Quá trình chiết

Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.

- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.

- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.

Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.

Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.

Ví dụ:

- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye.

- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.

- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.

- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.

Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.

1.4. Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ

Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.

1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí

Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.

Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…).

Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của

sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.

Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.

1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí

Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:

n = n.b.C

1+b.C

n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.

n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp

phụ nào đó.

b : Hằng số.

C : Nồng độ của chất bị hấp phụ.

1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí

Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.

+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột

+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang

- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí

+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ. + Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký

lớp mỏng, sắc ký cột.

 Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình

phân tách chất.

- Sắc ký phân chia (partition chromatography)

+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)

+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.

- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.

+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.

- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thể là chất lỏng

+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao đổi anion và nhựa trao đổi cation.

- Sắc ký lọc gel (size exclusion chromatography, gel filtration chromatography)

+ Pha động chỉ có thể là chất lỏng.

+ Pha tĩnh là chất rắn, đó là những hạt hình cầu bằng polymer, trên bề mặt có nhiều lỗ rỗng.

- Sắc ký ái lực (arrinicy chromatography)

+ Sắc ký ái lực dựa vào tính bám dính của một protein, các hạt trong cột có nhóm hóa học kết dính bằng liên kết cộng hóa trị. Một protein có ái lực với nhóm hóa học này sẽ gắn vào các hạt và di chuyển sẽ bị cản trở.

+ Đây là một phương pháp rất hiệu quả và được ứng dụng rộng rãi trong việc tinh sạch protein.

- Sắc ký lỏng cao áp

+ Kỹ thuật sắc ký lỏng cao áp là một dạng mở rộng của kỹ thuật sắc ký cột có khả năng phân tách protein được cải thiện đáng kể. Bản thân vật liệu tạo cột vốn đã có sự phân chia rõ ràng và như thế sẽ có nhiều vị trí tuơng tác dẫn đến khả năng phân tách được tăng lên đáng kể. Bởi vì cột được làm từ vật liệu mịn hơn nên phải có một áp lực tác động lên cột để có được một tốc độ chảy thích hợp.

 Phân loại sắc ký theo cấu hình (chromatography configuration)

- Sắc ký giấy và sắc ký lớp mỏng (paper thin – layer chromatography). Trong sắc ký giấy:

+ Pha tĩnh: một tờ giấy bằng cellulos + Pha động: là chất lỏng

+ Pha động: luôn luôn là chất lỏng

- Sắc ký cột hở cổ điển (classical open column chromatography)

+ Sắc ký cột hở cổ điển là tên gọi để chỉ loại sắc ký sử dụng một ống hình trụ, được đặt dựng đứng, với đầu trên hở và đầu dưới có gắn một khóa.

+ Pha tĩnh rắn được nhồi vào ống hình trụ. Mẫu cần tách được đặt lên trên bề mặt của pha tĩnh

+ Pha động là dung môi được liên tục rót vào đầu cột

Dựa vào trạng thái tập hợp của pha động, người ta chia sắc kí thành hai nhóm lớn: sắc kí lỏng và sắc kí khí.

Dựa vào cách tiến hành sắc kí, người ta chia sắc kí thành các nhóm nhỏ: sắc kí cột và sắc kí lớp mỏng.

1.4.3.1. Sắc kí cột (C.C)

Đây là phương pháp sắc kí phổ biến nhất, đơn giản nhất, chất hấp phụ là pha tĩnh gồm các loại silica gel (có kích thước hạt khác nhau) pha thường và pha đảo YMC, ODS, Dianion. Chất hấp phụ được nhồi vào cột (cột có thể bằng thuỷ tinh hoặc kim loại, phổ biến nhất là cột thuỷ tinh). Độ mịn của chất hấp phụ rất quan trọng, nó phản ánh số đĩa lí thuyết hay khả năng tách của chất hấp phụ. Kích thước của chất hấp phụ càng nhỏ thì số đĩa lí thuyết càng lớn, khả năng tách càng cao, và ngược lại. Tuy nhiên, nếu chất hấp phụ có kích thước hạt càng nhỏ thì tốc độ chảy càng giảm, có thể gây ra hiện tượng tắc cột (dung môi không chảy được). Khi đó người ta phải sử dụng áp suất, với áp suất trung bình (MPC) hoặc áp suất cao (HPLC).

Trong sắc kí cột, tỉ lệ đường kính (D) so với chiều cao cột (L) rất quan trọng, nó thể hiện khả năng tách của cột. Tỉ lệ L/D phụ thuộc vào yêu cầu tách, tức là phụ thuộc vào hỗn hợp chất cụ thể.

Trong sắc kí, tỉ lệ giữa quãng đường đi của chất cần tách so với quãng

đường đi của dung môi gọi là Rf , với mỗi một chất sẽ có một Rf khác nhau.

Nhờ vào sự khác nhau về Rf này mà ta có thể tách từng chất ra khỏi hỗn hợp.

Tỉ lệ chất so với tỉ lệ chất hấp phụ cũng rất quan trọng. Tuỳ theo yêu cầu tách mà ta có tỉ lệ khác nhau: Tách thô thì tỉ lệ này thấp (1/5 – 1/10), tách tinh thì tỉ lệ này cao hơn và tuỳ vào hệ số tách (tức phụ thuộc vào sự khác

nhau Rf của các chất), mà hệ số này trong khoảng 1/20 – 1/30.

Trong sắc kí cột, việc đưa chất lên cột hết sức quan trọng. Tuỳ thuộc vào lượng chất và dạng chất mà người ta có thể đưa chất lên cột bằng các phương pháp khác nhau. Nếu lượng chất nhiều và chạy thô thì phổ biến là tẩm chất vào silica gel rồi làm khô, tơi hoàn toàn, đưa lên cột. Nếu tách tinh thì đưa trực tiếp chất lên cột bằng cách hoà tan chất bằng dung môi chạy cột với lượng tối thiểu.

Có hai cách đưa chất hấp phụ lên cột:

- Cách 1: Nhồi cột khô.

Theo cách này, chất hấp phụ được đưa trực tiếp vào cột khi còn khô, sau đó dùng que mềm để gõ nhẹ lên thành cột để chất hấp phụ sắp xếp chặt trong cột. Sau đó dùng dung môi chạy cột để chạy cột đến khi cột trong suốt.

- Cách 2: Nhồi cột ướt.

Chất hấp phụ được hoà tan trong dung môi chạy cột trước với lượng dung môi tối thiểu, sau đó đưa dần lên cột đến khi đủ lượng cần thiết.

Khi chuẩn bị cột phải lưu ý không được để bọt khí bên trong (nếu có

bọt khí gây nên hiện tượng chạy rối trong cột, giảm hiệu quả tách) và cột không được nứt, gãy, dò.

Tốc độ chảy của dung môi cũng ảnh hưởng đến hiệu quả tách. Nếu tốc

1.4.3.2. Sắc kí lớp mỏng

Sắc kí lớp mỏng (SKLM) thường được sử dụng để kiểm tra và định

hướng cho sắc kí cột. SKLM được tiến hành trên bản mỏng tráng sẵn silica gel trên đế nhôm hay đế thuỷ tinh. Ngoài ra, SKLM còn dùng để điều chế thu chất trực tiếp. Bằng việc sử dụng bản SKLM điều chế (bản được tráng sẵn silica gel dày hơn), có thể đưa lượng chất nhiều hơn lên bản và sau khi chạy sắc kí, người ta có thể cạo riêng phần silica gel có chứa chất cần tách rồi giải hấp phụ bằng dung môi thích hợp để thu được từng chất riêng biệt. Có thể phát hiện chất trên bản mỏng bằng đèn tử ngoại, bằng chất hiện màu đặc

trưng cho từng lớp chất hoặc sử dụng dung dịch H2SO4 10%.

1.5. Một số phương pháp hoá lý xác định cấu trúc của các hợp chất hữu cơ

Cấu trúc hoá học các hợp chất hữu cơ được xác định nhờ vào phương pháp phổ kết hợp. Tuỳ thuộc vào cấu trúc hoá học của từng chất mà người ta sử dụng phương pháp phổ cụ thể. Cấu trúc càng phức tạp thì yêu cầu phối hợp các phương pháp phổ càng cao. Trong một số trường hợp, để xác định chính xác cấu trúc hoá học của các hợp chất, người ta phải dựa vào các phương pháp bổ sung khác như chuyển hoá hoá học, các phương pháp sắc kí so sánh…[3-5].

1.5.1. Phổ hồng ngoại (Infrared Spectroscopy, IR)

Phổ hồng ngoại được xây dựng dựa vào sự khác nhau về dao động của các liên kết trong phân tử hợp chất dưới sự kích thích của tia hồng ngoại. Mỗi kiểu liên kết được đặc trưng bởi một vùng bước sóng khác nhau. Do đó dựa vào phổ hồng ngoại, có thể xác định được các nhóm chức đặc trưng trong hợp chất, ví dụ như dao động hoá trị của nhóm OH tự do trong các nhóm hydroxyl

là 3300 - 3450 cm-1, của nhóm cacbonyl C = O trong khoảng 1700 - 1750 cm-1,

của nhóm C = C trong vùng 1630 – 1650 cm-1, của nhóm ete C – O – C trong

tay, được sử dụng để nhận dạng các hợp chất hữu cơ theo phương pháp so sánh trực tiếp.

Hiện nay, thông tin chung thu được từ phổ hồng ngoại không nhiều, mà lượng chất cần để thực hiện phép đo này lại cần đến 2 – 3 mg chất và khó thu hồi lại. Vì vậy, thường đối với các hợp chất thiên nhiên (lượng chất thu được ít) thì phổ hồng ngoại được đo sau khi đã hoàn chỉnh các phép đo khác.

1.5.2. Phổ khối lượng (Mass Spectroscopy, MS)

Nguyên tắc của phương pháp phổ này là dựa vào sự phân mảnh ion của phân tử chất dưới sự bắn phá của chùm ion bên ngoài. Phổ MS còn cho các pic ion mảnh khác mà dựa vào đó người ta có thể xác định được cơ chế phân mảnh và dựng lại được cấu trúc hoá học của các hợp chất. Hiện nay có rất nhiều loại phổ khối lượng, như những phương pháp chủ yếu sau:

- Phổ EI-MS (Electron Impact Ionization Mass Spectroscopy) dựa vào

sự phân mảnh ion dưới tác dụng của chùm ion bắn phá năng lượng khác nhau, phổ biến là 70eV.

- Phổ ESI-MS (Electron Sprayt Ionization Mass Spectroscopy) gọi là

phổ phun mù điện tử. Phổ này được thực hiện với năng lượng bắn phá thấp hơn nhiều so với phổ EI-MS, do đó phổ thu được chủ yếu là pic ion phân tử và các pic đặc trưng cho sự phá vỡ các liên kết có mức năng lượng thấp, dễ bị phá vỡ.

- Phổ FAB-MS (Fast Atom Bombing Mass Spectroscopy) là phổ bắn

phá nguyên tử nhanh với sự bắn phá nguyên tử nhanh ở năng lượng thấp, do đó phổ thu được cũng dễ thu được pic ion phân tử.

- Phổ khối lượng phân giải cao (High Resolution Mass Spectroscopy),

cho phép xác định pic ion phân tử hoặc ion mảnh với độ chính xác cao.

dễ bay hơi như tinh dầu hay LC-MS (sắc kí lỏng - khối phổ) cho các hợp chất khác. Các phương pháp kết hợp này còn đặc biệt hữu hiệu khi phân tích thành phần của hỗn hợp chất (nhất là phân tích thuốc trong ngành dược).

1.5.3. Phổ cộng hưởng từ hạt nhân (Nuclear Magnetic Resonance Spectroscopy NMR) Spectroscopy NMR)

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân là một phương pháp phổ hiện đại và hữu hiệu nhất hiện nay. Với việc sử dụng kết hợp các kỹ thuật phổ NMR một chiều và hai chiều, các nhà nghiên cứu có thể xác định chính xác cấu trúc của