2. 7 Các nghiên cứu liên quan
3.3.Bố trí thí nghiệm
3.3.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp BA-NAA lên sự sinh trƣởng của mô sẹo măng tây xanh
Mục tiêu thí nghiệm
Tìm ra môi trường có tỉ lệ nồng độ BA-NAA thích hợp cho sự sinh trưởng của mô sẹo măng tây xanh.
Phƣơng pháp tiến hành
Mô sẹo được tách với kích thước khoảng 0,5×0,5 cm, cấy vào môi trường MS có bổ sung tỉ lệ nồng độ BA-NAA khác nhau.
Thí nghiệm bố trí theo thể thức hoàn toàn ngẫu nhiên với 9 nghiệm thức, kể cả nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại hai đĩa, mỗi đĩa chứa 5 mẫu.
Bảng 4: Tỉ lệ nồng độ BA-NAA bổ sung trong môi trƣờng
Các chỉ tiêu theo dõi:
Kích thước của mô sẹo: Đường kính gia tăng tương đối (%)
Màu sắc và cấu trúc mô sẹo (quan sát)
Sự phát sinh chồi (nếu có)
Thời gian lấy chỉ tiêu 10, 20 và 30 ngày sau khi cấy (NSKC).
3.3.2. Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây mô sẹo măng tây
Mục tiêu thí nghiệm
Tìm ra môi trường có tỉ lệ nồng độ BA-IBA thích hợp cho sự tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây.
Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ NAA (mg/l) ĐC 0 0 M1 0,5 0,5 M2 0,5 1 M3 1 0,5 M4 1 1 M5 1,5 0,5 M6 1,5 1 M7 2 0,5 M8 2 1
Phƣơng pháp tiến hành
Mô sẹo măng tây xanh sẽ được cấy vào chai thủy tinh có chứa môi trường MS có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng khác nhau.
Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 5 nghiệm thức kể cả nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức được lặp lại 3 lần, mỗi lần 2 chai, mỗi chai chứa 5 mẫu.
Bảng 5: Tỉ lệ nồng độ BA-IBA trong môi trƣờng
Chỉ tiêu theo dõi:
Số chồi và chiều dài chồi
Thời gian theo dõi: 60 ngày sau khi cấy.
3.3.3. Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nƣớc dừa tƣơi lên sự sinh trƣởng của mô sẹo măng tây xanh
Mục tiêu thí nghiệm
Xác định hàm lượng nước dừa bổ sung vào môi trường nuôi cấy thích hợp cho sự sinh trưởng mô sẹo.
Phƣơng pháptiến hành Nghiệm thức Nồng độ BA (mg/l) Nồng độ IBA (mg/l) ĐC B1 B2 B3 B4 0 0,5 0,5 0,5 0,5 0 0 0,1 0,2 0,3
Tương tự như thí nghiệm 1, mô sẹo được tách thành cụm nhỏ có kích thước khoảng 0,5×0,5 cm và cấy trong môi trường MS có bổ sung hàm lượng nước dừa khác nhau. Thí nghiệm được bố trí hoàn toàn ngẫu nhiên với 4 nghiệm thức, kể cả nghiệm thức đối chứng. Mỗi nghiệm thức lặp lại 3 lần, mỗi lần lặp lại 2 đĩa, mỗi đĩa chứa 5 mẫu.
Bảng 6: Hàm lƣợng nƣớc dừa tƣơi bổ sung vào môi trƣờng
Nghiệm thức Môi trƣờng ĐC MSD1 MSD2 MSD3 MS MS + 100 ml/l nước dừa MS + 150 ml/l nước dừa MS + 200 ml/l nước dừa
Các chỉ tiêu theo dõi: (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Kích thước của mô sẹo: Đường kính gia tăng tương đối (%)
Màu sắc và cấu trúc mô sẹo (quan sát)
Sự phát sinh chồi (nếu có)
Thời gian lấy chỉ tiêu 10, 20 và 30 ngày sau khi cấy (NSKC).
3.4. Xử lý số liệu
Số liệu được xử lý bằng phần mềm Excel 2003 và xử lý thống kê bằng phần mềm Minitab 16.
Các số liệu là đường kính gia tăng tương đối (đơn vị tính là %) được tính theo công thức của Lâm Ngọc Tú (2010):
(Đường kính lúc sau-Đường kính lúc đầu) Đường kính gia tăng tương đối = × 100%
CHƢƠNG 4
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
4.1. Thí nghiệm 1: Hiệu quả của sự kết hợp giữa BA-NAA lên sự sinh trƣởng của mô sẹo măng tây xanh trƣởng của mô sẹo măng tây xanh
Kết quả ghi nhận được, sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có kết hợp BA nồng độ từ 0,5-2 mg/l và NAA nồng độ 0,5-1 mg/l, mô sẹo bắt đầu có sự gia tăng kích thước ở các nghiệm thức. Mô sẹo có sự gia tăng đường kính và cấu trúc khi theo dõi đến 30 ngày sau khi cấy.
Theo Nguyễn Minh Chơn (2005) cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào. Mô sẹo ban đầu có thể hình thành chỉ cần có sự hiện diện của auxin hoặc cytokinin. Tuy nhiên để duy trì sự phát triển của mô sẹo thì phải cần một lượng auxin và cytokinin thích hợp.
Sau 10 ngày cấy, các mô sẹo có sự tăng trưởng trên môi trường có bổ kết hợp BA-NAA ở các nồng độ khác nhau, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Nghiệm thức đối chứng cho đường kính gia tăng tương đối nhỏ nhất (trung bình 45,33%). Các nghiệm thức M2 (MS+1 mg/l BA+0,5 mg/l NAA) và M6 (MS+1,5 mg/l BA+1mg/l NAA) cho đường kính gia tăng tương đối lần lượt là 46,67% và 46%, khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5% so với nghiệm thức đối chứng. Các nghiệm thức cho đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo lớn nhất là M1 (MS+0,5 mg/l BA+0,5 mg/l NAA) và M4 (MS+1 mg/l BA+1 mg/l NAA) với các giá trị trung bình lần lượt là 100% và 105,33%. Tuy nhiên, hai nghiệm thức M1 (MS+0,5 mg/l BA+0,5 mg/l NAA) và M4 (MS+1 mg/l BA+1 mg/l NAA) có sự khác biệt không có ý nghĩa nhưng khác biệt với các nghiệm thức còn lại ở mức ý nghĩa 5%.
Bảng 7: Hiệu quả của sự kết hợp BA-NAA lên đƣờng kính gia tăng tƣơng đối của mô sẹo măng tây xanh
Trên cùng một cột, các trung bình có cùng kí tự là khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%.
Nghiệm thức
Đƣờng kính gia tăng tƣơng đối (%) Màu sắc- Cấu trúc Sự phát sinh chồi 10 NSKC 20 NSKC 30 NSKC ĐC 45,33d 65,33f 110d Xanh nhạt Mô sẹo xốp Không có M1 100,00a 140ab 200,67a Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M2 46,67d 118cd 158,67b Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M3 57,78c 87,78e 121,67cd Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M4 105,33a 160a 201,33a Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M5 58,67c 96,67de 140,67bc Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M6 46d 85,33ef 123,33cd Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M7 71,33b 129,8bc 199,87a Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có M8 58,67c 86,67ef 164,67b Xanh đậm Mô sẹo cứng Không có P-value 0,000 0,000 0,000 CV (%) 9,42 11,85 9,02
Ghi chú: ĐC=nghiệm thức đối chứng; M1=môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 0,5 mg/l; M2=môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và BA 0,5 mg/l; M3=môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 1 mg/l; M4=môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và BA 1 mg/l; M5=môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 1,5 mg/l; M6=môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và BA 1,5 mg/l; M7=môi trường MS bổ sung NAA 0,5 mg/l và BA 2 mg/l; M8=môi trường MS bổ sung NAA 1 mg/l và BA 2 mg/l.
Ở thời điểm sau khi cấy 20 ngày, các mô sẹo có sự tăng trưởng trên môi trường có sự kết hợp BA-NAA ở các nồng độ khác nhau. Đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo ở các nghiệm thức có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng đều cao hơn nghiệm thức đối chứng. Ở nghiệm thức M4 (MS+1 mg/l BA+1 mg/l NAA), đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo măng tây xanh cao hơn các nghiệm thức khác với giá trị trung bình 160%, kế đến là nghiệm thức M1(MS+0,5 mg/l BA+0,5 mg/l NAA) đạt giá trị 140%. Tuy nhiên, hai nghiệm thức này có sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê nhưng lại có sự khác biệt với các môi trường còn lại về mặt thống kê ở mức ý nghĩa 5%. Các nghiệm thức có sự kết hợp BA-NAA đều có sự gia tăng về đường kính tương đối chứng tỏ tác dụng giúp duy trì sự phát triển của mô sẹo măng tây. Theo Nguyễn Đức Lượng và Lâm Thị Thủy Tiên (2002) mô sẹo sau khi tạo thành nếu nuôi cấy trên môi trường có bổ sung chất điều hòa sinh trưởng auxin thì sẽ phát triển nhanh hơn so với khi cấy trên môi trường không có sự hiện diện của auxin.
Sau khi cấy 30 ngày, các mô sẹo có sự tăng trưởng nhanh trên môi trường có sựkết hợp BA-NAA ở các nồng độ khác nhau, đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo cao hơn nghiệm thức đối chứng, giữa các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa thống kê ở mức 5%. Các nghiệm thức M1 (MS+0,5 mg/l BA+0,5 mg/l NAA), M4 (MS+1 mg/l BA+1 mg/l NAA) và M7 (MS+2mg/l BA+0,5 mg/l NAA) cho kết quả cao hơn các nghiệm thức còn lại với giá trị đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo măng tây xanh trong khoảng là 199,87% đến 201,33%. Tuy nhiên, ba nghiệm thức trên có sự khác biệt không có ý nghĩa ở mức 5%. Các nghiệm thức còn lại cho đường kính gia tăng tương đối trung bình.
Dựa vào kết quả trên ta thấy sự phát triển của mô sẹo măng tây xanh chịu ảnh hưởng bởi tỉ lệ và hàm lượng giữa auxin và cytokinin nhưng sự phát triển này không tỉ lệ thuận với tỉ lệ và hàm lượng hai loại chất điều hòa sinh trưởng. Như vậy, môi trường MS1 (MS+0,5 mg/l BA+0,5 mg/l NAA) được chọn để nhân cụm mô sẹo măng tây xanh vì vừa tiết kiệm hóa chất, giảm chi phí vừa cho hiệu quả khá cao.
Ở thời điểm sau khi cấy 30 ngày cũng ghi nhận được mô sẹo có sự thay đổi về màu sắc cũng như là cấu trúc. Ở các nghiệm thức cho thấy mô sẹo có cấu trúc cứng và có màu xanh đậm hơn so với ban đầu, trong khi đó nghiệm thức đối chứng cho mô sẹo có cấu trúc xốp, màu xanh nhạt như ban đầu. Qua quan sát, các mô sẹo chưa có sự hình thành chồi.
Hình 3. Màu sắc mô sẹo sau 30 ngày nuôi cấy
(A): Nghiệm thức đối chứng
(B): Môi trường bổ sung 0,5 mg/l BA và 0,5 mg/l NAA
4.2. Thí nghiệm 2: Hiệu quả của sự kết hợp BA-IBA lên sự tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây mô sẹo măng tây
Theo Nguyễn Đức Lượng và Lâm Thị Thủy Tiên (2002), cytokinin có tác dụng kích thích sự phân chia tế bào và phát sinh hình thái mẫu cấy. Trong môi trường nuôi cấy khi không bổ sung đủ lượng cytokinin thì quá trình phân chia tế bào sẽ bị chặn lại. Ngoài ra cytokinin còn có tác dụng kích thích tạo chồi bất định. Quá trình này sẽ hiệu quả hơn nếu có sự kết hợp giữa cytokinin và auxin.
Sau khi cấy 60 ngày mô sẹo đã có sự hình thành chồi ở các nghiệm thức, trừ nghiệm thức đối chứng mô sẹo chỉ có sự gia tăng kích thước mà không có sự tạo chồi. Điều này cho thấy rằng chất điều hòa sinh trưởng có ảnh hưởng đến việc hình thành chồi từ mô sẹo. Nhìn chung, số chồi ở các nghiệm thức B1 (MS+0,5 mg/l BA), B2 (MS+0,5 mg/l BA+0,1 mg/l IBA), B3 (MS+0,5 mg/l BA+0,2 mg/l IBA) và B4 (MS+0,5 mg/l BA+0,3 mg/l IBA) đều lớn hơn 15 chồi/cụm (trừ nghiệm thức đối chứng). Nghiệm thức B2 (MS+0,5 mg/l BA+0,1 mg/l IBA) cho số chồi cao hơn các nghiệm thức khác với số chồi trung bình là 33,67 chồi/cụm, khác biệt có ý nghĩa so
với các nghiệm thức khác ở mức 5%. Đây là nghiệm thức duy nhất có số chồi nhiều hơn 30 chồi/cụm. (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Theo ghi nhận ở tại thời điểm này chiều dài trung bình chồi của các nghiệm thức có sự khác biệt có ý nghĩa ở mức 5%. Ở nghiệm thức B1 (MS+0,5 mg/l BA) cho chiều dài trung bình chồi cao nhất đạt 19,72 mm/chồi. Nghiệm thức B2 (MS+0,5 mg/l BA+0,1 mg/l IBA) cho chiều dài trung bình chồi thấp nhất đạt 13,52 mm/chồi.
Bảng 8: Kết quả khảo sát hiệu quả của sự kết hợp BA- IBA lên sự tái sinh chồi ở thời điểm 60 ngày sau khi cấy
Trên cùng một cột, các giá trị có cùng kí tự là khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%. Ghi chú: ĐC=nghiệm thức đối chứng; B1=môi trường MS bổ sung BA 0,5mg/l ; B2=môi trường MS bổ sung BA 0,5mg/l và IBA 0,1mg/l; B3=môi trường MS bổ sung BA 0,5mg/l và IBA 0,2mg/l; B4=môi trường MS bổ sung BA 0,5mg/l và IBA 0,3mg/l.
Kết quả trong thí nghiệm này cao hơn so với của Rafail và Khitam (2012). Khi tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây trên môi trường MS có bổ sung BA ở các nồng độ 0;0,3;0,5;1 mg/l kết hợp NAA ở các nồng độ 0; 0,1; 0,2; 0,3 mg/l với mẫu cấy mô sẹo sau 6 tuần, nghiệm thức cho kết quả tối ưu nhất là 28,13 chồi/cụm. Kết quả này thấp
Nghiệm thức
Thời điểm 60 ngày sau khi cấy
Số chồi/cụm Chiều dài chồi
(mm) ĐC 0,00 0,00 B1 22,33c 19,72a B2 33,67a 13,52c B3 18,67c 14,02bc B4 29,33b 16,01b P- value 0,00 0,00 CV (%) 10,16 9,96
hơn nghiệm thức B2 (MS+0,5 mg/l BA+0,1mg/lIBA) với 33,67 chồi/cụm.
Dựa vào kết quả ta thấy rằng số lượng chồi và chiều dài chồi không tỉ lệ thuận với nồng độ chất điều hòa sinh trưởng. Theo Nguyễn Bảo Toàn (2010) sự hình thành chồi hay rễ ở mô sẹo tùy thuộc vào tỉ lệ cytokinin và auxin. Sự tạo chồi cần có sự kết hợp giữa một tỉ lệ cao cytokinin và auxin thấp. Sự tạo chồi có hiệu quả ở sự kết hợp các chất điều hòa sinh trưởng cytokinin và auxin ở một tỉ lệ phù hợp.
Hình 4. Chồi măng tây trên môi trƣờng có BA-IBA
(A) Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA
(B) Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA+0,1 mg/l IBA (C) Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA+0,2 mg/l IBA (D) Môi trường có bổ sung 0,5 mg/l BA+0,3 mg/l IBA
Ngoài ra, số lượng chồi và chiều dài chồi có mối tương quan với nhau. Nhìn chung, khi số lượng chồi tăng thì chiều dài chồi lại có xu hướng giảm và ngược lại. Điều này có thể thấy ở các nghiệm thức B1, B2, B4. Nghiệm thức B2 (MS+0,5 mg/l BA+0,1mg/l IBA) cho số chồi nhiều nhất 33,67 chồi/cụm nhưng chiều dài chồi lại thấp nhất chỉ 13,52mm/chồi. Trong khi đó nghiệm thức B1 (MS+0,5 mg/l BA) cho số chồi khá thấp 22,33 chồi/cụm nhưng chiều dài chồi lại hơn các nghiệm thức khác 19,72mm/chồi. Nguyên nhân có thể là do khi số lượng chồi nhiều và thời gian nuôi
C
B A
cấy lâu nên chất dinh dưỡng không đảm bảo đủ cho tất cả chồi phát triển. Do đó có thể thấy rằng chỉ có thể chọn một trong hai yếu tố là số chồi hoặc chiều dài. Nếu quan tâm đến chiều dài chồi thì nghiệm thức B1 (MS+0,5 mg/l BA) sẽ được chú ý. Chiều dài chồi ở nghiệm thức này hơn hẳn các nghiệm thức khác nên thời gian để kéo dài thân, tạo cây hoàn chỉnh có thể được rút ngắn. Nếu quan tâm đến số lượng chồi thì nghiệm thức B2 MS+0,5 mg/l BA+0,1mg/l IBA) sẽ được ưu tiên. Tuy chiều dài chồi ở nghiệm thức này thấp nhất, tốn nhiều thời gian kéo dài thân cũng như tạo cây hoàn chỉnh nhưng số cây thu được sẽ cao hơn các nghiệm thức còn lại. Nghiệm thức B2 được chọn để tái sinh chồi từ mô sẹo măng tây xanh.
4.3. Thí nghiệm 3: Hiệu quả của nƣớc dừa lên sự sinh trƣởng của mô sẹo măng tây xanh măng tây xanh
Nước dừa đã được sử dụng đầu tiên trong nuôi cấy mô bởi Van Overbeek vào năm 1941. Trong nước dừa có chứa nhiều amino acid, acid hữu cơ, vitamin, đường. Ngoài ra nước dừa cũng có chứa hormone thực vật như auxin, gibberellin, cytokinin (Dis and Van, 1981). Do đó, việc bổ sung nước dừa vào môi trường nuôi cấy có thể giúp cho tế bào thực vật phân chia và phát triển nhanh. Mặc dù vậy, việc bổ sung này không thể thay thế cho các thành phần có trong môi trường nuôi cấy (Zoltan et al., 2011). Kết quả ghi nhận được, sau 10 ngày nuôi cấy trên môi trường MS có bổ sung nước dừa 0-200ml/l, mô sẹo bắt đầu có sự gia tăng kích thước ở các nghiệm thức. Các chỉ tiêu được theo dõi đến 30 ngày sau khi cấy.
Kết quả trình bày ở Bảng 9 cho thấy sau khi cấy 10 ngày các mô sẹo có sự tăng trưởng trên môi trường có bổ sung nước dừa. Ở nghiệm thức MSD3 (MS+200 ml/l nước dừa) cho đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo măng tây xanh là lớn nhất, đạt 47,33%. Nghiệm thức đối ĐC (MS) cho đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo măng tây xanh là nhỏ nhất, đạt 42%. Tuy nhiên, các nghiệm thức có sự khác biệt không có ý nghĩa về mặt thống kê ở mức 5%. Trong khoảng thời gian này, có thể là do các cụm mô sẹo chuyển sang môi trường mới cần thời gian thích nghi nên phát triển chậm
Ở thời điểm sau khi cấy 20 ngày, đường kính gia tăng tương đối của mô sẹo