Bước 1: Tạo tủa artemisinin thô
Dịch chiết được cất thu hồi dung môi và cô đến cắn. Hòa tan cắn bằng n- hexan (120ml n-hexan tương đương với 18g – 19,50g cắn chiết), cất thu hồi dung môi cho đến khi còn khoảng 40 – 50ml, đổ vào cốc có mỏ thể tích 100ml, để kết tinh trong 48 giờ.
Bước 2: Loại sáp, tẩy màu bằng than hoạt
Gạn lấy phần tủa (artemisinin và sáp), bỏ nước cái, đun cách thủy cho sáp chảy lỏng ra, lọc lấy tinh thể artemisinin, rửa với xăng công nghiệp được đun nóng thu được sản phẩm artemisinin thô.
Kiểm tra việc loại sáp: hòa tan artemisinin thô trong aceton, nếu dung dịch trong là đã loại hết sáp.
Artemisinin thô được hòa tan trong 5 phần ethanol 96% trong cốc có mỏ, thêm than hoạt với lượng bằng 2 – 5 % artemisinin thô tính theo khối lượng. Đun cách thủy trong vòng 10 phút có khuấy trộn liên tục. Lọc nóng qua phễu Buchner để loại than hoạt, rửa bã than bằng ethanol nóng và thu lấy dịch lọc.
Bước 3: Kết tinh sản phẩm
Gộp dịch lọc và dịch rửa, để kết tinh ở nhiệt độ phòng trong 24 giờ, lọc lấy tinh thể trên phễu Buchner, rửa tinh thể 2 lần bằng ethanol. Tinh thể được sấy trong tủ sấy ở nhiệt độ 60°C.
CHƯƠNG 3. THỰC NGHIỆM VÀ KẾT QUẢ 3.1 Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng
Xác định hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng nhằm mục đích xác định được hiệu suất chiết xuất. Bằng phương pháp sắc ký lớp mỏng kết hợp với phương pháp đo độ hấp thụ tử ngoại tiến hành định lượng theo DĐVN IV.
Hình 3.1 Bản mỏng sau khi
cạo vết artemisinin Trong đó: 1- Mẫu trắng 2 - Mẫu chuẩn
3 - Mẫu thử
Kết quả được thể hiện ở bảng 3.1:
Bảng 3.1 Kết quả đo quang của dung dịch artemisinin
TT Dung dịch chuẩn Dung dịch thử
Lần 1 0,316 0,684
Lần 2 0,308 0,680
Lượng artemisinin là :
Nhận xét : Hàm lượng artemisinin trong lá thanh cao hoa vàng đạt 0,480%.
3.2 Đánh giá ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết xuất
3.2.1 Lựa chọn đồng dung môi
Cân 100g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 1000ml, thêm 50ml đồng dung môi trộn sao cho thấm đều dược liệu, đậy kín (≥ 0,5giờ). Tiến hành chiết xuất dược liệu bằng sCO2 kết hợp với các đồng dung môi trong 2 giờ, tiến hành với 4 mẫu :
Mẫu 1 : Không chứa đồng dung môi, chỉ chiết bằng sCO2
Mẫu 2, 3, 4 : Tiến hành chiết lần lượt với đồng dung môi : EtOH 96%, n–hexan, aceton.
Các thông số của quá trình chiết xuất như sau:
Áp suất chiết xuất (bar): 200 Tốc độ bơm đồng dung môi (ml/phút): 1 Nhiệt độ chiết xuất (oC): 5 Thời gian chiết (giờ) : 2
Tốc độ dòng CO2 (g/phút): 50 Tổng thể tích đồng dung môi(ml): 150 Tiến hành xử lí dịch chiết và định lượng artemisinin theo mục 2.2.1b.
Hình 3.2 Dịch chiết artemisinin thu được khi sử dụng
đồng dung môi n-hexan (200bar, 50o
Kết quả thu được như bảng 3.2
Bảng 3.2 Hiệu suất chiết xuất artemisinin trong 100g dược liệu với các đồng dung
môi khác nhau Mẫu Đồng dung môi Khối lượng artemisinin thu được (mg)
Hiệu suất chiết xuất artemisinin(%) Khối lượng cắn thu được (g) HL (%) artemisinin trong cắn 1 - 192,2 40,0 2,7708 6,9 2 EtOH 96% 241,1 50,2 5,0553 4,8 3 n-hexan 389,4 81,1 3,1777 12,3 4 aceton 260,7 54,3 3,4084 7,6
Hình 3.3 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng sCO2 kết hợp
với các đồng dung môi khác nhau
Nhận xét:
Khi không sử dụng đồng dung môi, chỉ chiết xuất dược liệu bằng sCO2 thì hiệu suất chiết xuất đạt được thấp nhất 40,0%. Sử dụng thêm đồng dung môi EtOH
96%, aceton hiệu suất chiết xuất cao hơn: 50,2% và 54,3%. Hiệu suất chiết xuất cao nhất (81,1%) khi sử dụng đồng dung môi n-hexan. Do vậy các thông số khảo sát về áp suất chiết, nhiệt độ chiết, thời gian chiết sẽ được tiến hành với đồng dung môi n-hexan.
3.2.2 Áp suất chiết xuất
Cân 100g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 1000ml, thêm 50ml đồng dung môi n-hexan, trộn sao cho đồng dung môi thấm đều dược liệu, đậy kín (≥ 0,5giờ). Chiết xuất dược liệu bằng sCO2 kết hợp với đồng dung môi n-hexan ở các áp suất chiết khác nhau trong 2giờ, tiến hành chiết 5 mẫu ở :
100 ± 10bar , 150 ± 10bar, 200 ± 10bar, 250 ± 10bar, 300 ± 10bar. Các thông số của quá trình chiết xuất như sau:
Đồng dung môi: Hexan Tốc độ bơm đồng dung môi (ml/phút): 1 Nhiệt độ chiết xuất (oC): 50 Thời gian chiết (giờ): 2
Tốc độ dòng CO2 (g/phút): 50 Tổng thể tích đồng dung môi (ml): 150 Tiến hành xử lí dịch chiết và định lượng artemisinin theo mục 2.2.1b.
Hình 3.4 Dịch chấm sắc kí của dược liệu được chiết xuất bằng sCO2 kết hợp
Kết quả thu được như sau:
Mẫu Áp suất Khối lượng (mg)
artemisinin chiết được
Hiệu suất chiết xuất artemisinin(%) 1 100±10bar 299,6 62,4 2 150±10bar 321,5 67,0 3 200±10bar 385,6 81,1 4 250±10bar 385,6 80,3 5 300±10bar 389,9 81,2
Trong đó: m – Tổng lượng artemisinin chiết được trong 100g dược liệu (mg).
Hình 3.5 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng sCO2 kết hợp
với n-hexan dưới các áp suất khác nhau
Nhận xét
Khi áp suất tăng hiệu suất chiết xuất cũng tăng lên. Tuy nhiên áp suất chiết trên 200±10bar thì hiệu suất chiết xuất tăng không đáng kể (thậm chí hơi giảm). Do áp suất tăng tỉ trọng dung môi sCO2 tăng lên, khả năng chuyển khối cũng tăng lên
do vậy kéo theo nhiều tạp vào sCO2 do vậy, lựa chọn áp suất 200±10bar cho các khảo sát tiếp theo.
3.2.3 Nhiệt độ chiết xuất
Tiến hành
Cân 100g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 1000ml, thêm 50ml đồng dung môi n-hexan, trộn sao cho đồng dung môi thấm đều dược liệu, đậy kín (≥ 0,5giờ). Tiến hành chiết xuất dược liệu bằng sCO2 kết hợp với đồng dung môi dưới áp suất 200bar tại các nhiệt độ khác nhau trong 2giờ, thực hiện 3 mẫu (1, 2, 3) lần lượt tại: 40o
C, 50oC, 60oC.
Tiến hành với các thông số của quá trình chiết như sau:
Đồng dung môi: Hexan Tốc độ bơm đồng dung môi (ml/phút): 1 Áp suất chiết xuất(bar): 200 Thời gian chiết (giờ) : 2
Tốc độ dòng CO2 (g/phút): 50 Tổng thể tích đồng dung môi (ml): 150 Tiến hành xử lí dịch chiết và định lượng artemisinin theo mục 2.2.1b. Kết quả được thể hiện bảng sau:
Mẫu Nhiệt độ (oC) Khối lượng (mg) artemisinin chiết được
Hiệu suất chiết xuất artemisinin(%)
1 40 333,5 69,5
2 50 389,5 81,1
Hình 3.6 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng sCO2 kết hợp với n-hexan ở các nhiệt độ khác nhau
Nhận xét:
Thực hiện chiết artemisinin bằng sCO2 kết hợp n-hexan tại các nhiệt độ khác nhau 40oC, 50oC, 60oC thì hiệu suất chiết cao nhất ở 50oC (81,1%).
3.2.4 Thời gian chiết xuất
Cân 100g dược liệu đã xử lí cho vào cốc có mỏ 1000ml, thêm 50ml đồng dung môi n-hexan, trộn sao cho đồng dung môi thấm đều dược liệu, đậy kín (≥ 0,5 giờ). Tiến hành chiết xuất dược liệu bằng sCO2 kết hợp với đồng dung môi dưới áp suất 200±10bar, thực hiện 5 mẫu (1÷5) với thời gian chiết lần lượt là: 1giờ, 2giờ, 3giờ, 4giờ, 6giờ.
Tiến hành với các thông số quá trình chiết như sau :
Đồng dung môi: Hexan Tốc độ bơm đồng dung môi (ml/phút): 1 Áp suất chiết xuất(bar): 200bar Nhiệt độ chiết(oC): 50oC
Tiến hành xử lí dịch chiết và định lượng artemisinin theo mục 2.2.1b.
Hình 3.7 Đồ thị biểu diễn hiệu suất chiết xuất (%) artemisinin bằng sCO2 kết hợp
với n-hexan theo thời gian
Nhận xét
Thời gian chiết càng lâu hiệu suất chiết xuất càng cao, hiệu suất chiết xuất artemisinin mẫu 2 giờ (81,1%) cao hơn mẫu 1 giờ, mẫu 3 giờ, 4 giờ, 6 giờ cao hơn mẫu 2 giờ nhưng chênh lệch hiệu suất là không nhiều (82,1%; 82,1%; 82,1%).
3.3 Tinh chế dịch chiết
Để kết tinh, gạn Nước cái Xăng công nghiệp Loại sáp Ethanol 96% Than hoạt Dịch chiết Dịch cô đặc 20 – 30ml Artemisinin + sáp Artemisinin thô Dung môi thu hồi Cất thu hồi dung môi
Tẩy màu, lọc nóng Bã than
Để kết tinh, lọc Nước cái
Hình 3.8 Các giai đoạn tinh chế dịch chiết artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng
bằng dung môi siêu tới hạn
Hình 3.9 Sản phẩm thô (trên) và sau
tinh chế (dưới) của artemisinin Artemisinin/ethanol
Artemisinin
Sản phẩm Artemisinin
Bảng 3.3 Khối lượng artemisinin thu được, hàm lượng sản phẩm và hiệu suất của
quá trình tinh chế dịch chiết
Thí nghiệm 1 2 3
Khối lượng dược liệu (g) 100
Khối lượng cắn chiết (g) 3,18 3,20 3.22
Khối lượng sản phẩm artemisinin (g) 0,260 0,258 0,59 Hàm lượng artemisinin trong sản phẩm (%) 99,31 99,51 99,42
Trung bình: 99,42 ± 0,09
Nhiệt độ nóng chảy (°C) 156 – 157°C
Hiệu suất tinh chế (%) 70,1 69,9 71,1
Hiệu suất tinh chế trung bình (%): 70,5 ± 0,5 Đánh giá chất lượng của sản phẩm artemisinin:
Cảm quan: Sản phẩm artemisinin có dạng bột kết tinh, màu trắng. Hình ảnh của sản phẩm được biểu thị bằng hình 3.9.
Nhiệt độ nóng chảy: 156 – 157°C.
Hàm lượng artemisinin trong sản phẩm: 99,42 ± 0,09
Nhận xét: Sản phẩm artemisinin thu được đạt yêu cầu về cảm quan, nhiệt độ nóng chảy và hàm lượng artemisinin (≥98,5%) theo tiêu chuẩn của DĐVN IV.
CHƯƠNG 4. BÀN LUẬN
4.1 Về khảo sát ảnh hưởng các thông số tới quá trình chiết xuất
Hầu hết các công trình nghiên cứu chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng đều là sử dụng phương pháp truyền thống n-hexan, hoặc các dung môi hữu cơ với thể tích lớn nhưng hiệu suất chiết xuất thu được lại không cao. Phương pháp chiết suất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng có các ưu điểm sau đây:
Dung môi sCO2 rẻ tiền, không độc hại, thân thiện với môi trường. Lượng đồng dung môi sử dụng ít.
Hiệu suất chiết xuất tương đối cao.
Mục đích thí nghiệm thay đổi đồng dung môi là chọn ra được dung môi vừa có khả năng hòa tan artemisinin, có khả năng hòa tan với sCO2 tốt nhất trong số đồng dung môi sử dụng. Đồng dung môi có khả năng hòa tan tốt nhất với sCO2 cũng như artemisinin được thể hiện thông qua hiệu suất chiết xuất cao hơn so với khi chỉ sử dụng sCO2, cũng như khi kết hợp với đồng dung môi khác. Kết quả cho thấy sử dụng đồng dung môi n-hexan cho hiệu suất chiết xuất cao hơn khi chỉ sử dụng sCO2, cũng như khi sử dụng đồng dung môi khác: EtOH 96%, aceton.
sCO2 là một dung môi không phân cực, do vậy có khả năng hòa tan các chất không phân cực hoặc kém phân cực, artemisinin là chất kém phân cực nhưng lại có cấu trúc phân tử cồng kềnh do vậy khả năng hòa tan trong sCO2 thấp, kéo theo khi chỉ sử dụng sCO2 làm dung môi chiết xuất thì hiệu suất chiết xuất thấp.
EtOH 96% là một dung môi phân cực hơn aceton, khả năng hòa tan trong sCO2 thấp hơn so với aceton, n-hexan là hợp chất không phân cực và tính chọn lọc của n-hexan với artemisinin cao do vậy hiệu suất chiết xuất khi sử dụng đồng dung môi n-hexan cao hơn khi sử dụng đồng dung môi aceton và EtOH 96%.
Do vậy các khảo sát về ảnh hưởng các thông số tiếp theo sẽ sử dụng đồng dung môi n-hexan.
Tương tự như vậy các khảo sát sự ảnh hưởng của các thông số: áp suất chiết xuất, nhiệt độ chiết xuất, thời gian chiết xuất đến quá trình chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn nhằm đưa ra được thông số mà tại đó tổng lượng artemisinin chiết được là lớn nhất, dược liệu được chiết kiệt nhất, thời gian chiết xuất ngắn nhất.
4.2 Về quy trình tinh chế dịch chiết.
Quá trình tinh chế đã rút ngắn được giai đoạn cô dịch chiết đến cắn, sau đó hòa tan trong n-hexan do đồng dung môi sử dụng là n-hexan.
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ
Kết luận
1. Đã chiết xuất được artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung
môi siêu tới hạn.
2. Đã khảo sát được ảnh hưởng của một số thông số đến quá trình chiết
xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn.
Cụ thể như sau:
- Đã khảo sát lựa chọn được đồng dung môi n-hexan phù hợp cho quy trình chiết xuất artemisinin bằng dung môi siêu tới hạn: đồng dung n-hexan cho hiệu suất chiết xuất cao nhất (81,1%), tính chọn lọc cao.
- Đã khảo sát nhiệt độ, áp suất, cũng như thời gian chiết xuất bằng sCO2 khi dùng thêm đồng dung môi n–hexan cuối cùng chúng tôi đưa ra được điều kiện chiết xuất ứng với các thống số này: 50oC, 200bar, 2 giờ cho hiệu suất chiết xuất lớn nhất (81,1%) trong khoảng thời gian ngắn và nhiệt độ không cao.
- Tinh chế được artemisinin từ dịch chiết với hiệu suất 70,5±0,5%.
Kiến nghị
Tiếp tục triển khảo sát quy trình chiết xuất artemisinin từ lá thanh cao hoa vàng bằng dung môi siêu tới hạn với thay đổi các thông số về tốc độ dòng sCO2, tốc độ bơm đồng dung môi để đưa ra quy trình chiết tối ưu.
TÀI LIỆU THAM KHẢO
Tài liệu tiếng Việt
1. Bộ môn Công Nghiệp Dược (2010), “Các phương pháp chiết xuất hiện đại”,
Đại học Dược Hà Nội, tr. 12 – 22.
2. Bộ môn Công nghiệp Dược (2009), “Thực tập kỹ thuật sản xuất dược phẩm”, Đại học Dược Hà Nội, tr. 55 – 59.
3. Bộ môn Công nghiệp Dược (2007), “Kỹ thuật sản xuất dược phẩm ”, Đại học Dược Hà Nội, 1, tr.145 – 241.
4. Bộ Y Tế (2009), “Dược điển Việt Nam IV ”, tr. 820 – 825. 5. Bộ Y Tế (2007), “Dược lý học ”, tr. 237 - 238.
6. Bộ Y Tế (2007), “Hóa dược ”, 2, tr. 213 – 214.
7. Võ Văn Chi (1997), “Từ điển cây thuốc Việt Nam”, tr.1437 – 1462..
8. Nguyễn Thị Lập, Lưu Hoàng Ngọc, Nguyễn Thanh Bình (2010), “Nghiên cứu chiết xuất phospholipid từ lòng đỏ trứng bằng phương pháp sử dụng cacbon dioxid ở trạng thái siêu tới hạn làm nguyên liệu chế tạo liposom”,
Tạp chí Dược Học, (3), tr. 35-39.
9. Đỗ Tất Lợi (2004), “ Những cây thuốc và vị thuốc Việt Nam”, tr.640 – 642. 10. Lưu Hoàng Ngọc, Lê Đăng Quang, Đinh Xuân Bá, Vũ Hồng Sơn, Nguyễn
Thị Minh Tú (2008), “Nghiên cứu concrete chiết bằng cacbon dioxid ở trạng thái siêu tới hạn và tinh dầu cất cuốn hơi từ loại cây dó bầu Aquilaria crassna Piere ex lecomte không kích cảm nhân tạo ”, Tạp chí Phân tích hoá, lý và sinh học, (4), tr. 21-25.
11. Viện Dược liệu (2004), “Cây thuốc và động vật làm thuốc ở Việt Nam”, 2, tr.820 – 825.
12. Viện Khoa học và công nghệ Việt Nam (2007), “Khảo sát thành phần hoá học của tinh dầu tiêu (Piper nigrum L.) chiết xuất bằng phương pháp xử dụng cacbon dioxid ở trạng thái siêu tới hạn”, tr. 272-276.
Tài liệu tiếng Anh
13. Malcolm Cutler FSC Development Services Ltd, Alexei Lapkin and Pawel K. Plucinski Department of Chemical Engineering University of Bath (2006), “Comparative Assessment of Technologies for Extraction of Artemisinin”, pp. 3 – 10 .
14. Nakase I. et al (2009), “Transferrin receptor-dependent cytotoxicity of artemisinin-transferrin conjugates on prostate cancer cells and induction of apoptosis”, Cancer Letter, (274), pp. 290 – 298.
15. Selva Pereda, Susana B. Bottini, Esteban A. Brignole (2005), “Fundamentals of Supercritical Fluid Technology”, pp.6.