3. Nội dung nghiên cứu
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ lá cây Dâu tằm
Hình 3.1. Quy trình tách chiết các hợp chất hữu cơ từ lá dâu tằm (Morus alba L.)
Từ 3 kg bột lá cây Dâu tằm khô được ngâm 3 lần trong ethanol 96%, loại dung môi thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số 150 g, phần bã còn lại dùng để tách chiết qua các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau: n- hexan, ethylacetate. Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua các dung môi của lá cây Dâu tằm được trình bày ở bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n - hexan 39.6 g Cao
n - hexan
Chiết bằng n - hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 32 g Cao
ethylacetate 150 g Cao
ethanol
Bã sau khi chiết bằng ethanol
Chiết ethanol 3 lần 3000 g lá cây Dâu tằm khô
Chiết bằng ethylacetate
Trung Thị Tuyết Mai 30 K36B - Sinh
Bảng 3.1. Khối lƣợng cao thu đƣợc khi chiết qua các phân đoạn và hiệu suất Mẫu
Các PĐ
Lá Dâu tằm
Mẫu thu đƣợc (g) Hiệu suất chiết rút (%)
EtOH 150 5
n – Hexan 39.6 1,3
Ethylacetate 32 1,1
Từ bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng trong số các phân đoạn trên có hiệu suất chiết rút cao nhất là cao phân đoạn ethanol (5%), tiếp đến là cao phân đoạn n – hexan (1,3%). Cuối cùng, thấp nhất là cao phân đoạn ethylacetate (1,1%).
Phương pháp chiết rút được trình bày ở hình 3.1, chúng tôi đã thu được một số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả định tính, định lƣợng một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm
Để củng cố và đánh giá các thành phần hợp chất tự nhiên cơ bản có trong lá cây Dâu tằm chúng tôi tiến hành khảo sát định tính và định lượng các hợp chất.
3.2.1. K t quả h t h t s hợp hất tự hi ó tr g y u t
Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Trung Thị Tuyết Mai 31 K36B - Sinh
Bảng 3.2. Bảng kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm
Chú thích:
(-): Không phản ứng (+): Phản ứng
(++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy rằng, thành phần các hợp chất trong lá cây Dâu tằm khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như flavonoid, tanin, alkaloid và glycoside. Đáng chú ý là phản ứng định tính flavonoid, glycoside, tannin cho kết quả khá rõ. Kết quả định tính cho thấy ethanol là một dung môi tách chiết tốt nhất đối với các hợp chất tự nhiên, tiếp đó là đến phân đoạn n - hexan và cuối cùng là phân đoạn ethylaxetate.
3.2.2. Ph t h thà h phầ hợp hất tự hi tr g ph ạ h hi t t y u t g phươ g ph p sắ ký ớp ỏ g
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với hệ dung môi TEAF (5 : 3 : 1 : 1) (toluen : ethylacetate :
Nhóm chất
Phản ứng nhận biết
Lá cây Dâu tằm
Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc
Flavonoid Shinoda ++ + + Diazo ++ + ++ NaOH 10% + + + H2SO4 ++ + + Tanin Vanillin + + + FeCl3/HCl ++ + +++ Gelatin + - + Alkaloid Dragendorf + + - Bouchardat - + - Glycoside Keller-Kilian ++ ++ ++ Saponin Tạo bọt - - -
Trung Thị Tuyết Mai 32 K36B - Sinh
acetone : acid formic). Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau.
Hình 3.2.Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết
Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn dịch chiết từ lá Dâu tằm xuất hiện khá nhiều vạch màu vàng (các hợp chất thuộc nhóm flavonoid), màu xanh (diệp lục), màu tím (tecpen).
Trên sắc kí đồ cho thấy phân đoạn cao ethanol xuất hiện nhiều băng vạch nhất khoảng 14 – 15 băng vạch, tiếp đến là phân đoạn n - hexan khoảng 12 vạch. Như vậy, ở loài thực vật nghiên cứu, phân đoạn ethanol có chứa nhiều nhóm hợp chất flavonoid nhất.
3.2.3. Đ h ượ g p yphe tổ g s ph ạ h hi t
Chúng tôi tiến hành định lượng hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin-Ciocalteau.
Chú thích: 1: Cao EtOH 2: Cao n-hexan 3: Cao EtOAc
Trung Thị Tuyết Mai 33 K36B - Sinh
3.2.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đƣờng chuẩn acid gallic (mg/l)
STT Acid gallic (mg/l) OD 765 nm 1 0 0,009 2 50 0,062 3 100 0,119 4 150 0,168 5 250 0,265 6 500 0,519 0 0.05 0.1 0.15 0.2 0.25 0.3 0 50 100 150 200 250 300 OD 7 6 5 nm Acid gallic (mg/L) y = 0.001x + 0.0128
Hình 3.3. Đồ thị đƣờng chuẩn acid gallic
3.2.3.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số
Bảng 3.4. Kết quả hàm lƣợng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết
Mẫu OD765nm Nồng độ polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) Polyphenol Cao EtOH 0,59 577,2 19,24 Cao n-hexan 0,5 487,2 16,24 Cao EtOAc 0,06 47,2 1,57
Trung Thị Tuyết Mai 34 K36B - Sinh
Kết quả bảng 3.3 cho thấy hàm lượng polyphenol trong phân đoạn cao EtOH là nhiều nhất chiếm 19,24%, tiếp đó là phân đoạn n - hexan (chiếm 16,24%). Phân đoạn EtOAc có hàm lượng hợp chất này thấp là 1,57%.
3.3. K t quả x h iều ấp
Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô gồm 10 con và được cho uống theo liều tăng dần đến 8 g/kg thể trọng. Sau 72 giờ theo dõi với các liều lượng khác nhau, không thấy có con chuột nào chết. Vì vậy chưa tính được LD50 theo đường uống. Điều đó chứng tỏ, các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm hoàn toàn không độc dù là liều rất cao theo đường uống.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp theo đƣờng uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500 mg/kg 10 0 0
7000 mg/kg 10 0 0
7500 mg/kg 10 0 0
Trung Thị Tuyết Mai 35 K36B - Sinh
KẾT LUẬN
- Dịch chiết lá cây Dâu tằm (Morus alba L.) chứa thành phần các hợp chất thiên nhiên khá phong phú, bao gồm: flavonoid, alkanoid, tannin và glycoside. Đặc biệt là cao phân đoạn EtOH, có hàm lượng polyphenol tổng số cao nhất và thành phần các hợp chất tự nhiên nhiều nhất.
- Các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm hoàn toàn không độc dù là liều rất cao theo đường uống.
Trung Thị Tuyết Mai 36 K36B - Sinh
KIẾN NGHỊ
Qua kết quả bước đầu nghiên cứu phân tích thành phần dịch chiết lá cây Dâu tằm (Morus alba L.) cho thấy lá dâu chứa hàm lượng hợp chất thiên nhiên rất phong phú. Cần tiếp tục đi sâu tìm hiểu thành phần, cấu trúc hóa học của các hợp chất trong dịch chiết từ lá Dâu tằm và đánh giá tác dụng nó để hướng tới điều chế, thử nghiệm thực phẩm chức năng từ đối tượng này.
Trung Thị Tuyết Mai 37 K36B - Sinh
TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt
[1]. Đỗ Huy Bích, Đặng Quang Chung, Bùi Xuân Chương, Nguyễn Thượng Đông, Đỗ Trung Đàm, Phạm Văn Hiển, Vũ Hữu Lộ, Phạm Duy Mai, Phạm Kim Mãn, Đoàn Thị Thu, Nguyễn Tập, Trần Toàn (2004), Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam, Nxb Khoa học và kỹ thuật, Hà Nội.
[2]. Đỗ Thị Châm, Hà Văn Phúc (1996), Cây dâu, Nxb Nông nghiệp. [3]. Võ Văn Chi (1998), Những cây rau làm thuốc, Nxb Đồng Tháp.
[4]. Nguyễn Phương Dung, Lê Võ Định Tường (2001), Kết quả bước đầu nghiên cứu một số cây thuốc, bài thuốc chữa bệnh đái tháo đường, Tạp chí Y học Thực hành, 8, tr. 50 - 52.
[5]. Nguyễn Văn Đàn, Ngô Ngọc Khuyến (1999), Hợp chất thiên nhiên dùng làm thuốc, Nxb Y học Hà Nội.
[6]. Phạm Hoàng Hổ (1999), Cây cỏ Việt Nam, Nxb Trẻ, tập 2, tr. 540.
[7]. Nguyễn Văn Long (2005), Dâu tằm - ong mật, Bài giảng khoa Nông học, Đại học Nông nghiệp I Hà Nội, tr. 7 - 9.
[8]. Vũ Ngọc Lộ (2005), Những dược liệu có tác dụng hạ đường huyết và trị tiểu đường, Tạp chí Dược học, 353, tr. 7 - 8.
[9]. Đỗ Tất Lợi (2004), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, tr. 721 - 722.
[10]. Nguyễn Kim Phi Phụng (2007), Phương pháp cô lập hợp chất hữu cơ, Nxb Đại học quốc gia Tp Hồ Chí Minh.
[11]. Phạm Ngọc Thiện, Lê Ngọc Liên (2005), Chiết xuất, xác định hàm lượng polyphenol và đánh giá tác dụng chống Oxy hoá của các mẫu bột chiết lá dâu, Tạp chí Nghiên cứu Y học, 38, tr. 34 - 38.
[12]. Nguyễn Quang Trung (2006), “Đánh giá tác dụng bột chiết lá dâu trên các chỉ số lipid và trạng thái chống oxy hoá trong máu ở chuột nhắt
Trung Thị Tuyết Mai 38 K36B - Sinh
trắng gây rối loạn lipid máu và đái tháo đường thực nghiệm”. Báo cáo khoa học.
Tài liệu tiếng Anh
[13]. Ju Chi Liua et al. (2003), “Antihypertensive effects of tannins isolated from traditional Chinese herbs as non-specific inhibitors of angiontensin converting enzyme”, Life Sciences, 12: 1543-1555.
[14]. Lin-Ling Wang, Ze-Yang Zhou (2008), Effect of extracts of mulberry leaves processed differently on the activity of anpha-glucosidase. Journal of Food, Agriculture & Environment Vol.6 (3&4): 86-89.
[15]. Lorke D. A. (1983), A new approach to practical acute toxicity testing, Arch Toxicol , Vol 54: 275-287.
[16]. Singleton V. L., Lamuela-Raventos R.M., Othofer R. (1999), Analysis of total phenols and other oxidation substrates and antioxidants by means of Forlin-Ciocalteu Reagent, Methods in Enzymemology, 152-178.