Di
x 100%
Di: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn của biến chủng thứ i sau Đ . D0: Đƣờng kính trung bình vòng vô khuẩn của mẫu chứng.
Dựa vào kết quả để lựa chọn ra các biến chủng có % biến đổi hoạt tính kháng sinh dƣơng cao nhất.
2.3.7. p áp me c ìm
Tạo giống cấp 1: Chủng giống Streptomyces 183.220 nuôi cấy trên thạch nghiêng đƣợc 6 ngày, cấy sang bình nón có 100 ml MT2dt bằng 10 ml nƣớc, lắc trên máy lắc tròn nhiệt độ 28 0,10
C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 48h.
Chọn môi trƣờng lên men tốt nhất: Sau 48h trên máy lắc, giống cấp 1 đƣợc cấy vô trùng sang các bình nón 500 ml chứa các MTdt khác nhau với tỉ lệ Vgiống:Vmôi trƣờng = 1:10. Các bình lên men lắc ở nhiệt độ 28 0,10C, tốc độ quay 140 vòng/phút trong 120 giờ. Sau đó lọc hoặc li tâm, rồi thử HTKS theo PP giếng thạch.
Chọn chủng có khả năng lên men sinh tổng hợp kháng sinh tốt nhất: Các dạng chủng, biến chủng cần thử đƣợc nhân giống cấp 1 trên MT2dt, lên men trên môi trƣờng tối thích đã chọn cho sinh tổng hợp KS. Thử hoạt tính dịch lên men bằng phƣơng pháp giếng thạch.
2.3.8. p áp xác đị độ bề t, bề p của KS tro dịc me
Xác định độ bền nhiệt: Lấy 3 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 10ml. Ống 1 đun sôi trực tiếp 10 phút, ống 2 đun sôi cách thủy 30 phút, ống 3 để ở nhiệt độ thƣờng. Đem thử HTKS bằng phƣơng pháp giếng thạch. Đánh giá kết quả.
Xác định độ bền pH: Lấy 5 ống dịch lọc dịch lên men, mỗi ống khoảng 5 ml. Chỉnh pH dịch lên men trong ống về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Thử hoạt tính dịch trong ống sau 1 ngày, và sau 5 ngày.
2.3.9. p áp c ết k á s từ dịc ọc bằ du mô ữu c
Dịch lên men sau khi lọc loại bỏ sinh khối đƣợc chỉnh về pH 3, 5, 7, 9, 11 bằng dung dịch NaOH 1N và HCl 1N. Dịch lọc và DMHC đƣợc cho vào bình gạn với tỷ lệ 5:1, lắc kỹ 1- 3 phút, để phân lớp sau đó gạn riêng dung môi và lớp nƣớc. Thử hoạt tính của lớp dung môi và lớp nƣớc sau mỗi lần chiết bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc.
2.3.10. p áp xác đị các t à p ầ tro KS bằ sắc ký p mỏ
Sắc ký lớp mỏng: Chuẩn bị:
- ản mỏng sắc ký đƣợc hoạt hóa ở 1100C trong 30 phút.
- Pha dung môi đổ vào bình sắc ký (lớp dung môi <1 cm), để bão hòa trong 30 phút.
- Dùng mao quản chấm dịch chiết DMHC hoặc các phân đoạn lên bản mỏng, cách m p dƣới 1,5 cm, cách 2 m p bên 1 cm. Để khô tự nhiên, lặp lại 3-5 lần.
Khai triển sắc ký: Đặt bản mỏng vào bình sắc ký, khi dung môi chạy đến bản mỏng thì lấy ra, đánh dấu đƣờng dung môi chạy.
Hiện hình VSV: Đặt bản mỏng vào đĩa Petri vô trùng, đổ thạch có cấy VSV kiểm định lên, để ở tủ 370C trong 24h. Vết KS đƣợc xác định dựa vào vòng vô khuẩn. Tính Rf: Rf = dm v d d
dv: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến tâm vết.
ddm: Khoảng cách từ vạch xuất phát đến đƣờng dung môi chạy.
2.3.11. u k á s t ô bằ p p áp cất qua
Chiết dịch lên men với DMHC thích hợp, thu lấy pha DMHC đem cất quay chân không. Cạo cắn thu đƣợc, hòa tan vết bằng một lƣợng nhỏ methanol, đổ vào cốc có mỏ, sấy 50 – 600C cho đến khô. Cạo thu lấy bột KS thô.
2.3.12. c ế k á s t ô bằ sắc ký cột
Sắc ký cột:
Chuẩn bị nhƣ sau:
- Mẫu thử: ột KS thô thu đƣợc sau cất quay dịch chiết DMHC. - Dung môi: pha đúng theo tỷ lệ.
- Cột: đƣờng kính 1 cm, dài 50 cm, rửa sạch, tráng cồn, sấy khô.
- Chất nhồi cột: Silicagel 60 F254 Merck cỡ hạt 0,04 – 0,63mm. Cân khoảng 6 – 8 g hạt, hoạt hóa ở 1100
C/30 phút. Hòa với hệ DMHC chạy cho đến hết bọt khí rồi đƣa lên cột.
- Đƣa mẫu thử lên cột: ột kháng sinh thô hòa tan trong một lƣợng tối thiểu methanol, sau đó trộn với khoảng 1 – 2 g silicagel đã hoạt hóa. Sấy ở 500C cho bay hết methanol thì cho lên cột đã ổn định cột trong 30 phút.
Chạy cột: Cho dung môi chạy qua cột với tốc độ 0,5 ml/phút. Lấy các phân đoạn vào ống nghiệm sạch (đã tráng cồn để khô), mỗi phân đoạn khoảng 3ml. Xác định phân đoạn chính chứa kháng sinh cần tách:
Thử HTKS của các phân đoạn bằng phƣơng pháp khoanh giấy lọc. Các phân đoạn có HTKS đƣợc tiến hành sắc ký lớp mỏng với hệ dung môi tách tốt nhất. Phân đoạn chính là các phân đoạn có những vết có Rf tƣơng đƣơng và có HTKS mạnh.
2.3.13. p áp t u t t ể k á s t k ết
Các phân đoạn chính sau chạy cột đƣợc gộp vào bình cầu, cất quay chân không ở nhiệt độ 50 – 600C đến khô, cạo thu bột KS tinh khiết vào ống nghiệm sạch. Kết tinh KS nhiều lần bằng hỗn hợp DMHC thích hợp. Lọc, sấy, thu đƣợc KS tinh khiết.
2.3.14. p áp xác đị cấu trúc k á s t k ết t u đ ợc
ột KS tinh khiết đem đi đo các thông số: Nhiệt độ nóng chảy, phổ hồng ngoại, phổ tử ngoại, khối phổ để sơ bộ dự đoán cấu trúc kháng sinh thu đƣợc.
3 Ự M, K QUẢ U 3.1. Xác đị t k oa ọc của Streptomyces 183.220
Nuôi cấy Streptomyces trên các môi trƣờng ISP, kết quả giới thiệu trong bảng 3.1.
Bảng 3.1. ác đặc đ ểm của Streptomyces 183.220 và Streptomyces vastus
Đặc điểm Streptomyces 183.220 Streptomyces vastus
Màu KTKS Trắng xám (WGy) Trắng xám (WGy)
Màu KTCC 1 1
Sắc tố melanoid 0 0
Sắc tố hòa tan 0 0
Chuỗi bào tử RF (Thẳng hơi cong) RF
Bề mặt bào tử Sm (Phẳng nhẵn) Sm L-Arabinose + + D-Xylose + +/– Inositol + + D-Manitol + + D-Fructose + + Rhamnose + + Saccarose – + Raffinose + +
Nhận xét: Theo phƣơng pháp phân loại ISP thì Streptomyces 183.220 có giống với
Streptomyces vastus (85,71%). Tuy nhiên cần tiến hành nghiên cứu thêm, sử dụng các cách phân loại có độ chính xác cao hơn để xác định đƣợc chính xác tên của chủng nghiên cứu.
3.2.Xác đị p ổ tác dụ của k á s do Streptomyces 183.220 tổ ợp
Kết quả thử HTKS trên 9 VSV kiểm định của kháng sinh do Streptomyces
183.220 tổng hợp đƣợc trình bày trong bảng 3.2
Bảng 3.2. Kết quả thử HTKS trên 9 VSV kiểm định
Vi khuẩn Gram D(mm) Vi khuẩn Gram D(mm)
S. aureus (+) 14.22 P. mirabilis (-) 19.56
B. pumilus (+) 22.88 P. aeruginosa (-) 0
B. subtilis (+) 19.60 E. coli (-) 15.76
B. cereus (+) 14.52 S. typhi (-) 23.00
S. flexneri (-) 24.44
Nhận xét: Kháng sinh do Streptomyces 183.220 sinh ra là một kháng sinh phổ rộng, có tác dụng trên cả Gr (-) và Gr (+).
3.3. Kết quả ựa c ọ mô tr uô cấ t íc ợp
Mục đích: Lựa chọn môi trƣờng nuôi cấy chủng Streptomyces 183.220 tốt
nhất và cho HTKS cao nhất.
Streptomyces 183.220 đƣợc nuôi cấy trên 7 môi trƣờng trong vòng 6 ngày.
Kết quả cho thấy chủng chỉ phát triển tốt trên MT1 và MT2. Các môi trƣờng khác hầu nhƣ xạ khuẩn không phát triển đƣợc. Sau đó thử HTKS trên 9 VSV kiểm định. Kết quả trình bày ở bảng 3.3.
Bảng 3.3. Kết quả thử HTKS của Streptomyces 183.220 trên MT1 và MT2
MT Vi khuẩn MT1 MT2 D(mm) s D(mm) s S. aureus 14,43 0,85 16,30 1,17 B. pumilus 22,87 0,22 22,80 0,70 B. subtilis 18,83 1,51 19,94 1,07 B. cereus 14,99 0,49 14,93 0,62
P. mirabilis 20,41 0,28 19,47 1,01
P. aeruginosa 0 0 0 0
E. coli 17,89 0,47 19,62 0,54
S. typhi 23,89 1,19 23,01 0,51
S. flexneri 19,41 0,17 22,05 0,69
Nhận xét: Chủng Streptomyces 183.220 cho HTKS cao khi nuôi cấy trên MT2.
Chọn 2 chủng VSV kiểm định là B. subtilis và P. mirabilis làm VSV kiểm định cho các thí nghiệm tiếp theo bởi vì kháng sinh cho vòng vô khuẩn rõ ràng và ổn định. Chọn MT2 là môi trƣờng nuôi cấy và bảo quản chủng Streptomyces 183.220.
3.4. Kết quả quá trì sàng ọc u nhiên
Mục đích: Chọn dạng chủng có hoạt tính KS cao trong quần thể ban đầu. Kết quả: 10 kết quả tốt nhất trong tổng số 32 kết quả thu đƣợc của quá trình
sàng lọc ngẫu nhiên đƣợc giới thiệu ở bảng 3.4.
ả 3.4. Kết quả chính sàng ọc u Streptomyces 183.220 Dạng chủng Hoạt tính kháng sinh P. mirabilis B. subtilis D(mm) s D(mm) s 2 21,03 0,43 21,51 0,61 3 19,62 0,24 20,59 0,78 7 19,1 0,59 20,38 0,89 10 19,4 0,78 19,24 1,24 11 18,05 0,18 21,06 0,63 13 20,34 0,76 21,30 1,23 14 21,61 0,81 20,74 0,35 16 19,89 0,41 20,20 0,41 23 19,53 0,72 20,57 0,30 25 18,04 1,05 21,8 0,32
Nhận xét: Các dạng chủng có HTKS tốt nhất là 2, 14, 25 đƣợc sử dụng cho các
bƣớc đột biến cải tạo giống tiếp theo.
3.5. Kết quả đột b ế UV ầ 1
Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng tăng mạnh tổng hợp KS.
Chọn dạng chủng 14 thu đƣợc sau sàng lọc ngẫu nhiên để đột biến bằng ánh sáng UV trong thời gian 3,5 phút. Tỉ lệ sống sót sau đột biến lần 1 là 0,51%. Thử HTKS trên 35 đĩa thu đƣợc kết quả và 10 kết quả tốt nhất trình bày trong bảng 3.5.
ả 3.5. Kết quả c í t ử KS sau đột b ế 1
iến chủng P. mirabilis % biến đổi hoạt tính
B. subtilis % biến đổi hoạt tính D(mm) s D(mm) s 14.2 22,17 0,41 128,45 22,07 0,76 119,17 14.3 22,14 0,71 126,08 21,15 1,50 114,20 14.6 21,77 1,22 123,98 20,55 1,43 110,96 14.9 22,83 0,40 130,01 22,27 0,58 120,25 14.12 22,25 0,74 126,71 21,24 0,63 114,69 14.15 22,47 0,21 127,96 22,06 0,90 119,11 14.22 23,85 0,83 135,82 21,06 0,92 113,71 14.25 22,15 0,75 126,14 21,65 0,26 116,90 14.26 22,94 1,17 130,63 19,59 2,04 105,78 14.30 21,25 0,65 121,01 23,01 0,56 124,24 Mẫu chứng 17,56 0,81 100 18,52 0,64 100
ận xét: Sau đột biến 1 các biến chủng 14.9, 14.22, 14.30 cho HTKS cao nhất,
đƣợc giữ lại sử dụng cho các nghiên cứu tiếp theo. Trên P. mirabilis cho kết quả
đạt cao nhất ở biến chủng 14.22 (đạt 135,82% so với mẫu chứng), còn trên B. subtilis biến chủng 14.30 cho kết quả cao nhất 124,24%.
3.6. Kết quả đột b ế U ầ 2
Mục đích: Tạo biến chủng có khả năng tăng mạnh tổng hợp KS
Tiến hành lựa chọn biến chủng 14.22 đột biến UV lần 2 trong 3 phút. Tỉ lệ sống sót sau đột biến lần 2 là 0,81%. Đánh giá HTKS của các chủng sau đột biến (33 đĩa). 10 kết quả tốt nhất trình bày trong bảng 3.6.
ả 3.6. Kết quả c í t ử KS sau đột b ế 2
iến chủng P. mirabilis % biến đổi hoạt tính
B. subtilis % biến đổi hoạt tính D(mm) s D(mm) s 14.22.5 22,73 0,88 103,84 23,79 0,52 106,16 14.22.8 25,15 0,31 114,89 24,62 0,53 109,86 14.22.11 23,21 0,89 106,03 26,90 0,24 120,04 14.22.13 22,53 1,01 102,92 22,49 0,38 100,36 14.22.18 23,31 0,71 106,49 23,03 0,30 102,77 14.22.20 22,28 1,02 101,78 23,37 0,28 104,28 14.22.21 23,62 0,19 107,90 24,15 0,45 107,76 14.22.22 24,27 0,78 110,87 23,59 0,50 105,27 14.22.27 22,15 0,23 101,19 23,77 1,31 106,07 14.22.28 26,81 0,21 122,48 24,08 0,56 107,45 Mẫu chứng 21,89 0,88 100 22,41 0,53 100
ận xét: HTKS tăng trên cả hai loại VSV kiểm định, đối với P. mirabilis đạt 122,48% (trên biến chủng 14.22.28), còn B. subtilis cao nhất là 120,04% (trên biến chủng 14.22.11). Các biến chủng 14.22.8, 14.22.11, 14.22.28 đƣợc chọn cho các nghiên cứu tiếp theo.
3.7. Kết quả me c ìm s tổ ợp k á s
Chọn môi trƣờng lên men tốt nhất
Mục đích: Chọn môi trƣờng lên men mà Streptomyces 183.220 phát triển cho HTKS cao nhất.
Lên men Streptomyces 183.220 trên MT1dt và MT2dt. Kết quả đƣợc trình
bày trong bảng 3.7.
ả 3.7. Kết quả c ọ mô tr me chìm
Môi trƣờng P. mirabilis B. subtilis
D(mm) s D(mm) s
MT1dt 14,50 1,34 15,45 0,81
MT2dt 17,38 0,91 19,57 0,69
ận xét: Kết quả khi lên men chủng Streptomyces 183.220 trên MT2dt thì HTKS mạnh hơn so với MT1dt. Chọn MT2dt là môi trƣờng lên men chìm cho các nghiên cứu sau đó.
Lên men chọn dạng – biến chủng cho HTKS cao nhất
Mục đích: Chọn dạng – biến chủng cho HTKS cao nhất khi lên men chìm. Lên men trên 3 loại dạng – biến chủng (dạng chủng thu đƣợc sau sàng lọc ngẫu nhiên, biến chủng thu đƣợc sau Đ 1 và sau Đ 2). Kết quả trong bảng 3.8.
ả 3.8. Kết quả t ử KS t u đ ợc sau k me tr M 2dt Dạng – biến chủng P. mirabilis B. subtilis D(mm) s D(mm) s 2 13,74 0,53 14,02 1,03 14 17,02 0,97 15,89 0,51 25 15,32 1,24 15,70 0,75 14.9 18,44 0,21 19,12 0,42 14.22 20,46 0,64 19,12 0,96
14.30 20,10 1,02 21,58 0,45
14.22.8 20,68 0,31 21,38 0,56
14.22.11 22,12 0,47 22,74 0,19
14.22.28 24,36 1,13 22,86 0,61
ận xét: iến chủng 14.22.28 thu đƣợc sau đột biến 2 có HTKS cao nhất, sử dụng làm chủng khi lên men chìm tổng hợp kháng sinh.
3.8. Ả ở của p và t độ đế độ bề của k á s
Mục đích: Xác định đƣợc độ bền của KS với nhiệt độ và pH để bảo quản, lựa chọn điều kiện tách chiết tối ƣu.
Thử độ bền pH: Kết quả thu đƣợc ở bảng 3.9.
ả 3.9. Kết quả t ử độ bề của dịc k á s
PH
P. mirabilis B. subtilis
1 ngày 5 ngày 1 ngày 5 ngày
D(mm) s D(mm) s D(mm) s D(mm) s 3 19,63 0,7 17,85 0,98 19.09 0,40 16.71 0,57 5 20,65 0,78 18,21 0,44 20.17 0,83 17,25 1,36 7 20,79 0,61 20,33 1,04 20.47 0,24 19,22 0,32 9 18,51 0,27 17,62 0,66 19.61 0,53 18,51 1,01 11 18,19 1,07 16,07 0,74 18.07 0,16 16,73 0,55
ận xét: KS bền nhất ở pH trung tính, không bền ở pH acid hay kiềm. Nên bảo quản KS ở pH 7 để giữ đƣợc hoạt tính và nên chọn pH 7 để thực hiện tách, chiết kháng sinh.
ả 3.10. Kết quả k ảo sát độ bề t của KS Tác động nhiệt P. mirabilis B. subtilis D(mm) s D(mm) s Nhiệt độ thƣờng 19,27 0,78 21,12 0,67 Đun sôi 10 phút 15,26 1,23 15,93 0,79 Đun cách thủy 30 phút 10,82 1,07 11,99 0,66
ận xét: HTKS bị giảm mạnh dƣới tác động của nhiệt độ. Kháng sinh không bền với nhiệt độ cao, cần chú ý trong các bƣớc thí nghiệm tiếp theo để không làm mất HTKS.
3.9. Kết quả c ọ du mô c ết xuất KS
Mục đích: Xác định dung môi và pH tối ƣu để chiết KS.
Tiến hành: Chiết KS bằng 5 loại DM ở các pH khác nhau với tỉ lệ Vdl:Vdm=5:1. Kết quả thu đƣợc trình bày trong bảng 3.11.
ả 3.11. Kết quả t ử c ết KS bằ các du mô ở 5 p k ác au Dung môi pH P. mirabilis B. subtilis DC DMHC DC nƣớc DC DMHC DC nƣớc D (mm) s D (mm) s D (mm) s D (mm) s Ethyl acetat 3 21,44 0,56 10,45 0,74 20,71 0,37 11,26 0,48 5 24,45 0,63 0,00 0,00 23,06 0,86 0,00 0,00 7 24,92 0,60 0,00 0,00 23,14 0,36 0,00 0,00 9 22,67 0,27 8,72 1,12 22,14 0,58 10,49 1,37 11 19,93 1,39 12,02 0,85 20,42 1,18 13,94 0,85 n-Butanol 3 20,51 0,34 12,34 1,49 20,5 0,99 12,68 1,16 5 21,83 0,91 12,02 0,54 21,89 0,63 12,18 0,76
n-Butanol 7 22,11 0,87 11,27 0,43 22,10 0,59 10,87 0,24 9 20,28 0,22 12,53 1,07 21,26 1,24 11,55 0,55 11 19,61 1,34 15,43 0,65 20,49 0,28 14,52 0,98 Butyl acetat 3 17,82 1,23 19,04 1,36 18,92 0,45 18,74 0,72 5 18,46 0,98 18,23 1,05 19,90 1,02 18,38 0,93 7 20,20 0,67 15,70 0,99 21,72 0,88 16,50 0,42 9 19,42 0,42 17,24 0,64 20,81 1,26 15,53 1,75 11 16,88 0,85 18,64 1,75 17,12 0,46 18,02 1,16 Cloroform 3 18,14 0,50 20,51 0,78 19,71 1,42 20,41 0,91 5 21,48 0,94 19,01 0,54 21,42 0,54 17,65 1,12 7 20,46 1,05 19,94 0,96 20,30 0,40 20,96 0,56 9 19,38 1,52 21,61 1,13 19,34 0,88 21,54 0,54 11 17,60 0,48 22,08 0,92 19,92 0,72 19,78 1,65 Dicloromethan 3 11,59 0,18 18,78 1,42 13,65 0,21 17,60 1,08 5 10,63 1,12 19,84 0,81 14,02 0,97 16,99 0,61 7 12,98 0,86 20,96 0,62 15,87 0,46 17,35 1,26 9 9,56 1,76 21,54 0,97 10,93 0,89 20,51 0,43 11 10,47 1,92 19,92 0,45 10,52 1,28 21,92 0,66
ận xét: DC ethyl acetat ở pH 5 và 7 cho HTKS cao và DC nƣớc không còn hoạt tính. Tại pH 7 cho kết quả tốt hơn. Vậy dùng ethyl acetat tại pH 7 để chiết kháng sinh từ dịch lọc.
3.10. Kết quả tác KS tro bằ sắc ký p mỏ
Mục đích: Chọn đƣợc hệ dung môi có khả năng tách tốt nhất các thành phần trong dịch chiết KS để tiến hành chạy cột thu KS tinh khiết.
Lựa chọn 4 hệ dung môi tiến hành sắc ký lớp mỏng: