3. Nội dung nghiên cứu
2.2.Hóa chất và dụng cụ thí nghiệm
- Hoá chất dùng cho quá trình tách chiết: ethanol 960
, n - hexan, ethylacetate.
- Các hoá chất dùng định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết lá cây Dâu tằm: shinoda, diazo, NaOH 10%, H2SO4, vanillin, FeCl3/HCl, gelatin, dragendorf, bouchardat, Keller-Kilian…
- Dung dịch TEAF: toluene, etylaxetat, axeton, axit formic theo tỷ lệ 5:3:1:1.
- Cân phân tích, máy ly tâm, máy đo OD, pipetman, bản sắc ký…
2.3. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.3.1. Phươ g ph p t h hi t ph ạ t y u t
3000 g lá cây Dâu tằm (Morus alba L.) sau khi được lấy về rửa sạch, thái nhỏ, phơi trong bóng râm cho khô. Xử lí mẫu khô bằng cách ngâm chiết với ethanol 960 ở điều kiện phòng khoảng 220C trong vòng 45 ngày (quá trình được lặp lại 3 lần). Các dịch chiết lọc qua giấy lọc và cô đặc lại, thu được cao cồn tổng số.
Phần bã sau khi được chiết bằng cồn tiếp tục tiến hành chiết phân đoạn qua các dung môi với độ phân cực tăng dần: n - hexan; ethylaxetat. Mỗi phân đoạn được chiết 3 lần và tính kết quả trung bình. Khối lượng các phân đoạn dịch chiết trong các thí nghiệm được tính gián tiếp từ thành phần phần trăm của mẫu khô tuyệt đối.
2.3.2. Phươ g ph p khả s t thà h phầ hó họ ủ lá y u t m
2.3.2.1. Định tính một số nhóm hợp chất tự nhiên
Cao các phân đoạn được hòa tan trong dung môi thích hợp với từng loại phản ứng định tính.
* Đ h t h f v i
Trung Thị Tuyết Mai 22 K36B - Sinh
- Phản ứng Shinoda: chuẩn bị ống nghiệm có chứa mẫu phản ứng, thêm một ít bột magie, nhỏ thêm vài giọt acid clohidric (HCl) đặc, sau đó đun sôi trên nồi cách thuỷ trong vài phút. Phản ứng này cho kết quả dương tính khi dung dịch xuất hiện màu hồng, đỏ hay da cam.
- Phản ứng diazo hóa: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia nhỏ thêm vài giọt thuốc thử diazo. Phản ứng cho kết quả dương tính khi trong ống nghiệm xuất hiện màu da cam.
- Phản ứng với acid sunfuric: cho dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt acid sunfuric đặc. Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của flavon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron.
- Phản ứng định tính catechin: nhỏ một giọt dung dịch mẫu lên giấy lọc, nhỏ tiếp lên một giọt dung dịch vanilin trong HCl đặc. Kết quả cho màu đỏ son là phản ứng dương tính.
* Đ h t h t i
Mẫu thử cũng được pha như trên và làm các phản ứng:
- Phản ứng với vanilin: chia dung dịch mẫu vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt thuốc thử vanilin/H2SO4. Phản ứng dương tính khi thu được màu đỏ đậm.
- Phản ứng với gelatin/NaCl: cho vài giọt thuốc thử vào dung dịch mẫu, phản ứng dương tính khi trong dung dịch xuất hiện vẩn đục.
* Đ h t h p yphe kh
- Phản ứng với dung dịch kiềm: dung dịch mẫu thử được pha như trên. Dung dịch mẫu được chia vào 2 ống nghiệm, một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng dương tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: nhỏ dung dịch FeCl3 trong HCl 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu thử được pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả dương tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
Trung Thị Tuyết Mai 23 K36B - Sinh
* Đ h t h g y si e
Phản ứng Keller-Killian:
- Dung dịch A: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid acetic 10%. - Dung dịch B: thêm 0,5 ml dung dịch FeCl3 5% vào 50 ml acid sunfuric đặc.
Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm 1 ml dung dịch A lắc cho tan hết, rồi nghiêng ống nghiệm cho từ từ dung dịch B vào. Phản ứng dương tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
* Đ h t h k i
Mẫu thử được pha trong dung dịch acid acetic 2% với một lượng thích hợp để làm các phản ứng.
- Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(NO3)3 và KI trong dung dịch acid acetic): alkaloid phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
- Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HCl): alkaloid cho kết tủa màu nâu sẫm khi phản ứng với thuốc thử Bouchardat.
* Đ h t h s p i
Phản ứng tạo bọt: Mẫu thử đã pha như ở trên. Dung dịch mẫu thử được chia vào 2 ống: ống 1 cho 5 ml dung dịch NaOH 0,5N (pH = 13), ống 2 cho 5 ml dung dịch HCl 0,1N (pH = 1). Sau đó cho vào mỗi ống 5 ml dịch chiết mẫu thử, lắc mạnh hai ống. Nếu thấy có nhiều bọt và bền vững ở môi trường kiềm (ống 1) thì cho thấy sự có mặt của saponin steroid, môi trường acid (ống 2) là saponin tritecpen.
Trung Thị Tuyết Mai 24 K36B - Sinh
Các nhóm phản ứng được trình bày tóm tắt trong bảng sau:
Bảng 2.1. Các phản ứng định tính Nhóm hợp
chất Phản ứng Thuốc thử Dấu hiệu nhận biết
Flavonoid
Shinoda Mg/HCl
Màu đỏ, hồng, da cam xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của flavon, flavonol và các dẫn xuất hydro của chúng
Diazo hóa Diazo Phản ứng cho màu da cam là dương tính
Dung dịch
kiềm NaOH 10%
Phản ứng có kết quả dương tính khi xuất hiện màu vàng cam
Acid
sulfuric H2SO4 10%
Phản ứng cho màu vàng đậm cho thấy sự có mặt của favon và flavonol, màu đỏ hay nâu cho thấy sự có mặt của chalcon và auron
Vanilin/HCl Màu đỏ son xuất hiện chứng tỏ sự có mặt của catechin
Tanin
Vanilin/H2SO4
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu đỏ đậm
Dung dịch 5% Gelatin/1% NaCl
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện kết tủa
Acetate chì 10% Phản ứng dương tính nếu kết tủa xuất hiện
Trung Thị Tuyết Mai 25 K36B - Sinh Alkaloid Bouchardat Hỗn hợp KI+I2/HCl Phản ứng dương tính nếu có màu đỏ thẫm vansMayer Hỗn hợp HgCl2+ KI Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu trắng hoặc vàng nhạt
Dragendorf Phản ứng dương tính nếu có kết tủa màu da cam
Glycoside Keller - Killian
Phản ứng dương tính nếu xuất hiện vòng đỏ nâu ở bề mặt phân cách giữa hai lớp chất lỏng
Polyphenol khác
Dung dịch kiềm Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu vàng
FeCl3/HCl Phản ứng dương tính nếu xuất hiện màu lục, xanh, đen
2.3.2.2. Định lượng polyphenol tổng số theo phương pháp Folin-Ciocalteau
Nguyên tắc: dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin - Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 765 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [16].
Các bước tiến hành như sau:
-Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy, dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5 mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200 g Na2CO3 + 800 ml H2O đun sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đem lọc và dẫn nước cất tới 1000 ml.
Trung Thị Tuyết Mai 26 K36B - Sinh
Dung dịch mẫu cần định lượng.
- Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
Chuẩn bị các định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sau: 0, 1, 2, 3, 5 và 10 ml sau đó dẫn nước cất tới 100 ml ta thu được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
Cho vào mỗi cuvert 20 µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ khác nhau) + 1,58 ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin - Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300 µl Na2CO3. Để hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 200C rồi xác định ở bước sóng 765 nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
- Định lượng polyphenol
Định lượng polyphenol của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20 µl (0,02 ml) để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic.
2.3.2.3. Phương pháp sắc ký lớp mỏng
Sắc ký lớp mỏng (TLC - Thin layer chromatography) là kĩ thuật sắc ký khá phổ biến bởi khả năng phân tách tốt, dễ thực hiện và ít tốn kém. Sắc ký lớp mỏng được sử dụng trong phân tích thành phần của dược liệu và định tính các chất trong dược liệu, cao chiết.
Nguyên tắc:
Kĩ thuật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha tĩnh (bản mỏng) và pha động (hệ dung môi chạy sắc ký). Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamide.... Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
Phương pháp:
Các mẫu (đã pha trong dung môi thích hợp) được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích 20 x 20 cm. Hệ dung môi được sử dụng là TEAF = 5: 3: 1: 1 (toluen : ethylacetate : acetone : acid formic).
Trung Thị Tuyết Mai 27 K36B - Sinh
Hình 2.3. Hình minh họa bản chấm sắc ký
1: Cao ethanol 2: Cao n-hexan 3: Cao ethylacetate
- Dùng ống vi quản để chấm mẫu lên bản sắc ký. Mẫu chấm phải nhỏ gọn, không để lan rộng, dùng máy sấy làm khô ngay. Chấm lặp lại nhiều lần.
- Tiến hành chạy sắc ký: cho bản sắc ký vào bình sắc ký đã chứa sẵn dung môi triển khai. Đặt bản sắc ký vào gờ nhỏ ở đáy bình. Đậy nắp bình, dung môi sẽ thấm lên bản sắc ký theo lực mao dẫn và phân tách các thành phần hoạt chất của mẫu. Chấm dứt chạy mẫu khi dung môi thấm đến 2/3 bản sắc ký.
- Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10%: sau khi tiến hành chạy sắc ký, cho bản sắc ký vào dung dịch H2SO4 10% để lên màu, hơ nguội trên ngọn lửa đèn cồn, quan sát và đánh giá.
2.3.3. Thử t h ấp, x h L 50
Trong nghiên cứu bào chế, thử nghiệm thuốc và các chế phẩm tự nhiên giai đoạn tiền lâm sàng, việc thử độc cấp tính có vai trò quan trọng trong đánh giá hiệu lực an toàn của thuốc và phương hướng dùng liều cho các nghiên cứu tiếp theo. Nghiên cứu độc tính cấp của thuốc trên động vật thí nghiệm, chủ yếu là xác định liều chết trung bình hay là liều làm chết 50% số động vật thí nghiệm (LD50) trong những điều kiện nhất định. Chỉ số LD50 là cơ sở để đánh giá độc tính của thuốc, liều dùng thí nghiệm dược lý một cách đúng đắn.
Trung Thị Tuyết Mai 28 K36B - Sinh
Tuy nhiên chỉ căn cứ vào LD50 mà bỏ qua các dấu hiệu ngộ độc khác sẽ không khách quan. Trên thí nghiệm độc tính cấp, cần quan sát các triệu chứng bệnh lý quan trọng ở chuột không chết hoặc trước khi chết như: gãi mõm liên tục, chạy hoảng loạn, ngã siêu vẹo, co giật, run rẩy, ra mồ hôi, tím tái ở tai, chân, đuôi, tư thế nằm, đứng...
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ lá cây Dâu tằm trên chuột nhắt trắng bằng đường uống theo phương pháp của Lorke [15]. Chuột cho nhịn đói trước 16h thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô 10 con và chuột được uống liều từ thấp đến cao. Bước nhảy liều được dùng trong thí nghiệm là 500 mg/kg thể trọng (tăng đần theo mỗi lô), liều cao nhất cho uống là 8000 mg/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện chuột chết trong 72h để đánh giá mức độ độc của dịch chiết.
Trung Thị Tuyết Mai 29 K36B - Sinh
CHƢƠNG 3
KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Quy trình tách chiết các phân đoạn từ lá cây Dâu tằm
Hình 3.1. Quy trình tách chiết các hợp chất hữu cơ từ lá dâu tằm (Morus alba L.)
Từ 3 kg bột lá cây Dâu tằm khô được ngâm 3 lần trong ethanol 96%, loại dung môi thu được tổng khối lượng mẫu cao cồn tổng số 150 g, phần bã còn lại dùng để tách chiết qua các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau: n- hexan, ethylacetate. Khối lượng mẫu thu được khi lần lượt chiết qua các dung môi của lá cây Dâu tằm được trình bày ở bảng 3.1.
Bã sau khi chiết bằng n - hexan 39.6 g Cao
n - hexan
Chiết bằng n - hexan
Bã sau khi chiết bằng ethylacetate 32 g Cao
ethylacetate 150 g Cao
ethanol
Bã sau khi chiết bằng ethanol
Chiết ethanol 3 lần 3000 g lá cây Dâu tằm khô
Chiết bằng ethylacetate
Trung Thị Tuyết Mai 30 K36B - Sinh
Bảng 3.1. Khối lƣợng cao thu đƣợc khi chiết qua các phân đoạn và hiệu suất Mẫu
Các PĐ
Lá Dâu tằm
Mẫu thu đƣợc (g) Hiệu suất chiết rút (%)
EtOH 150 5
n – Hexan 39.6 1,3
Ethylacetate 32 1,1
Từ bảng 3.1 chúng tôi thấy rằng trong số các phân đoạn trên có hiệu suất chiết rút cao nhất là cao phân đoạn ethanol (5%), tiếp đến là cao phân đoạn n – hexan (1,3%). Cuối cùng, thấp nhất là cao phân đoạn ethylacetate (1,1%).
Phương pháp chiết rút được trình bày ở hình 3.1, chúng tôi đã thu được một số cao phân đoạn tan trong các dung môi hữu cơ có độ phân cực khác nhau để sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.2. Kết quả định tính, định lƣợng một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm
Để củng cố và đánh giá các thành phần hợp chất tự nhiên cơ bản có trong lá cây Dâu tằm chúng tôi tiến hành khảo sát định tính và định lượng các hợp chất.
3.2.1. K t quả h t h t s hợp hất tự hi ó tr g y u t
Chúng tôi tiến hành định tính thành phần một số hợp chất tự nhiên thông qua các phản ứng hóa học và một số thuốc thử tương ứng. Kết quả được trình bày ở bảng 3.2.
Trung Thị Tuyết Mai 31 K36B - Sinh
Bảng 3.2. Bảng kết quả định tính một số hợp chất tự nhiên trong các phân đoạn dịch chiết từ lá cây Dâu tằm
Chú thích:
(-): Không phản ứng (+): Phản ứng
(++): Phản ứng mạnh (+++): Phản ứng rất mạnh
Kết quả định tính cho thấy rằng, thành phần các hợp chất trong lá cây Dâu tằm khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như flavonoid, tanin, alkaloid và glycoside. Đáng chú ý là phản ứng định tính flavonoid, glycoside, tannin cho kết quả khá rõ. Kết quả định tính cho thấy ethanol là một dung môi tách chiết tốt nhất đối với các hợp chất tự nhiên, tiếp đó là đến phân đoạn n - hexan và cuối cùng là phân đoạn ethylaxetate.
3.2.2. Ph t h thà h phầ hợp hất tự hi tr g ph ạ h hi t t y u t g phươ g ph p sắ ký ớp ỏ g
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với hệ dung môi TEAF (5 : 3 : 1 : 1) (toluen : ethylacetate :
Nhóm chất
Phản ứng nhận biết
Lá cây Dâu tằm
Cao EtOH Cao n-hexan Cao EtOAc
Flavonoid Shinoda ++ + + Diazo ++ + ++ NaOH 10% + + + H2SO4 ++ + + Tanin Vanillin + + + FeCl3/HCl ++ + +++ Gelatin + - + Alkaloid Dragendorf + + - Bouchardat - + - Glycoside Keller-Kilian ++ ++ ++ Saponin Tạo bọt - - -
Trung Thị Tuyết Mai 32 K36B - Sinh
acetone : acid formic). Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiều băng vạch có màu sắc khác nhau.
Hình 3.2.Sắc ký đồ các phân đoạn dịch chiết
Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy kết quả sắc ký đồ của các phân đoạn dịch chiết từ lá Dâu tằm xuất hiện khá nhiều vạch màu vàng (các hợp chất thuộc nhóm flavonoid), màu xanh (diệp lục), màu tím (tecpen).
Trên sắc kí đồ cho thấy phân đoạn cao ethanol xuất hiện nhiều băng vạch nhất khoảng 14 – 15 băng vạch, tiếp đến là phân đoạn n - hexan khoảng 12 vạch. Như vậy, ở loài thực vật nghiên cứu, phân đoạn ethanol có chứa nhiều nhóm hợp chất flavonoid nhất.
3.2.3. Đ h ượ g p yphe tổ g s ph ạ h hi t
Chúng tôi tiến hành định lượng hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin-Ciocalteau.
Chú thích: 1: Cao EtOH 2: Cao n-hexan 3: Cao EtOAc
Trung Thị Tuyết Mai 33 K36B - Sinh
3.2.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic