Sắc ký lớp mỏng (TLC - thin lay r chromatography là kĩ th ật sắc ký khá nhanh gọn và tiện lợi. Nó giúp nhận biết các nhóm chất có trong mẫu nghiên cứ . Phương pháp sắc ký lớp mỏng, thành phần trong hỗn hợp được xác định nhờ so sách hệ số lư của hỗn hợp (Rf) và hệ số lư của một số chất đã biết [1].
Nguyên tắc: Kĩ th ật này dựa vào mức độ tương tác của các chất khác nhau với pha tĩnh bản mỏng và pha động (hệ dung môi chạy sắc ký . Pha tĩnh có thể là silicagel, bột Al2O3 hoặc polyamid .... Pha động là một hỗn hợp từ hai dung môi trở lên với các độ phân cực khác nhau tuỳ thuộc vào mẫu phân tích.
ươ p áp Các mẫ đã pha trong d ng môi thích hợp được tiến hành chạy sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn DC-Alufolien 60 F254 (Merck 1,05715) kích
thước phù hợp trên các hệ d ng môi khác nha để lựa chọn ra hệ dung môi phù hợp nhất. Một số hệ d ng môi được sử dụng:
- Hệ d ng môi được sử dụng: TEAF: 5:3:1:1 (Toluen- ethylacetate- acetone- acid formic).
- Toluen: ethylacetate: Acid formic = 5:4:1. - tylax tat: acid ocmic: Nước = 8:1:1.
Hiện màu bằng dung dịch H2SO4 10% được phun đều trên bản mỏng. Xác định hệ số lư f) theo công thức: Rf = a/b. Trong đó a là khoảng di chuyển của chất nghiên cứu, b là khoảng di chuyển của dung môi.
2.2.2.3. Định lượng pholyphenol tổng số theo phương pháp Folin- Ciocalteau
Nguyên tắc: Dựa trên phản ứng của các hợp chất polyphenol (trong mẫu) với thuốc thử Folin-Ciocalteau cho sản phẩm màu xanh lam. So màu trên máy quang phổ UV VIS 1000 ở bước sóng λ = 6 nm, dùng chất chuẩn là acid gallic [1].
ác bước tiế à ư s
Chuẩn bị mẫu định lượng và hóa chất
Dung dịch acid gallic: 0,5 g acid gallic + 10 ml C2H5OH + 90 ml H2O bảo quản lạnh. Như vậy dịch chuẩn gốc acid gallic có nồng độ 5mg/ml.
Dung dịch Na2CO3: 200g Na2CO3 + 800 ml H2O đ n sôi. Thêm một vài tinh thể Na2CO3, sau 24 giờ đ m lọc và dẫn nước cất tới 1000 ml.
Dung dịch mẫu cần định lượng.
Tiến hành xây dựng đường chuẩn acid gallic
Chuẩn bị ống định lượng theo số lượng dung dịch gốc như sa : 0, 1, 2, 3, và 10 ml sa đó dẫn nước cất tới 100 ml ta th được các nồng độ 0, 50, 100, 150, 250 và 500 mg/l acid gallic.
22
Cho vào mỗi cuvert 20µl mẫu thử (dung dịch gallic chuẩn ở các nồng độ hoặc dịch chiết các phân đoạn) + 1,58ml H2O + 100 µl thuốc thử Folin- Ciocalteau sau 30 giây đến 8 phút cho thêm 300µl Na2CO3. ể hỗn hợp dung dịch phản ứng trong 2 giờ ở 20o
C rồi xác định ở bước sóng 765nm. Tiến hành định lượng acid gallic để dựng đường chuẩn.
Đ lượng phenolic của mẫu nghiên cứu bằng cách lấy 20µl 0,02ml để định lượng tương tự như đã làm với mẫu chuẩn acid gallic. ịnh tính một số nhóm hợp chất tự nhiên từ các phân đoạn dịch chiết th được.
ƯƠNG 3: K T QU VÀ TH O LU N.
3.1. Quy trình tách chiế các p â đoạn từ cây GCL (Gynostemma pentaphyllum
thunb)
ể tìm hiểu thành phần hóa học của GCL, chúng tôi tiến hành chiết như đã mô tả ở phần phương pháp th được cao ethanol. Phân bố đề cao thanol trong nước cất, sa đó chiết phân lớp lần lượt với các d ng môi có độ phân cực tăng dần: n- hexan, chloroform và ethylacetat. Kết quả được trình bày trên sơ đồ 3.1 và bảng 3.1.
Hình 3.1. Mô hình chiế rú các p â đoạn hợp chất tự nhiên từ Giảo cổ lam
Loại dung môi 38 63 Đ n -hexan Phần còn lại (bã) 6 6 Đ ethylacetate 64.8 Đ ước 0 8 Đ c loroform Phần còn lại (bã) Loại dung môi
Loại dung môi Để lại 20% là (40 g) khố lượng cao ethanol tổng số Bổ sung ethylacetate Bổ sung chloroform Bổ s ước,n –hexan 200 g Cao ethanol tổng số 3000g Giảo cổ lam Chiết ethanol 3 lần
24
Với quy trình chiết rút như trên, chúng tôi th được hiệu suất chiết rút các phân đoạn hợp chất tự nhiên từ 3000 gam bột mịn GCL như bảng 3.1.
B ng 3.1. Hiệu su t chiế ú n từ Gi o c lam
â đoạn Mẫu ban đầu (g) Khối khô tuy đối (g) Hi u suất chiết rút (% nguyên li u khô)* Cao ethanol 160 30 18,75 Cao n – hexan 38,63 2,23 5,77 Cao chloroform 10,08 0,32 2,96 Cao ethylacetate 26,6 0,9 3,37 Cao P nước 64,8 7,1 10,96
* % Tính theo nguyên liệu khô ban đầu
Hiệu suất chiết rút cao nhất là ở phân đoạn cao ethanol (18,75%) so với khối lượng nguyên liệ khô ban đầu là 40g, tiếp đến là cao phân đoạn nước (10,96 %), cao phân đoạn n-h xan , % , cao phân đoạn ethylacetate là (3,37%), và thấp nhất cao phân đoạn chloroform (2,96%). Kết quả này cho thấy trong GCL có chứa một lượng lớn các hợp chất tự nhiên.
3.2. Kết quả đ nh tính một số hợp chất tự ê ro p â đoạn
Nhằm góp phần đánh giá thành phần các hợp chất tự nhiên cơ bản có trong cao các phân đoạn từ dịch chiết GCL, chúng tôi tiến hành các phản ứng định tính, định lượng và sắc ký lớp mỏng.
3.2.1. Đ nh tính một số hợp chất tự nhiên có trong GCL
Sử dụng các thuốc thử đặc trưng cho từng nhóm hợp chất tự nhiên, chúng tôi th được kết quả trình bày trong bảng 3.2.
Bảng 3.2. Kết quả đ í các p â đoạn d ch chiết Giảo cổ lam
Nhóm chất Thuốc thử Mẫu Cao ethanol Cao n-hexan Cao CHCl3 Cao EtOAc đ ước Flavonoid Shinoda +++ +++ +++ ++ + Diazo + + - ++ - H2SO4 đặc ++ ++ - ++ + Catechin Vanilin/HCl đ + + + - - Tannin Vanilin ++ ++ ++ ++ +++ Gelatin/NaCl ++ + + ++ + Acetat chì + + + ++ ++ Polyphenol khác NaOH 10% ++ + + + - FeCl3 5% ++ ++ + ++ + Glycoside Keller-killian +++ ++ + ++ ++ Saponin Tạo bọt +++ +++ +++ +++ ++ Alkaloid Mayer + - - + - Dragendroff ++ + + ++ + Bouchardat + - - + - Ghi chú: (+): Các mức phản ứng dương tính,
26
Kết quả định tính cho thấy rằng, thành phần các hợp chất trong Giảo cổ lam khá phong phú, có đầy đủ các nhóm hợp chất tự nhiên phổ biến như lavonoid, Saponin, Tannin, Glycosid . Trong đó:
Ở phân đoạn cao Ethanol, n-Hecxan, thylac tat , phân đoạn nước hầu hết các phản ứng với các nhóm chất đề là dương tính. Trong khi đó, ở phân đoạn cao cồn tổng số hầ như có chứa các nhóm chất Saponin, flavonoid, catechin, glycoside, alkaloid và tannin (Vanilin).
Ở phân đoạn cao n-Hexan thấy có mặt nhiều Flavonoid, Saponin, Glycoside, các chất còn lại đều có mặt với lượng tương đối trừ Bouchardat, Mayer không có mặt.
Ở phân đoạn cao chloroform có chứa tương đối đầy các chất trừ các chất với phản ứng Diazo, H2SO4, Mayer, Bouchardat. Trong đó các chất thấy với hàm lượng nhiều là flavonoid, polyphenol, saponin; các chất còn lại có nhưng với hàm lượng ít.
Ở phân đoạn cao ethylacetate thấy có hầu hết các chất với hàm lượng cao trừ Catechin không có.
Ở phân đoạn nước chứa nhiều tannin (Vanilin), Glycoside, saponin; không thấy xuất hiện catechin Diazo, Vanilin/HCl đ , NaOH 10%, Mayer, Bouchardat.
Từ bảng 3.2 ta thấy ở phân đoạn cao cồn tổng số, phân đoạn cao etylacetate và cao nước chứa rất nhiều saponin và flavonoid và mức phản ứng mạnh và rất mạnh, chứng tỏ là hợp chất có hoạt tính sinh học cao, có khả năng chống oxy hóa, kháng khuẩn, chống viêm, chống sự tăng sinh tế bào không kiểm soát. Kết quả định tính này giúp chúng tôi có những định hướng để tiếp tục nghiên cứu ở mức độ cao hơn.
3.2.2. Phân tích thành phần các hợp chất tự ê ro các p â đoạn d ch chiết từ cây GCL bằng sắc ký lớp mỏng
Chúng tôi đã tiến hành chạy sắc ký bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck Alufolien 60 F254 với nhiều hệ d ng môi khác nha . Q a thăm dò cho thấy hệ dung môi TEAF
(5:3:1:1) (Toluen-Ethylacetate-Acetone-acid Formic). Dùng chất hiện màu là H2SO4
10%, sấy khô trên bếp điện từ đến khi hiện màu là cho kết quả rõ nét nhất và được chúng tôi lựa chọn. Kết quả sắc ký đồ hình 3.2 cho thấy bản sắc ký xuất hiện nhiề băng vạch có màu sắc khác nhau.
1 2 3 4 5
Hình 3.2. Sắc ký đ các p â đoạn d ch chiết từ giảo cổ lam trong h dung môi Toluen: Ethylacetat: Aceton: Acid focmic = 5:3:1:1 (hi n màu bằng H2SO4 10%).
Qua quan sát trên sắc ký đồ, chúng tôi nhận thấy các phân đoạn dịch chiết từ cây GCL đều có nhiều vạch băng với nhiều màu sắc khác nhau. Màu sắc các băng vạch gồm các màu chủ yế như: mà vàng lavonoid , mà tím t cp n , mà xanh diệp lục). Chứng tỏ trong các phân đoạn dịch chiết từ cây GCL chứa nhiều polyphenol phong phú.
Cao phân đoạn cao cồn tổng số và cao ethylacetate là nhiề băng vạch nhất (8 và 9 băng điều này cho thấy ở hai phân đoạn này chứa nhiều flavonoid. Tiếp đến là phân đoạn cao nước, n-Hexan chứa ít băng hơn và 6 băng , phân đoạn CHCl3 ít nhất chỉ thấy sự xuất hiện của 4 băng.
Chú thích
1. Cao phân đoạn cồn tổng số 2. Cao phân đoạn n-hexan 3. Cao phân đoạn chloroform 4. Cao phân đoạn ethylacetate . Cao phân đoạn nước
28
iều này là hoàn toàn phù hợp với kết quả định tính ở trên và là cơ sở cho chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, n-hexan, chloroform, ethylacetate, cao phân đoạn nước vào mô hình chuột thí nghiệm trong những nghiên cứu tiếp sau.
3.2.3. Định lượng polyphenol tổng số t ong các phân đoạn dịch chiết theo phương pháp Folin - Ciocalteau
Chúng tôi tiến hành xác định hàm lượng polyphenol tổng số trong các phân đoạn dịch chiết bằng phương pháp Folin - Ciocalteau.
3.2.3.1. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic Bảng 3.3. Kết quả xây dựng đường chuẩn acid gallic
TT acid gallic (mg/l) OD (765nm) 1 0 0.009 2 50 0.062 3 100 0.119 4 150 0.168 5 250 0.265 6 500 0.519 0.009 0.062 0.119 0.168 0.265 0.519 y = 0.001x + 0.0128 R² = 0.9997 0 0.1 0.2 0.3 0.4 0.5 0.6 0 100 200 300 400 500 600 Acid gallic (mg/l) OD( 765nm)
3.2.3.2. Kết quả xác định hàm lượng polyphenol tổng số B ng 3 Đị ư ng polyphenol t ng số n dịch chiết từ GCL B ng 3 Đị ư ng polyphenol t ng số n dịch chiết từ GCL Mẫu OD765nm Nồng độ polyphenol (mg/l) Tỷ lệ (%) polyphenol Cao EtOH 0.512 496.2 4.962 Cao n-hexan 0.274 175.9 1.759 Cao EtOAc 0.597 132.1 1.321 Cao CHCl3 0.291 61.3 0.613 Cao nước 0.122 102.5 1.025
Bảng định lượng 4.4 cho thấy rằng, cho thấy hàm lượng polyphenol của cao cồn là nhiều nhất, với hàm lượng chiếm khoảng (4.962%). Tiếp th o là phân đoạn cao n-hexan (1.759%) và cao EtOAc với hàm lượng tương đương 1.321% , thấp hơn một chút là cao phân đoạn nước (1.025%) và cuối cùng là cao phân đoạn chloroform thấp nhất (0.613%). Kết quả đó chỉ ra rằng, thành phần hóa học trong cây GCL có chứa nhiều hợp chất có khả năng tan tốt trong cao thanol và cao thylac tat . iều này phù hợp với tính chất vật lý và sự phân cực của phân tử polyphenol, chúng tan tốt trong dung môi phân cực và ít tan trong dung môi không phân cực. Với hoạt tính sinh học cao của phân tử polyphenol chính vì vậy chúng tôi quyết định chọn các phân đoạn ethanol, ethylacetate, n-hexan, chloro orm, cao phân đoạn nước vào mô hình điều trị cho chuột gây béo phì và tiể đường type 2 ở chuột nhắt trắng.
30
3.3. T Q XÁ Đ N Ề Đ Ấ
Xác định LD50 của dịch chiết tổng số từ giảo cổ lam trên chuột nhắt trắng bằng đường uống th o phương pháp của Lorke. Chuột cho nhịn đói trước 16 giờ thí nghiệm, được phân lô ngẫu nhiên, mỗi lô con và được cho uống theo liề tăng dần đến 8g/kg thể trọng. Theo dõi biểu hiện và số chuột chết trong 72 giờ để đánh giá mức độ độc của dịch chiết từ GCL.
Bảng 3.5. Kết quả thử độc tính cấp eo đường uống
Liều uống mg/kg Tổng số chuột Số chuột chết % chuột chết
6500mg/kg 10 0 0%
7000mg/kg 10 0 0%
7500mg/kg 10 0 0%
8000mg/kg 10 0 0%
Sau 72 giờ theo dõi với các liều 6500, 7000, 7500 mg/kg thể trọng thấy không có con chuột nào chết. ến liều cao nhất 8000mg/kg thể trọng cũng không có con nào chết, vì vậy chưa tính được LD50, nghĩa là có thể kết luận các phân đoạn dịch chiết từ giảo cổ lam hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao th o đường uống.
ƯƠNG 4 T N N NG 4.1. T N
-Thành phần các hợp chất thiên nhiên trong Giảo cổ lam khá phong phú, chứa hầu hết các nhóm chất tự nhiên như lavonoid, saponin, glycosid , tannin, alkanoid.
- Giảo cổ lam hoàn toàn không độc dù ở liều rất cao th o đường uống.
4. . N NG
- Tiếp tục đi sâu tìm hiểu thành phần, cấu trúc hóa học của các chất trong phân đoạn dịch chiết từ cây GCL có tác dụng trong điều trị béo phì, rối loạn trao đổi lipit và hạ đường huyết.
- Tiếp tục đi sâ tìm hiể cơ chế giảm trọng lượng, giảm lipid máu, hạ glucose huyết hay tăng d ng nạp glucose huyết với thời gian điều trị lâ hơn.
32
T T
Tiếng Vi t
[1]. Borel J. P., Maquart X., Gillery P. H., Exposito M., (2006), Hóa sinh cho thầy
thuốc lâm sàng - Cơ chế phân tử và hóa học về căn nguyên của bệnh (Biên dịch Lê
ức Trình, Vũ Triệu An, Trịnh Văn inh, Phan Thị Phi Phi, Hoàng Văn ơn, Lương Tấn Thành, ặng Vũ Viêm , Nxb Y học, Hà Nội.
[2]. ào Thị Ngọc inh, 2010 , “ Khảo sát thành phần hóa học cây giảo cổ lam
(Gynostemma pentaphyllum Thunb)”, Luận án Hóa học.
[3]. ỗ Tất Lợi (2009), Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam, Nxb Y học, Nxb Thời đại.
[4]. Nguyễn ức Hoan 2002 , “ ột số hiểu biết về bệnh béo phì và điều trị béo phì, Công trình nghiên cứu Y học Quân sự”, Học viện quân y.
[5]. Nguyễn H y Cường, 2010 , “Bệnh đá tháo đường - những quan đ ểm hiện đạ ”, Nxb Y học, Hà Nội.
[6]. Nguyễn Thị Hà (2000), “Chuyển hóa lipid- óa s nh”, Nxb Y học, Hà Nội. [7]. Nguyễn Văn Th 2004 , “Bài giảng dược liệu tập 1”, Nxb Y học, Hà Nội.
[8]. Nguyễn Xuân Thắng 2006 , “Hóa sinh học” Dùng trong đào tạo dược sĩ đại học, Nxb Y học, Hà Nội.
[9]. Phùng Thanh Hương 2009 , “Nghiên cứu tác dụng hạ glucose huyết và ảnh hưởng lên chuyển hóa glucose của dịch chiết lá bằng lăng nước (Lagerstroemia
spec osa L.)”, Luận án tiến sĩ dược học, Hà Nội.
[10].Tạ Văn Bình 2006 , Bệnh đá tháo đường - tăng glucose máu, Nxb Y học, Hà Nội.
[11]. Thái Hồng Q ang 19 9 , “Góp phần nghiên cứu m t số biến chứng mạn tính trong
bệnh đá tháo đường”, Tóm tắt luận án PTS khoa học Y dược, Học viện Quân Y
[12]. Trần ức Thọ (2002), “Bệnh đá tháo đường”, Bài giảng bệnh học nội khoa, 1, Nxb Y học, Hà Nội.
Tiếng Anh
[13]. Barton D.P., Roger I.D., William E.C. (2001), “D sorders of l p ds
metabol sm”, Endocrinology & metabolism, 23,pp. 993-1075.
[14]. Gisele A. Souza, Geovana X. Ebaid, Fabio R. F. Seiva, Katiucha H. R. Rocha, Cristiano achado Galhardi, F rnanda ani and th l L. B. Nov lli, 200 , “N- Acetylcysteine an Allium Plant Compound Improves High-Sucrose Diet-Induced
Obes ty and Related Effects”, Hindawi Publishing Corporation, Brazil.
[15]. Gisele A. Souza, Geovana X. Ebaid, Fabio R. F. Seiva, Katiucha H. R. Rocha, Cristiano achado Galhardi, F rnanda ani and th l L. B. Nov lli, 200 , “N- Acetylcysteine an Allium Plant Compound Improves High-Sucrose Diet-Induced
Obes ty and Related Effects”, Hindawi Publishing Corporation, Brazil.
[16]. L nz n, . 200 . “The mechanism of alloxan-and streptozotocin- induced
d abetes”. Diabetologia 51: 216-226.
[17]. Meyers P. A., Bebder D. A. (2003), “Tan c ac d st mulates glucose transport
and inhibit adipocyte differention n 3T3 L1 cell”, Journal of Nutrition, 135, pp. 165-
171.
[18]. Ono Y., Hattori E., Fukaya Y, Imai S. (2006) “Ant -obesity effect of Nelumbo
nucifera leaves extract n m ce and rats”,Journal of Ethnopharmacology, 206 (2), pp.
238 – 244.
[19]. Pushparaj P. N., Tan B. K. H., Tan H. C. (2001), “The mechan sm of hypoglycemic of the semi-purified fractions of Averrhoa bilimbi in streptozotocin-
diabetic rats”, Life Sciences, 70, pp. 535-547.
Tài li u từ Webside:
[20]. http://nguyentampharma.com.vn/cay-thuoc-nam/giao-co-lam/.