Các hợp chất phenolic thực vật có tác dụng chống lại bức xạ tia cực tím hoặc ngăn chặn các tác nhân gây bệnh, ký sinh trùng và động vật ăn thịt cũng như làm tăng các màu sắc của thực vật. Do sự phân bố rộng rãi của chúng trong hầu hết các bộ phận của cây vì thế các polyphenol đóng vai trò quan trọng đối với sức khỏe của con người nên chế độ ăn uống dinh dưỡng đã và đang được chú ý trong những năm gần đây. Các nhà nghiên cứu và các nhà sản xuất thực phẩm đã tập trung vào các polyphenol có đặc tính chống oxy hóa mạnh trong chế độ ăn uống, các hiệu ứng đáng tin cậy của chúng trong việc phòng ngừa những chứng bệnh căng thẳng oxy hóa liên quan. Theo các nghiên cứu dịch tễ học, hấp thụ các hợp chất phenolic sẽ giảm được nguy cơ mắc các bệnh tim mạch ngăn ngừa được bệnh ung thư. Hơn nữa các polyphenol còn có các tác dụng sinh lý học cụ thể trong việc ngăn ngừa và điều trị bệnh.
Các hợp chất phenol như arbutin được dùng để sát trùng đường niệu, các hợp chất salycylat có tác dụng chống viêm, các ester của acid cinnamic trong actisô (như cynarin, các acid phenolic) có tác dụng bảo vệ gan. Các ester của phenylpropanoid glycosid đã được chứng minh có nhiều tác dụng quan trọng như ức chế men CAMP phosphodiesterase (forsythiasid, planta-
majosid), ức chế men aldose reductase (verbacosid). Verbacosid, forsythiasid ức chế men 5-LO(5-lipoxygenase) trong bạch cầu hạt ở người và ở màng bụng chuột. Nhiều hợp chất phenol có tác dụng kháng khẩn và kháng nấm. Coumarin cũng có nhiều tác dụng dược lý quan trọng bao gồm chống đông máu, kích thích tố, làm nhạy cảm với da, diệt vi trùng, thuốc giãn mạch, diệt côn trùng, trừ giun sán, giảm đau, hạ nhiệt, làm bền và bảo vệ thành mạch như aesculetin, bergapten và fraxin. Coumarin glycosid có tác dụng chống nấm và chống ung thư. Coumarin và các dẫn xuất có khả năng kích thích đại thực bào nên có thể dùng làm thuốc điều trị vết bỏng và các vết thương do nhiệt. Ngoài ra chúng còn gây nên sự thay đổi đáng kể trong điều hòa đáp ứng miễn dịch. Chúng đóng vai trò gián tiếp qua sự điều biến của hệ miễn dịch chủ, do đó kích thích hoạt tính miễn dịch dẫn tới bảo vệ chống lại sự tái phát của khối u, hoặc giảm kích thước các khối u nhỏ và tác dụng trực tiếp ức chế
phát triển đối với dòng tế bào u ác tính in vitro, thí dụ dịch chiết metanol của
Tordylium (chứa umbeliferon, isoimperatorin và dẫn xuất angelicin) ức chế dòng tế bào ung thư KB (ung thư mũi hầu) và NSCLS-N6 (dòng tế bào ung thư biểu mô cuống phổi). Trong khi, tác dụng ức chế ung thư của tannin chủ yếu do khả năng kết hợp của tanin với các chất gây ung thư. Tanin ở nồng độ cao ức chế hoạt động của các enzyme, nhưng ở nồng độ thấp chúng thường kích thích hoạt tính các enzyme. Tanin đóng vai trò đặc biệt trong nén ép bề mặt màng nhầy sau khi vào cơ thể, vì vậy nó dùng để trị bệnh tiêu chảy nhưng phải thải trừ ngay khỏi đường tiêu hóa bằng cách dùng thuốc nhuận tràng. Ngoài ra tanin có tác dụng chống chảy máu, giảm đau và làm giảm nồng độ acid trong dạ dày. Nước ép quả hồng có chứa nhiều tannin ngưng tụ được dùng ở Nhật để điều trị cao huyết áp và ngăn ngừa chứng đột quỵ. Casuarinin,
phân được có trong thành phần cây chó đẻ răng cưa (Phylanthus amarus
Chum. et Thonn.) được dùng để điều trị viêm gan virus do ức chế tín hiệu điều khiển protein kinase, hay ức chế tương tác giữa HBV enhacer I và các yếu tố dịch mã tế bào. Thành phần polyphenol có tác dụng chống oxy hóa chính trong chè xanh… Lignan và các cây có chứa lignan đã được sử dụng lâu đời trong y học cổ truyền, chúng có tác dụng bảo vệ gan như schizandrin, iso schizandrin và các gomisin A, B, C, D, F và G tìm thấy trong quả cây ngũ
vị tử (Schizandra chinensis (Turcz.) Baill., họ Ngũ vị - Schizandraceae) cho
thấy tác dụng bảo vệ gan rất tốt, tăng tổng hợp protein gan được dùng để điều trị viêm gan mạn có men gan tăng, điều trị tổn thương gan,… Lignan acid
nordihydroguaaretic – NDGA (trong cây Larrea mexicana) là một trong
những hợp chất thiên nhiên có tác dụng chống oxy hóa mạnh, ức chế men 5- LO, ức chế tế bào ung thư được dùng làm thuốc chống oxy hóa, chống ung thư và chống viêm. Nghiên cứu cho thấy Lignan và neolignan có tác dụng ức chế men, đặc biệt là men C-AMP phosphodiesterase và các men của quá trình hô hấp, chống dị ứng và viêm khớp, ức chế yếu tố hoạt hóa tiểu cầu. Một số lignan là dẫn xuất của xyclolignan naphtalenhay tetrahydro-naphtalen có tác dụng chống virus. Từ dịch chiết chó đẻ răng cưa, các nhà khoa học Thái Lan đã chiết được 2 dẫn xuất của lignan là phylanthin và hydrophylanthin có hoạt tính đối với dòng tế bào ung thư KB-V1đã kháng vinblastin. Một số lignan có thể kết hợp với protein (kể cả enzyme), polysaccharide, acid nucleic tạo các phân tử có tác dụng kháng sinh và trừ sâu bọ cho cây.
1.3. Các phƣơng pháp chiết mẫu thực vật
Sau khi tiến hành thu hái và làm khô mẫu, tuỳ thuộc vào đối tượng chất có trong mẫu khác nhau (chất phân cực, chất không phân cực, chất có độ phân cực trung bình…) mà ta chọn dung môi và hệ dung môi khác nhau.
1.3.1. Chọn dung môi chiết
Thường thì các chất chuyển hoá thứ cấp trong cây có độ phân cực khác nhau. Tuy nhiên những thành phần tan trong nước ít khi được quan tâm. Dung môi dùng trong quá trình chiết cần phải được lựa chọn rất cẩn thận.
Điều kiện của dung môi là phải hoà tan được những chất chuyển hoá thứ cấp đang nghiên cứu, dễ dàng được loại bỏ, có tính trơ (không phản ứng với chất nghiên cứu), không dễ bốc cháy, không độc.
Nếu dung môi có lẫn các tạp chất thì có thể ảnh hưởng đến hiệu quả và chất lượng của quá trình chiết. Vì vậy những dung môi này nên được chưng cất để thu được dạng sạch trước khi sử dụng. Thường có một số chất dẻo lẫn trong dung môi như các diankyl phtalat, tri-n-butyl-axetylcitrar và tributylphosphat. Những chất này có thể lẫn với dung môi trong quá trình sản xuất hoặc trong khâu bảo quản như trong các thùng chứa hoặc các nút đậy bằng nhựa.
Methanol và chlorofrom thường chứa dioctylphtalat [di-(2-etylhexyl)- phtalat hoặc bis-2-etylhexyl-phtalat]. Chất này sẽ làm sai lệch kết quả phân lập trong các quá trình nghiên cứu hoá thực vật, thể hiện hoạt tính trong thử nghiệm sinh học và có thể làm bẩn dịch chiết của cây. Chlrofrom, metylen clorit và methanol là những dung môi thường được lựa chọn trong quá trình chiết sơ bộ một phần của cây như: lá, thân, rễ, củ, quả, hoa…
Những tạp chất của chlorofrom như CH2Cl2, CH2ClBr có thể phản ứng
với một vài hợp chất như các ancaloit tạo muối bậc 4 và những sản phẩm khác. Tương tự như vậy, sự có mặt của lượng nhỏ axit clohiđric (HCl) cũng có thể gây ra sự phân huỷ, sự khử nước hay sự đồng phân hoá với các hợp chất khác. Chlorofrom có thể gây tổn thương cho gan và thận nên khi làm việc với chất này cần được thao tác khéo léo, cẩn thận ở nơi thoáng mát và
Methanol và ethanol 80% là những dung môi phân cực hơn các hiđrocacbon thế clo. Người ta cho rằng các dung môi thuộc nhóm rượu sẽ thấm tốt hơn lên màng tế bào nên quá trình chiết với các dung môi này sẽ thu được lượng lớn các thành phần trong tế bào. Trái lại, khả năng phân cực của chlorofrom thấp hơn, nó có thể rửa giải các chất nằm ngoài tế bào. Các ancol hoà tan phần lớn các chất chuyển hoá phân cực cùng với các hợp chất phân cực trung bình và thấp. Vì vậy, khi chiết bằng ancol thì các chất này cũng bị hoà tan đồng thời. Thông thường dung môi cồn trong nước có những đặc tính tốt nhất cho quá trình chiết sơ bộ.
Tuy nhiên cũng có một vài sản phẩm mới được tạo thành khi dùng methanol trong suốt quá trình chiết. Thí dụ trechlonolide A thu được từ trechlonaetes aciniata được chuyển thành trechlonolide B bằng quá trình phân huỷ 1-hydroxytropacocain cũng xảy ra khi erythroxylum novogranatense được chiết trong methanol nóng.
Người ta thường ít sử dụng nước để thu được dịch chiết thô từ cây mà thay vào đó là dùng dung dịch nước của methanol.
Dietyl ete hiếm khi được dùng cho các quá trình chiết thực vật vì nó rất dễ bay hơi, bốc cháy và rất độc, đồng thời nó có xu hướng tạo thành peroxit dễ nổ. Peroxit của dietyl ete dễ gây phản ứng oxi hoá với các hợp chất không có khả năng tạo cholesterol như các carotenoid. Tiếp đến là axeton cũng có thể tạo thành axetonit nếu 1,2-cis-diol có mặt trong môi trường axit. Quá trình chiết dưới điều kiện axit hoặc bazơ thường được dùng với quá trình phân tách đặc trưng, cũng có khi xử lí các dịch chiết bằng axit-bazơ có thể tạo thành những sản phẩm mong muốn.
Sự hiểu biết về những đặc tính của những chất chuyển hoá thứ cấp trong cây được chiết sẽ rất quan trọng để từ đó lựa chọn dung môi thích hợp cho quá trình chiết, tránh được sự phân huỷ chất bởi dung môi và quá trình tạo thành chất mong muốn.
Sau khi chiết, dung môi được cất ra bằng máy cất quay ở nhiệt độ
không quá 30-400C, với một vài hoá chất chịu nhiệt có thể thực hiện ở nhiệt
độ cao hơn.
1.3.2. Quá trình chiết
Hầu hết quá trình chiết đơn giản được phân loại như sau: - Chiết ngâm.
- Chiết sử dụng một loại thiết bị là bình chiết Xoclet. - Chiết sắc với dung môi nước.
- Chiết lôi cuốn theo hơi nước.
Chiết ngâm là một trong những phương pháp được sử dụng rộng rãi nhất trong quá trình chiết thực vật bởi nó không đòi hỏi nhiều công sức và thời gian. Thiết bị sử dụng là một bình thuỷ tinh với một cái khoá ở dưới đáy để điều chỉnh tốc độ chảy thích hợp cho quá trình tách rửa dung môi. Dung môi có thể nóng hoặc lạnh nhưng nóng sẽ đạt hiệu quả chiết cao hơn. Trước đây, máy chiết ngâm đòi hỏi phải làm bằng kim loại nhưng hiện nay có thể dùng bình thuỷ tinh.
Thông thường quá trình chiết ngâm không được sử dụng như phương pháp chiết liên tục bởi mẫu được ngâm với dung môi trong máy chiết khoảng 24 giờ rồi chất chiết được lấy ra. Thông thường quá trình chiết một mẫu chỉ thực hiện qua 3 lần dung môi vì khi đó cặn chiết sẽ không còn chứa những chất giá trị nữa. Sự kết thúc quá trình chiết được xác định bằng một vài cách khác nhau.
Ví dụ:
- Khi chiết các ancaloid, ta có thể kiểm tra sự xuất hiện của hợp chất này bằng sự tạo thành kết tủa với những tác nhân đặc trưng như tác nhân Đragendroff và tác nhân Maye.
- Các flavonoid thường là những hợp chất màu. Vì vậy, khi dịch chiết chảy ra mà không có màu sẽ đánh dấu sự rửa hết những chất này trong cặn chiết.
- Khi chiết các chất béo thì nồng độ trong các phần của dịch chiết ra và sự xuất hiện của cặn chiết tiếp theo sau đó sẽ biểu thị sự kết thúc quá trình chiết.
- Các lacton của sesquitecpen và các glicozid trợ tim, phản ứng Kedde có thể dùng để biểu thị sự xuất hiện của chúng hoặc khi cho phản ứng với aniline axetat sẽ cho biết sự xuất hiện của các hydrat cacbon và từ đó có thể biết được khi nào quá trình chiết kết thúc.
Như vậy, tuỳ thuộc vào mục đích cần thiết lấy chất gì để lựa chọn dung môi cho thích hợp và thực hiện quy trình chiết hợp lí nhằm đạt hiệu quả cao. Ngoài ra, có thể dựa vào mối quan hệ của dung môi và chất tan của các lớp chất mà ta có thể tách thô một số lớp chất ngay trong quá trình chiết.
1.4. Các phƣơng pháp sắc kí trong phân lập các hợp chất hữu cơ
Phương pháp sắc kí (Chromatography) là một phương pháp phổ biến và hữu hiệu nhất hiện nay, được sử dụng rộng rãi trong việc phân lập các hợp chất hữu cơ nói chung và các hợp chất thiên nhiên nói riêng.
1.4.1. Đặc điểm chung của phương pháp sắc kí
Sắc kí là phương pháp tách, phân tích, phân li các chất dựa vào sự khác nhau về bản chất hấp phụ và sự phân bố khác nhau của chúng giữa hai pha: pha động và pha tĩnh.
Sắc kí gồm có pha động và pha tĩnh. Khi tiếp xúc với pha tĩnh, các cấu tử của hỗn hợp sẽ phân bố giữa pha động và pha tĩnh tương ứng với tính chất của chúng (tính bị hấp phụ, tính tan…).
Phương pháp sắc kí dựa trên sự khác biệt về tốc độ di chuyển của các chất trong pha động khi tiếp xúc mật thiết với một pha tĩnh. Nguyên nhân của
sự khác nhau đó là do khả năng bị hấp phụ và phản hấp phụ khác nhau hoặc do khả năng trao đổi khác nhau của các chất ở pha động với các chất ở pha tĩnh.
Các chất khác nhau sẽ có ái lực khác nhau với pha động và pha tĩnh. Trong quá trình pha động chuyển động dọc theo hệ sắc kí hết lớp pha tĩnh này đến lớp pha tĩnh khác, sẽ lặp đi lặp lại quá trình hấp phụ và phản hấp phụ. Kết quả là các chất có ái lực lớn với pha tĩnh sẽ chuyển động chậm hơn qua hệ thống sắc kí so với các chất tương tác yếu hơn với pha này. Nhờ đặc điểm này mà người ta có thể tách các chất qua quá trình sắc kí.
1.4.2. Cơ sở của phương pháp sắc kí
Phương pháp sắc kí dựa vào sự phân bố khác nhau của các chất giữa pha động và pha tĩnh. Ở điều kiện nhiệt độ không đổi, định luật mô tả sự phụ thuộc của lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh với nộng độ của dung dịch (hoặc với chất khí là áp suất riêng phần) gọi là định luật hấp phụ đơn phân tử đẳng nhiệt Langmuir:
n = n.b.C
1+b.C
n : Lượng chất bị hấp phụ lên pha tĩnh lúc đạt cân bằng.
n : Lượng cực đại của chất có thể bị hấp phụ lên một chất hấp
phụ nào đó.
b : Hằng số.
C : Nồng độ của chất bị hấp phụ.
1.4.3. Phân loại các phương pháp sắc kí
Trong phương pháp sắc kí: Pha động là các chất ở trạng thái khí hay lỏng, còn pha tĩnh có thể là các chất ở trạng thái lỏng hoặc rắn.
+ Pha tĩnh là chất rắn: Thường là alumin hoặc silica gel đã được xử lý, nó có thể nạp nén vào trong một cột
+ Pha tĩnh là chất lỏng: Có thể là một chất lỏng được tẩm lên bề mặt một chất mang
- Pha động: Có thể là chất lỏng hoặc chất khí
+ Pha động là chất khí: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký khí. Trong truờng hợp này chất khí được gọi là khí mang hay khí vectơ. + Pha động là chất lỏng: Thí dụ trong kỹ thuật sắc ký giấy, sắc ký
lớp mỏng, sắc ký cột.
Phân loại sắc ký theo bản chất của hiện tựợng xảy ra trong quá trình
phân tách chất.
- Sắc ký phân chia (partition chromatography)
+ Pha động là chất lỏng hoặc chất khí (trong sắc ký khí)
+ Pha tĩnh là chất lỏng, lớp chất lỏng với chiều dày rất mỏng, chất lỏng này đuợc nối hóa học lên bề mặt của những hạt rắn, nhuyễn và mịn.
- Sắc ký hấp thụ (Adsorption chromatography) + Pha động là chất lỏng hoặc chất khí.
+ Pha tĩnh là chất rắn: đó là những hạt rắn nhuyễn mịn, có tính trơ, được nhồi trong một cái ống. Bản thân hạt rắn là pha tĩnh, pha tĩnh thường sử dụng là những hạt silica gel hoặc alumin.
- Sắc ký trao đổi ion (Ion exchange chromatography) + Pha động chỉ có thể là chất lỏng
+ Pha tĩnh là chất rắn, là những hạt hình cầu rất nhỏ, có cấu tạo hóa học là polymer nên gọi là hạt nhựa. Bề mặt của hạt mang các nhóm chức hóa học ở dạng ion. Có hai loại hạt nhựa: nhựa trao