2.3.2.1. Định lượng FDP trong hệ phân tán rắn và hỗn hợp vật lý
* Định lượng FDP trong hệ phân tán rắn bằng phương pháp đo độ hấp thụ UV.
+ Dung dịch Natri laurylsulfat (NaLS) 1% trong đệm phosphat pH 6,5: hòa tan 6,42 g natri dihydrophosphat dihydrat và 7,01 g dinatri hydrophosphat decahydrat và 10,0 g NaLS trong 900ml, điều chỉnh pH đến 6,5, bổ sung thể tích nước cất vừa đủ 1000 ml.
+ Dung dịch chuẩn gốc CG: cân chính xác khoảng 125,0 mg FDP vào bình định mức 50 ml, hòa tan hoàn toàn và bổ sung thể tích vừa đủ đến vạch bằng methanol. Dung dịch chuẩn thêm CT: hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn gốc vào bình định mức 25 ml, bổ sung thể tích vừa đủ bằng dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5.
+ Mẫu chuẩn: Hút chính xác 1,0 ml dung dịch chuẩn thêm CT vào bình định mức 10 ml, bổ sung thể tích bằng dung dịch chuẩn 10,0 µg/ml pha từ dung dịch chuẩn gốc. + Mẫu thử: cân chính xác một lượng HPTR tương đương 5,0 mg FDP cho vào bình định mức 25 ml, hòa tan hòa toàn và bổ sung thể tích đến vạch bằng methanol. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 100 ml, bổ sung thể tích đến vạch bằng dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5. Hút chính xác 1 ml dung dịch chuẩn thêm CT vào bình định mức 10 ml bổ sung vừa đủ thể tích bằng dung dịch vừa pha. Ly tâm 5000 v/p/10p. Thu lấy dịch trong, đo độ hấp thụ ở bước
sóng hấp thụ cực đại (363,2 nm), mẫu trắng là dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5.
+ Xác định hàm lượng của FDP theo công thức: % FDP =
(Dt ×CcDc ×10−100)×500
9×m ×100 (%)
Cc: nồng độ dung dịch chuẩn (19 µg/ml)
Dt, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn m: khối lượng mẫu thử (μg)
* Phương pháp sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC).
+ Pha động: Acetonitril: H2O = 80: 20 + Detector: UV 234 nm.
+ Cột: C18 Phenomenex (4,6 mm × 25 cm; 5 µm). + Tốc độ dòng: 1ml/phút.
+ Thể tích tiêm: 20 µl.
+ Dung dịch chuẩn: pha dung dịch chuẩn gốc 2,0 mg/ml FDP chuẩn trong methanol. Pha dãy các dung dịch thứ cấp có nồng độ lần lượt là: 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 8,0; 12,0; 16,0; 20,0 µg/ml với dung môi pha loãng là pha động.
+ Dung dịch thử: cân chính xác một lượng mẫu thử (HPTR, HHVL) tương đương với 5,0 mg FDP vào bình định mức 50 ml, hoà tan trong khoảng 30 ml pha động, siêu âm 5 phút, cho tan hoàn toàn, bổ sung thể tích vừa đủ bằng pha động. Hút chính xác 5,0 ml dung dịch trên vào bình định mức 50 ml, bổ sung đến vạch bằng pha động.
+ Tính toán kết quả: % FDP = C×St×500
Sc × m x 100 (%)
Cc : nồng độ dung dịch chuẩn (10,0 μg/ml) (μg/ml)
St, Sc: diện tích pic dung dịch thử và dung dịch chuẩn 10,0 μg/ml (mAU) m: khối lượng mẫu thử (μg)
2.3.2.2. Phương pháp đánh giá độ tan của felodipin nguyên liệu, trong hỗn hợp vật lý và hệ phân tán rắn trong dung dịch Poloxamer 1%
Pha dung dịch PLX 1% trong nước, cân một lượng HPTR, HHVL và FDP nguyên liệu tương đương với khoảng 30 mg FDP vào bình nón có nút mài. Thêm vào bình chính xác 10,0 ml dung dịch PLX 1%, đậy kín nút, lắc đều ở môi trường nhiệt độ 37oC trong 24h. Sau 24h, lấy các dung dịch đem ly tâm 5000 v/p/10p, thu lấy dịch trong, pha loãng bằng dung dịch PLX 1% đến nồng độ khoảng 20,0 µg/ml. Ly tâm dung dịch thu được 5000 v/p/10p, thu lấy dịch trong đo độ hấp thụ ở bước sóng hấp thụ cực đại (361,4 nm).
+ Tính toán kết quả: Độ tan = Dt ×C ×K
Dc (μg/ml)
C: nồng độ dung dịch chuẩn (µg/ml)
Dt, Dc: độ hấp thụ quang của dung dịch thử và dung dịch chuẩn. K: hệ số pha loãng.
2.3.2.3. Phương pháp đánh giá độ hòa tan felodipin từ hệ phân tán rắn, hỗn hợp vật lý.
- Điều kiện
+ Thiết bị giỏ tĩnh cánh khuấy theo USP 32. Mẫu thử (HPTR) tương đương 5,0mg FDP chứa trong một túi lọc nhỏ được hàn kín và đặt trong giỏ kim loại nhỏ và được nhúng chìm trong dung dịch thử độ hòa tan.
+ Dung dịch môi trường: 500ml dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5. + Nhiệt độ 37 ± 0,5oC.
+ Tốc độ khuấy 50 vòng /phút.
+ Thời điểm lấy mẫu: 0,5h, 1h, 2h, 3h, 4h, 5h.
- Dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5, dung dịch chuẩn gốc CG, dung dịch chuẩn thêm CT, dung dịch chuẩn 10,0 µg/ml: chuẩn bị như phần định lượng. - Dung dịch thử: tại các thời điểm quy định hút 12,0ml dịch hòa tan, bổ sung 12,0 ml môi trường.
- Tiến hành:
+ Mẫu thử: ly tâm 5000 v//p/10p dịch hòa tan. Hút 1,0 ml dung dịch chuẩn thêm vào bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đủ thể tích bằng dịch hòa tan tương ứng đã ly tâm.
+ Mẫu chuẩn: hút 1,0 ml dung dịch chuẩn thêm vào bình định mức 10 ml, bổ sung vừa đủ thể tích bằng dung dịch chuẩn 10 µg/ml.
+ Đo độ hấp thụ của mẫu thử và mẫu chuẩn ở bước sóng hấp thụ cực đại (363,2 nm).
- Tính toán kết quả:
+ Nồng độ FDP chưa hiệu chỉnh ở lần hút thứ n:
Cno = (Dt ×CcDc × 10 − 100)/9
Cno: nồng độ FDP chưa hiệu chỉnh của lần hút thứ n (µg/ml) Cc: nồng độ FDP trong mẫu chuẩn (19 μg/ml)
Dt, Dc: độ hấp thụ quang của mẫu thử và mẫu chuẩn Nồng độ FDP sau khi hiệu chỉnh ở lần hút thứ n:
Cn = Cno + 𝑉0 𝑉 Cn-1
Cn: Nồng độ FDP sau khi hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (μg/ml). Cno: nồng độ FDP chưa hiệu chỉnh lần hút thứ n (μg/ml). V0: thể tích của dịch hòa tan đã hút (V0= 12 ml).
V: thể tích môi trường thử hòa tan (V= 500 ml).
Phần trăm FDP hòa tan tại thời điểm t được tính theo công thức:
% FDP = Cn x 500
m x100 (%)
Cn: nồng độ FDP đã hiệu chỉnh ở lần hút thứ n (µg/ml) m: khối lượng FDP trong mẫu (µg).
Mỗi mẫu thử 3 lần lấy kết quả trung bình. Kết quả được báo cáo là kết quả trung bình.
Độ lệch chuẩn giữa các mẫu: SD = √∑ (𝑋− 𝑋𝑖)2𝑛1
𝑛−1
X: phần trăm giải phóng trung bình của các mẫu tại một thời điểm (%)
X = ∑ 𝑋𝑖𝑛1 𝑛 (%)
Xi: phần trăm giải phóng của mỗi mẫu tại một thời điểm (%). n: cỡ mẫu (n=3).
2.3.2.4. Phương pháp nhiễu xạ tia X đánh giá mức độ kết tinh trong hệ phân tán rắn
Mẫu phân tích được nghiền mịn, nhiễu xạ tia X được ghi với góc quét 5-50o (2θ) ở tốc độ quét 0,030o/phút và nhiệt độ 25oC.
2.3.2.5. Phương pháp đánh giá độ ổn định
- Bảo quản mẫu: HPTR sau khi bào chế được nghiền mịn và bảo quản trong nhiều túi nhôm nhỏ được hàn kín. Mẫu trong túi nhôm đủ để đánh giá các chỉ tiêu nêu trên và chỉ được dùng trong một lần. Các túi nhôm được bọc kín bằng túi nilon sau đó đem bảo quản ở những điều kiện quy định.
- Bảo quản mẫu ở 2 điều kiện sau
+ Điều kiện lão hóa 40±2oC, độ ẩm 75%.
+ Điều kiện thực (bảo quản trong phòng thí nghiệm).
Kiểm tra mẫu sau thời gian bảo quản về các chỉ tiêu về hình thức (theo cảm quan), định tính, định lượng, độ tan, độ hòa tan và trạng thái vật lý (qua phổ nhiễu xạ tia X) so sánh với mẫu ban đầu.
2.3.3. Các phương pháp khác.
2.3.3.1. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của FDP trong dung dịch PLX 1%.
Pha dung dịch PLX 1% với dung môi là nước.
Dung dịch chuẩn gốc có nồng độ FDP 2500,0 μg/ml trong methanol. Từ dung dịch chuẩn gốc pha loãng thành dãy các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ lần lượt là: 5,0; 7,5; 10,0; 12,5; 15; 17,5; 20,0; 22,5; 25,0 μg/ml. Ly tâm dung dịch PLX 1% ở 5000 v/p/10p làm mẫu trắng. Ly tâm các dung dịch chuẩn thứ cấp ở 5000 v/p/10p.
Quét phổ hấp thụ của FDP trong dung dịch PLX 1% với mẫu trắng là dung dịch PLX 1% trong khoảng 200-500 nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại. Đo độ
hấp thụ của các dung dịch chuẩn ở bước sóng hấp thụ cực đại. Xây dựng mối tương quan giữa độ hấp thụ ở bước sóng hấp thụ cực đại với nồng độ FDP trong dung dịch.
2.3.3.2. Phương pháp xây dựng đường chuẩn của felodipin trong dung dịch 1% natri laurylsulfat 1% trong đệm phosphat pH 6,5
Chuẩn bị các dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5, dung dịch chuẩn gốc, chuẩn thêm như phần định lượng. Từ dung dịch chuẩn gốc, pha các dung dịch chuẩn thứ cấp có nồng độ 0,5; 1,0; 2,0; 4,0; 6,0; 8,0; 10,0; 12,0; 16,0 μg/ml. Mẫu trắng là dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5 ly tâm 5000 v/p/10p. Ly tâm các dung dịch chuẩn 5000 v/p/10p. Hút 1,0 ml chuẩn thêm vào bình định mức 10ml, bổ sung thể tích đến vạch bằng các dung dịch chuẩn thứ cấp đã ly tâm làm mẫu chuẩn.
Quét phổ hấp thụ của FDP trong dung dịch NaLS 1% trong đệm phosphat pH 6,5 trong khoảng 200-500nm để xác định bước sóng hấp thụ cực đại. Đo độ hấp thụ của các dung dịch chuẩn ở bước sóng hấp thụ cực đại. Xây dựng mối tương quan giữa độ hấp thụ của FDP ở bước sóng hấp thụ cực đại với nồng độ FDP trong dung dịch.
CHƯƠNG III : THỰC NGHIỆM, KẾT QUẢ VÀ BÀN LUẬN