3.2.2.1. Nguyên tắc
Thử nghiệm hoạt tính kháng các dòng tế bào ung thư được tiến hành theo phưong pháp SRB tại Khoa Dược, Đại học Choson, Kwangju, Hàn Quốc.
3.2.2.2 Dòng tế bào thử nghiệm
Ba chất I, II, IV đều được thử độc tính tế bào trên 7 dòng tế bào lấy từ Ngân hàng tế bào ung thư người của Viện nghiên cứu sinh học và công nghệ
sinh học Hàn Quốc (KRIBB):
K562: tế bào ung thư bạch cầu
NCI-H23: tế bào ung thư phổi ở người H CT-15; tế bào ung thư một kết
ACHN: tế bào ung thư biểu mô thận PC-3: tế bào ung thư tuyến tiền liệt NƯGC-3: tế bào ung thư dạ dày M DA-M B-231: tế bào ung thư vú
Các tế bào này được nuôi cấy trong môi trường DMEM (Dulbecco modified Eagle) bổ sung L-glutamin (0,2 mM/ml), penicillin/ streptomycin (50 Ul/ml), amphotericin (5 Ul/ml), heparin (5 Ul/ml), 200 I^g/ml chất kích thích tăng trưởng tế bào (EGCS, Bedford, Mỹ), 10% huyết thanh bò chửa (FBS) và được bảo quản trong điều kiện tiêu chuẩn.
3.2.2.3. Tiến hành
Độc tính tế bào của các chất được thử bằng phương pháp SRB theo các bước sau:
31
Bước I (chuẩn bị): Các tế bào thử nghiệm đã tìypsin hóa ở pha log được phân tán thành một hỗn dịch đơn bào trong môi trường DMEM được bổ sung 5% FBS và được điều chỉnh đến nồng độ 5.10"^ tế bào/ml. Lấy 180 |Lil hỗn dịch này phân vào các giếng của phiến vi lượng 96 giếng. Các phiến vi lượng này được ủ ở 37°C/5% CO2 trong không khí để tế bào phát ữiển. Sau 24 giờ, lấy 2 0
|Lil hỗn dịch DMEM có bổ sung 5% FBS từ các phiến vi lượng đã được ủ, hòa tan trong DMSO tới các nồng độ khác nhau và tiếp tục ủ thêm 48 giờ. Tất cả các mẫu đều được chuẩn bị cho tới nồng độ cuối cùng trong DMSO không quá 0,1%.
Bước 2 (tiến hành thừ): Các tế bào được cố định thành một lớp mỏng trên bề mặt môi trưòng nuôi cấy ở từng giếng bằng 50 |Lil acid tricloroacetic lạnh, và được ủ ở 4^C trong 1 giờ. Sau đó, tiến hành rửa 5 lần bằng nước máy, để khô ở nhiệt độ không khí rồi nhuộm màu bằng sulforhodamin B 0,4% (kl/tt) trong acid acetic 1% trong khoảng 30 phút. Rửa 4 lần bằng acid acetic 1% để loại bỏ thuốc nhuộm không kết dính. Các phiến vi lưọng này được để khô ở nhiệt độ phòng và phần thuốc nhuộm còn dính lại sẽ được hòa tan bởi 100 |Lil dung dịch Tris-base
10 mM không đệm (pH 10,5).
3.2.2.4. Đọc kết quả
Độ hấp thụ được đọc trên máy Elisa ở 540 nm. Giá trị IC50 là nồng độ của mẫu thử mà ở đó độ hấp thụ giảm đi 50% so với nhóm chứng (trắng âm tính) và giá ừị này được tính dựa trên phần mềm Probits. Kết quả cuối cùng là giá trị trung bình của 3 phép đo độc lập với các giá trị độ hấp thụ khác nhau không quá
5% và IC50 < 2 0 |J.g/ml được coi là có hoạt tính.
Kết quả thử độc tính tế bào của 3 chất đã tổng hợp được ghi ở bảng 8
32
nhó hcm 5% (dé dan gián hóa két quá chúng tói khóng dira giá tri SD cu thé váo báng 8).
Báng 8 : Két quá thir doc tính té bao cüa các chát I, II, IV Dóng té báo
.. A
. H / ■
Nong do ifc che 50% sir phát trien cúa té báo (IC50) (iig/ml) I II IV DPT R = H R = 5-Br R = 7-C1 K562 8.252 2.277 > 1 0 2.384 NCI-H23 3.742 5.697 > 1 0 3.904 H C T 15 7.208 6.544 > 1 0 5.482 ACHN 4.332 > 1 0 > 1 0 5.893 PC-3 4.384 2.922 > 1 0 1.592 NUGC-3 2.687 1.250 > 1 0 2.435 MDA-MB-231 > 1 0 > 1 0 > 1 0 3.721
Ghi chú: K562: té bao ung thu bgch cáu; NCI-H23: té bao ung th u ph ói; HCT-15: té bao ung
thu ruót két; ACHN: té bao ung thu biéu mó thán; PC-3: té bao ung thu tuyén tién liét;
NUGC-3: té bao ung thu da dáy; M D A -M B -231: té bao ung thu vú da di can cúa nguai.
DPT: deoxypodophyllotoxin, chát chuán duong tính.
Nhan xét: Qua két quá thú nghiem chúng tói tháy:
- DÓi vói dong té bao ung thu bach cáu K562 va dóng té báo ung thu da dáy á nguai NUGC-3, trong 3 chát thú nghiem, chát I va II có IC50 < 10. Dác biet chát II (5-Br) có hoat tính kháng té báo ung thu bach cáu vá ung thu da dáy rát dáng quan tám vói giá tri IC50 nhó han IC50 cúa chát chuán duang tính DPT.
33
- Đối với dòng tế bào ung thư phổi HCI-H23 và dòng tế bào ung thư biểu mô thận ACHN, chất I đều có giá trị IC50 nhỏ hơn giá trị IC50 của chất chuẩn dương tính.
- Đối với dòng tế bào ung thư ruột kết và dòng tế bào ung thư tuyến tiền liệt chất I và II đều có hoạt tính tốt với giá trị IC50 < 10 ịig/ml.
- Đối với dòng tế bào ung thư vú MDA-MB-231, 3 chất thử nghiệm đều cho giá trị IC50> 10 |ig/ml.
- Trong 3 chất thử hoạt tính kháng tế bào ung thư, có thế thấy chất IV không có hoạt tính đáng kể trên các dòng tế bào ung thư thử nghiệm (với các giá trị IC50> 1 0 ịj.g/ml).
Từ những kết quả trên chúng tôi nhận thấy cần tiến hành nghiên cứu và thử nghiệm toàn bộ các chất đã tổng hợp được trên các dòng tế bào ung thư khác để có được một cái nhìn tổng quát hofn về độc tính trên tế bào của các chất này.