng sao cho
không có bọt khí trong mẫu vật.
Quan sát dưới kính hiển vi để thấy sự chuyển động thật.
(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008)
Đo kích thước tế bào vi khuẩn dưới kính hiển vi (độ phóng đại 400 lần).
Đặt thước trắc vi vật kính (được đặt trên một miếng kính đặc biệt dài khoảng 2mm được chia thành 200 khoảng, mỗi khoảng có độ dài 10 m) vào bàn kính, điều chỉnh sao cho thấy rõ hình ảnh của thước.
Xê dịch thước trắc vi vật kính và xoay thước trắc vi thị kính (là một miếng kính tròn trên đó có chia thành 100 vạch, nó được đặt giữa hai thấu kính của thị kính) sao cho hai thước song song và gần sát nhau.
Tiếp tục xê dịch thước trắc vi vật kính sao cho một vạch của thước trắc vi vật kính trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính và vạch thứ hai nào đó của thước trắc vi vật kính trùng với thước trắc vi thị kính.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi thị kính trùng với thước trắc vi vật kính.
Trị số một khoảng của thước trắc vi thị kính được tính theo công thước sau:
x = (N/n)* 10 m
Trong đó:
x: Trị số một khoảng cách của thước trắc vi thị kính. N: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, N = 6. n: Số khoảng cách của thước trắc vi vật kính, n = 35. Ta có: x=(6/35)*10 m
Thay thước trắc vi vật kính bằng vi mẫu, điều chỉnh cho thấy rõ ảnh của vi mẫu. Di chuyển vi mẫu sao cho một đầu của mẫu đo trùng với một vạch của thước trắc vi thị kính, từ đó tìm một vạch thứ hai trùng với đầu kia của mẫu đo.
Đếm số khoảng cách của thước trắc vi nằm trong hai vạch này.
Tính kích thước của vi mẫu bằng cách lấy số khoảng trùng của thước nhân với trị số một khoảng của thước trắc vi thi kính
(Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008).
Nhuộm Gram
- Hút 10μl nước cất vô trùng nhỏ lên giữa kính mang vật.
- Dùng que cấy đã khử trùng trên ngọn đèn cồn lấy một ít vi sinh vật rồi trãi mỏng
- Hơ mẫu vật trên ngọn lửa đèn cồn nhằm mục đích cố định vi sinh vật trên kính mang vật.
- Nhỏ từ một đến hai giọt crystal violet lên kính mang vật có chứa mẫu vi sinh vật
đã cố định, trãi đều crystal violet bằng que cấy và để 2 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô nước.
- Nhỏ từ một đến hai giọt dung dịch iod rồi trãi đều bằng que cấy và để trong 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng, chậm nhẹ cho khô.
- Rửa lại bằng cồn 70o thật nhanh để tẩy màu từ đầu đến cuối kính mang vật sau
cho đến khi giọt cồn cuối cùng không còn màu tím nữa.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng trong vài giây, chậm nhẹ cho khô.
- Nhỏ từ một đến hai giọt fushin rồi trãi đều bằng que cấy sau đó để 1 phút.
- Rửa lại bằng nước cất vô trùng cho đến giọt nước cuối cùng không còn màu của
fushin.
- Dùng giấy thấm chậm nhẹ cho kính mang vật khô nước.
Quan sát mẫu trên kính hiển vi quang học ở độ phóng đại 400 lần và ghi nhận.
Bảng 6. Các giai đoạn của phƣơng pháp nhuộm Gram
Giai đoạn Gram dƣơng Gram âm
1. Crystal violet Tế bào nhuộm tím xanh Tế bào nhuộm tím xanh 2. Dung dịch iod Iod dán Crystal viole bám
chặt vào vách tế bào
Crystal viole không bám chặt vào vách tế bào
3. Rửa bằng cồn +
aceton Không tẩy Crystal violet
Tẩy Crystal violet ra khỏi vách tế bào
4. Safranin hay Fuchin Vì vách tế bào còn Crystal violet nên có màu xanh tím
Vì vách tế bào không còn Crystal violet nên có màu hồng của Fuchin
(*Nguồn: Cao Ngọc Điệp và Nguyễn Hữu Hiệp, 2008, Giáo trình thực tập môn Vi sinh vật đại cương)
b. Các phản ứng sinh hóa
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme catalase để phân biệt vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí.
Nguyên tắc:
Các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy tiện chứa chuỗi truyền điện tử cytochrome
đều có enzyme catalase, có khả năng biến dưỡng năng lượng theo phương thức hô hấp với oxy tạo ra H2O2.
Catalase thủy phân H2O2 thành H2O và O2, ngăn cản sự tích tụ phân tử có độc
tính cao này trong tế bào.
Sự thủy phân H2O2 sẽ giải phóng O2 được ghi nhận qua hiện tượng sủi bọt khí.
Cơ sở sinh hóa:
Catalase hiện diện ở các vi sinh vật hiếu khí và kỵ khí tùy ý. H2O2 catalase H2O + O2 (bọt khí) (hydrogen peroxide)
Phương pháp thực hiện:
Cấy vi khuẩn nuôi trên môi trường đĩa thạch.
Nhỏ trực tiếp H2O2 30% lên khuẩn lạc ròng của vi sinh vật trên bề mặt đĩa thạch.
Quan sát sau 1-2 giây:
Phản ứng dương tính (+): có bọt khí xuất hiện do khí O2 được tạo ra.
Phản ứng âm tính (−): không có bọt khí xuất hiện.
Thử nghiệm Methyl red
Nguyên tắc: nhằm xác định khả năng của vi sinh vật sản xuất và duy trì các sản phẩm acid trong môi trường từ quá trình lên men glucose.
Cơ sở sinh hóa:
Thử nghiệm Methyl red trên cơ sở sử dụng chất chỉ thị pH là methyl red để nhận
biết lượng ion H+ trong môi trường sau khi vi sinh vật lên men glucose.
Hàm lượng ion H+ có trong môi trường phụ thuộc vào tỉ lệ CO2 và H2, hàm
lượng các chất này lại tùy thuộc vào con đường chuyển hóa của từng loài vi sinh vật.
Khi kéo dài thời gian nuôi cấy vi sinh vật có phản ứng Methyl red dương tính sẽ
tích lũy acid trong môi trường ngày càng nhiều hơn, độ pH trong môi trường ngày càng giảm.
Đối với các vi sinh vật cho phản ứng MR âm tính, ngay ban đầu một lượng acid được hình thành trong môi trường, nhưng kéo dài thời gian nuôi cấy vi sinh vật này tiếp tục chuyển hóa các sản phẩm acid bằng các phản ứng như decarboxyl tạo nên các sản phẩm trung tính như acetoin (acetyl methylcarbinol) và kết quả là làm cho pH trong môi trường chuyển dần về trung tính.
Trong một số trường hợp khác vi sinh vật cũng sản sinh acid trong môi trường
nhưng các acid này cho hàm lượng ion H+ thấp như acid lactic, acid acetic, acid formic… Bởi vì các acid này có xu hướng chuyển về trung tính do hiện tượng tạo
thành các carbonate và tạo thành các sản phẩm như CO2 và các hợp chất ammonium
trong môi trường các sản phẩm này làm tăng pH trong môi trường.
Thử nghiệm Methyl red phụ thuộc rất lớn vào thời gian nuôi cấy để xác định sự
khác nhau trong các con đường chuyển hóa Glucose.
2Glucose + H2O 2Lactic acid + Acetic acid + Ethanol + 2CO2 + 2H2
(Formic acid CO2 + H2)
Phương pháp tiến hành:
Chủng vi khuẩn trong môi trường glucose phosphate (MR-VP broth) ủ trong
khoảng 2-5 ngày.
Thêm vào vài giọt thuốc thử Methyl red (chất chỉ thị pH) được pha theo tỉ lệ 0,1g
trong 300ml cồn và cho nước vào để đạt thể tích 500ml.
Quan sát sau 1-2 giây:
Phản ứng dương tính (+): môi trường chuyển sang đỏ (pH dưới 4,4)
Phản ứng âm tính (−): môi trường màu vàng (pH trên 6,0), màu cam cho độ pH
trung gian và cũng được coi là một kết quả âm tính.
Hoạt tính enzyme lipase
Mục đích: phát hiện các vi sinh vật có hệ enzyme lipase có khả năng phân giải lipid.
Nguyên tắc: Lipase cho phép các sinh vật sản xuất ra nó để phá vỡ lipid thành các mảnh nhỏ hơn. Triglycerides được tạo thành từ glycerol và acid béo ba. Các liên kết bị tan vỡ và có thể được chuyển đổi thành một loạt các sản phẩm cuối cùng có thể được sử dụng bởi các tế bào trong sản xuất năng lượng hoặc các quá trình khác.
Phương pháp thực hiện:
Đánh giá cảm quan độ đục kết hợp với đo mật số OD của các dòng vi khuẩn sau
khi chủng vào nước cất đã khử trùng trong các ống để điều chỉnh sao cho độ đục và kết quả OD của các dòng tương đương nhau.
Hút 1ml mỗi dòng vi khuẩn lần lượt chủng vào các ống chứa môi trường MSB đã
bổ sung 0,5ml dầu ăn như nhau trong mỗi ống.
Ủ máy lắc ở 37o
C trong 3-5 ngày.
Đem các ống ra và tiến hành:
Để các ống nghiệm đứng yên trên giá cho phần dầu ăn và môi trường tách ra hoàn toàn. Dùng thước đo mực dầu trong mỗi ống. Ghi nhận kết quả.
Hút phần môi trường phía dưới (không lẫn dầu ăn) đem đo chỉ số OD. Ghi nhận
kết quả.
3.2.4 Phƣơng pháp tuyển chọn dòng vi khuẩn có khả năng phân hủy tinh bột tốt
Lựa chọn sơ bộ loài vi khuẩn có hoạt tính amylase cao
Nguyên tắc: Dựa vào tỉ lệ giữa đường kính của vòng phân hủy (các khuẩn lạc vi
khuẩn được hình thành, enzyme amylase được tổng hợp và tiết ra môi trường làm phân hủy tinh bột và tạo thành một vòng phân hủy xung quanh khuẩn lạc) với đường kính của khuẩn lạc để đánh giá khả năng hình thành enzyme amylase của loài vi khuẩn được khảo sát.
Phƣơng pháp thực hiện:
Dùng ống thủy tinh tạo thành các giếng có đường kính bằng nhau trên bề mặt thạch (0,5cm), mỗi đĩa petri 4 giếng.
Hút 30l dòng vi khuẩn khảo sát vào từng giếng trên đĩa petri có môi trường
MSB chứa 2% tinh bột. Mỗi đĩa 3 giếng được chủng các dòng vi khuẩn phân lập được và 1 giếng đối chứng dương bởi dòng vi khuẩn VD2 (VD2 là dòng vi khuẩn đã được
phân lập và ứng dụng vào xử lý tinh bột trong nước thải từ Đề tài “Phân lập và khảo sát dòng vi khuẩn phân hủy tinh bột từ ao nước thải tại làng nghề sản xuất bột gạo Sa Đéc – Đồng Tháp” của Nguyễn Thị Hải Lý, 2009).
Ủ ở 37oC.
Trong khoảng 3 ngày hoặc có thể lâu hơn đem quan sát và đo đường kính vùng sáng và đường kính của khuẩn lạc (Nguyễn Đức Lượng, 2002).
Với thí nghiệm tìm loài vi khuẩn có hoạt tính amylase, ta nhỏ dung dịch Lugol lên mặt thạch, tráng đều và quan sát. Tuy nhiên, Iod kìm hãm sự phát triển của vi khuẩn, nên việc nhỏ dung dịch Lugol chỉ thực hiện khi khuẩn lạc của vi khuẩn đã phát triển tương đối đầy đủ.
Quan sát và đo đường kính khuẩn lạc và vòng sáng quanh khuẩn lạc để so sánh khả năng tổng hợp enzyme amylase của các nguồn vi khuẩn.
3.2.5 Phƣơng pháp xác định thời gian tăng trƣởng tối ƣu của các dòng vi khuẩn
Sự tăng trưởng của vi khuẩn có thể được tính trên sự thay đổi mật số của tế bào trong một đơn vị thể tích hay sinh khối của tế bào.
Phƣơng pháp đếm sống nhỏ giọt
Mục đích: xác định số lượng tế bào vi sinh vật còn sống hiện diện trong mẫu bằng cách đếm khuẩn lạc trên bề mặt thạch. Tế bào sống là tế bào có khả năng phân chia tạo thành khuẩn lạc trên môi trường chọn lọc.
Nguyên tắc: thực hiện pha loãng mẫu thành nhiều độ pha loãng bậc 10 liên tiếp sao cho độ pha loãng thích hợp với mật số tế bào để xuất hiện các khuẩn lạc riêng lẻ trên bề mặt thạch và tiến hành đếm.
Phương pháp thực hiện:
Thực hiện pha loãng từng dòng vi khuẩn và pha loãng đến nồng độ 10-5, 10-6, 10-7, 10-8.
Chuẩn bị các đĩa petri chứa môi trường phân hủy tinh bột, mỗi đĩa chia thành 4 ô
(mỗi nồng độ pha loãng lặp lại 3 lần trên 3 đĩa petri).
Ủ 37o
C trong 24 giờ rồi bắt đầu đếm. Tiến hành đếm trong vòng tròn, lựa chọn tần suất nào có khả năng đếm được.
Thực hiện tương tự, nhỏ giọt đếm trong 3 ngày liên tiếp.
Công thức tính kết quả đếm:
Số lượng tế bào VSV = (Số khuẩn lạc trung bình đếm trên đĩa x Hệ số pha loãng x 2 x 102).
3.2.6 Định danh dòng vi khuẩn
Định danh vi khuẩn bằng kỹ thuật PCR
Trích DNA của vi khuẩn
Chọn 10 khuẩn lạc ròng, cho vào tube 2,2 ml.
(Ưu tiên chọn những khuẩn lạc lẻ, rời)
Cho 1 viên bi sắt vào tube và lắc bằng máy lắc.
Cho vào 1 ml Lysis buffer, lắc đều.
Ủ ở nhiệt độ phòng trong 10 phút
Ly tâm với vận tốc 13000 vòng/phút trong 5 phút.
Chuyển phần dung dịch phía trên sang tube mới (cẩn thận tránh làm vỡ màng
ngăn).
Cho một lượng tương đương Ethanol 95%.
Ly tâm với vận tốc 13.000 vòng/phút trong 5 phút. Loại bỏ phần dung dịch phía
trên.
Rửa DNA với 0,5 ml ethanol 70 %, ly tâm 13000 vòng/phút trong 5 phút (thực
hiện 2 lần).
Sấy chân không trong 10 phút ở 45oC.
Hòa tan DNA trong trong 100 µl TE 0.1X.
Kỹ thuật PCR
Trình tự primer khuếch đại đoạn gen 16S rRNA (Lane, 1991)
1492R 5’- TACGGTTACCTTGTTACGACT - 3’
27F 5’- AGAGTTTGATCCTGGCTC - 3’
Sau khi trích DNA các dòng vi khuẩn, sẽ tiến hành phản ứng PCR bằng máy PCR để khuếch đại đoạn gen 16S rRNA với cặp mồi xuôi và mồi ngược như trên. Phản ứng PCR được thực hiện thành phần phản ứng và chu kỳ phản ứng như dưới đây. Sử dụng thang DNA chuẩn 100bp.
Bảng 7. Thành phần các chất trong phản ứng PCR Thành phần Thể tích (µl) Nước cất 2 lần 13,25 Buffer 2,5 MgCl2 2,0 Mồi F 0,25 Mồi R 0,25 dNTPs 4,0 DMSO 0,5 Taq polymerase 0,25 DNA vi khuẩn 2,0 Tổng 25,0
Bảng 8. Chu kỳ nhiệt phản ứng PCR khuếch đại đoạn gen 16S rRNA Bƣớc phản ứng Giai đoạn Số chu kỳ Nhiệt độ oC Thời gian
1 Biến tính 95 5 phút
2 Biến tính 30 95 1 phút
Gắn mồi 30 55 30 giây
Kéo dài 30 72 90 giây
Sau khi thực hiện chu kỳ cuối cùng giữ nhiệt của máy ở 72oC trong 5 phút để
phản ứng khuếch đại hoàn toàn. Cuối cùng trữ mẫu ở 10oC.
Điện di trên gel sản phẩm PCR. Tiến hành giải trình tự.
Các bước tiến hành giải trình tự bao gồm:
Tinh sạch sản phẩm PCR.
Đo nồng độ DNA sau khi tinh sạch.
Thực hiện phản ứng gắn huỳnh quang.
Giải trình tự DNA.
CHƢƠNG 4. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 4.1 Kết quả phân lập vi khuẩn
4.1.1 Phân lập vi khuẩn
Từ những mẫu nước thải thu được tại làng nghề sản xuất bánh Pía Sóc Trăng, 18 dòng vi khuẩn đã được phân lập. Các dòng vi khuẩn phân lập ròng, được đặt tên là Tx, My, Qz (trong đó T, M, Q lần lượt là ký hiệu dòng vi khuẩn phân lập được của nước thải Tân Huê Viên, Mỹ Trân, Quảng Trân và x, y, z là số thứ tự các dòng) (Bảng 10). Các dòng vi khuẩn này có khả năng phân hủy tinh bột và sử dụng tinh bột làm nguồn carbon cho quá trình phát triển.
Bảng 9. Nguồn gốc các dòng vi khuẩn phân lập đƣợc. STT Dòng vi khuẩn Địa điểm thu mẫu
1 T6 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 2 T7 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 3 T10 Tân Huê Viên - Huyện Châu Thành - Tỉnh Sóc Trăng 4 M0 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng 5 M4 Mỹ Trân - TP Sóc Trăng - Tỉnh Sóc Trăng