3.2.1.1. Nguyên tắc, cách tiến hành
Hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của các chất tổng họp được thử tại phòng Sinh học thực nghiệm (Viện hóa học các họp chất thiên nhiên - Viện Khoa học và Công nghệ Việt Nam) theo phương pháp của Vanden Bergher và Vlietlinck (1994) và MCKane, L., & Kandel (1996) trên các phiến vi lượng 96 giếng.
Các chủng vi sinh vật kiểm định (VSVKĐ) bao gồm: - Vi khuẩn Gr(-): Escherichia coli (ATCC 25922)
Pseudomonas aeruginosa (ATCC25923) - Vi khuẩn Gr(+): B a cillu s subtillis (ATCC 27212)
Staphylococcus aureus (ATCC 12222) - Nấm sợi: Aspergillus nỉger (439)
Fusarium oxysporum (M 42)
- Nấm men: Candida albicans (ATCC 7754)
27
Các chủng v s v này được hoạt hóa và pha loãng tới nồng độ 0,5 đơn vị Mc Fland để tiến hành thí nghiệm, v s v kiểm định không trộn kháng sinh và chất thử đóng vai trò là chứng âm tính.
Kháng sinh kiểm định bao gồm: Sữeptomycin đối với vi khuẩn Gram (-), Ampicillin đối với vi khuẩn Gram (+), Nystatin đối với nấm sợi và nấm men. Các kháng sinh được pha trong DMSO 100% với nồng độ thích họp: Streptomycin; 50 mM; Tetracyclin: 10 mM; Nystatin: 0,04 mM, và được sử dụng làm chứng dương tính.
Môi trưòng duy trì và bảo tồn giống: Saboraud Dextrose Broth (SDB)- Sigma cho nấm men và nấm mốc. Môi trường Trypcase Soya Broth (TSB)- Sigma cho vi khuẩn.
Môi trường thí nghiệm: Eugon Broth (Difco, Mỹ) cho vi khuẩn, Mycophil (Difco, Mỹ) cho nấm.
Phép thử được tiến hành qua hai bước, gồm; Bước 1. Sàng lọc sơ bộ tìm chất có hoạt tính; Bước 2. Tìm nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) của các chất có hoạt tính
3.2.1.2. Đọc kết quả
Kết quả đọc sau khi ủ các phiến thí nghiệm trong tủ ấm 37°C/24 giờ cho vi khuẩn và 30°C/48 giờ đối với nấm sợi và nấm men.
ở bước 1, kết quả dương tính là nồng độ mà ở đó không có v s v phát triển. Khi nuôi cấy lại nồng độ này trên môi trường thạch đĩa để kiểm tra, có giá trị CFƯ<5.
ở bước 2, mẫu thô có MIC < 200 ụg/ml, mẫu tinh có MIC < 50 )a,g/ml là có hoạt tính.
Chúng tôi thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm của 6 chất (từ I đến VI) và kết quả thử nghiệm được trình bày trong bảng 7 (trang 29).
28
3.2.1.3. Nhận xét
Từ kết quả thử nghiệm chúng tôi rút ra một số nhận xét như sau:
a) về tác dụng kháng khuẩn:
- Kết quả thử nghiệm cho thấy có 2 chất (I và VI) có tác dụng kháng lại chủng vi khuẩn Gr(+) Staphylococcus aureus với MIC = 50 I^g/ml.
b) về tác dụng kháng nấm:
- Cả 6 chất đều có hoạt tính kháng nấm mốc. Đặc biệt chất I có hoạt tính trên cả 2 chủng nấm mốc kiểm định với MIC = 50 ỊJ.g/ml.
29
Bảng 7: Kết quả thử hoạt tính kháng khuẩn, kháng nấm
Chất R
Nồng độ ức chế tối thiểu (MIC) (iLig/ml)
Vỉ khuẩn Gr(-) Vi khuẩn Gr(+) Nấm mốc Nấm men
EC PA BS SA AN F 0 s c CA I H (-) (-) (-) 50 50 50 (-) (-) II 5-Br (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) III 5-Cl (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) IV 7-Cl (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) V 5-F (-) (-) (-) (-) 50 (-) (-) (-) VI 5-OCH3 (-) (-) (-) 50 50 (-) (-) (-) Streptomycin 3,438 (-) Ampicillin 0,2246 0,2246 Nystatin 5,78 2,89 11,56 11,56
Ghi chú: EC, Escheriachia colv, PA, Pseudomonas aeruginosa', BS, Bacillus subtillis', SA, Staphylococcus aureus; AN,
30