2.1.1. Hoá chất và dung môi
Để tiến hành thực nghiệm chúng tôi đã sử dụng các hoá chất như đã ghi trong bảng sau:
Bảng 1: Danh mục hoá chất, dung môi sử dụng trong nghiên cứu
STT Tên Nguồn gốc Tiêu chuẩn
1 Cloramphenicol Trung quốc BP 1998
2
Acid boric, natri borat, dinatri hydrophosphat, natri dihydrophosphat Trung quốc BP 1998, hoá chất dược dụng 3 Acid acetic, methanol Merck Hoá chất dùng cho HPLC
4 Thimerosal Trung quốc NF 19
5 Nước cất tại chỗ DĐVN III
6 Lo nhưa 5ml Viêt Nam
Trong quá trình thực nghiệm các thiết bị đã được sử dụng gồm có • Máy đo pH M ettler-Toledo.
• Máy đo quang phổ tử ngoại Helios Ỵ.
• Máy sắc ký lỏng hiệu năng cao : Thermo Finigan với hệ thống bơm cao áp bốn bơm p 4000, hệ thống bơm mẫu tự động và ổn định nhiệt độ cột AS 3000, detector UV 6000 LP. Cột HYPURITY C l 8, kích thước cột 150 X 4,6 mm, kích thước hạt 5|j.m. Hệ thống điều hành với phần mềm Chrom Quest Vesion 2.51.
• Cân phân tích Satorius-BP 121S
2.2. PHƯƠNG PHÁP THỰC NGHIỆM
2.2.1. Trình tự pha chế các mẫu thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Để nghiên cứu ảnh hưởng của một số yếu tố đến độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4%, chúng tôi đã tiến hành pha các mẫu thuốc nhỏ mắt theo công thức sau:
Cloramphenicol 0,4g
Thim erosal 0,02g
Natri clorid vđ đẳng trương
Hệ đệm vđ pH 6,0, 6,5, 7,0, 7,5
Nước cất vđ lOOml
Trong đó hệ đệm được thay đổi theo mục đích nghiên cứu thực nghiệm Các mẫu thuốc đều được pha chế theo trình tự như được mô tả trong sơ đồ 1
2.2.2. Phương pháp nghiên cứu ảnh hưởng của một sô yếu tô đến độ ổn định của thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
2.2.2.1. Các yếu tô ảnh hưởng đến độ ổn định dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% được nghiên cứu là:
• Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn: Để nghiên cứu ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến độ ổn định của dung dich thuốc, chúng tôi tiến hành pha dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% có pH 6,5, và 7,0 trong dung dịch đệm boric-borat 0,2M, và dung dịch đệm phosphat 0,067M, rồi tiệt khuẩn các dung dịch này bằng 2 phương phương pháp :
- Lọc qua màng lọc lỗ xốp 0,22|im - Đun sôi ở nhiệt độ 100°C/30 phút
• Ảnh hưởng của pH và các loại hệ đệm : Để nghiên cứu ảnh hưởng của pH và loại hệ đệm đến độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt, chúng tôi tiến hành pha dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% trong hệ đệm boric- borat 0,2M, hoặc trong hệ đệm phosphat 0,067M ở các giá trị pH 6,0 , 6,5 , 7,0 , 7,5, các mẫu thuốc trên đều được tiết khuẩn bằng cách lọc qua màng lỗ xốp 0,22|um.
• Ảnh hưởng của nồng độ đệm : Để nghiên cứu ảnh hưởng của nồng hệ đệm đến đọ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt, chúng tôi tiến hành pha chê dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% có pH 7,0 trong các dung dịch đệm boric-borat 0,05M, 0,1M, 0,2M, hoặc trong các dung dịch đệm phosphat 0,05M, 0,067M , 0,1M, các mẫu thuốc trên đều được tiệt khuẩn bằng cách lọc qua màng lỗ xốp 0,22jj,m.
• Ảnh hưởng của điều kiện bảo quản : Pha dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% trong hệ đệm borat 0,2M có pH 7,0, được bảo
quản ở các điều kiện cần nghiên cứu, và đánh giá kết quả nghiên cứu trong từng điều kiện bảo quản . (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
2.2.2.2. Điều kiện bảo quản
Các mẫu thuốc sau khi pha được bảo quản ở 3 điều kiện là:
- Treo ngoài cửa sổ chịu sự tác động trực tiếp của ánh sáng và nhiệt độ thay đổi.
- Để ở nhiệt độ phòng, bọc tránh ánh sáng.
- Để ở nhiệt độ phòng, không bọc tránh ánh sáng.
2.2.2.3. Các chỉ tiêu đánh giá độ ổn định của các mẫu dung dịch thuốc nhỏ mắt
Dung dịch thuốc nói chung, dung dịch thuốc nhỏ mắt nói riêng khi nghiên cứu độ ổn định người ta thường theo dõi các chỉ tiêu sau đây:
- Cảm quan: được quan sát bằng mắt thường các mẫu thuốc mới pha và sau thời gian bảo quản.
- pH : Đo pH của các dung dịch thuốc bằng máy đo pH ở thời điểm ban đầu và sau thời gian bảo quản.
- Hàm lượng của dược chất:
• Hàm lượng cloram phenicol ban đầu, hàm lương cloramphenicol còn lại và tạp chất phân huỷ trong dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% sau bảo quản hai tháng, được xác định bằng hệ thống HPLC với pha động là:
• Nước cất- m ethanol-acid acetic ở tỷ lệ 55:45:0,1, detector u v ở bước sóng 280nm, tốc độ dòng lm l/phút.
• Pha mẫu chuẩn: Cân chính xác khoảng 0,1000g cloramphenicol, hoà tan trong pha động, có thể pha tiếp dung dịch này để đạt được nồng độ 100|Jg/ml, lọc dung dịch này qua màng có lỗ xốp 0,45/im hoặc màng lọc thích hợp để tạo ra dung dịch trong.
• Pha mẫu thử: Lấy một lượng chính xác dung dịch thuốc nhỏ mắt tương đương với 50 mg cloramphenicol vào bình định mứclOOml thêm pha đông vừa đủ,. Phân tích bằng HPLC [35]
2.3. KẾT QUẢ THỰC NGHIỆM
2.3.1. Sự liên quan giữa nồng độ cloramphenicol và diện tích pic
Phân tích các mẫu cloram phenicol khác nhau bằng HPLC với các điều kiện như đã nêu ở mục 2.2.2.3 thu được các sơ đồ như hình 1.
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
M inutes
0 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12
Minutes
Hình 1: sắc đồ của 2 dung dịch cloramphenicol phân tích bằng HPLC
L inh-280 nm c h lo ra m p h e n ic o l Retention Time Area Phòng TAS Linh -280 n m c h lo ra m p h e n ic o l Retention Time
Kết quả phân tích cho thấy, điều kiện phân tích bằng HPLC đã chọn cho phép tách riêng cloram phenicol ra khỏi các tạp chất phân huỷ của nó có trong mẫu phân tích, nên có thể áp dụng để theo dõi độ ổn định về hàm lượng cloram phenicol trong các mẫu thuốc nhỏ mắt.
Để khảo sát sự liên quan giữa nồng độ cloram phenicol trong các mẫu phân tích và diện tích pic, chúng tôi đã pha các dung dịch cloram phenicol có nồng độ từ 0,064mg/ml, đến 0,128mg/ml và phân tích bằng HPLC thu được kết quả như ở
bảng 2 và hình 2
Bảng 2: Nồng độ, và diện tích pic của các dung dịch cloramphenicol phân tich bằng HPLC
Nồng độ
(mg/ml) 0,064 0,096 0.128
Diện tích pic 4037807 6320085 7910283 (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Diện tích pic
Hình 2: Đồ thị biểu diễn mối tương quan giữa nồng độ cloramphenicol và diện tích pic phân tích bằng HPLC
> kết quả cho thấy trong khoảng nồng độ 0.064mg/ml đến 0,128m g/m l, diện tích pic thay đổi tuyến tính so với nồng độ của dược chất, vì vậy có thể tiến hành định lượng cloram phenicol trong dung dịch thuốc nhỏ mắt trong khoảng nồng độ trên.
❖ Phân tích bằng HPLC và tính kết quả theo công thức
Trong đó
Ct , Cc (mg/ml) lần lượt là nồng độ của dung dịch thử và dung dịch chuẩn.
At , At là diện tích pic tương ứng của dung dịch thử và dung dịch chuẩn
n là hệ số pha loãng(n = 41,67)
Hàm lượng của cloram phenicol còn lại trong các mẫu thuốc so với ban đầu được tính theo công thức:
Ct 2
% cloram phenicol còn lại = -7-
* Cú
Trong đó Ctl (mg/ml) là nồng độ cloramphenicol trong mẫu thử lúc mới pha, Ct2 (mg/ml) là nồng độ cloramphenicol trong mẫu thử sau khi bảo quản ở các điều kiện theo dõi.
2.3.2. Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn
Các dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% được pha chế, bảo quản và đánh giá như được nêu ở mục 2.2.2, thu được kết quả như ghi ở Bảng 3, 4 và biểu diễn ở biểu đồ hình 3, 4.
Bảng 3: Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến độ ổn định của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% về cảm quản và pH
Chỉ tiêu Sau khi pha Sau lọc loại khuẩn Sau tiệt khuẩn
100°C/30 phút
Dung dịch X,
Cảm quan pH Cảm quản pH Cảm quan pH
pH 6,5, đệm boric-borat Trong, không mầu 6,55 Trong, không mầu 6,55 Trong,vàng nhạt 6,53 pH 7,0, đệm boric-borat Trong, không mầu 7,13 Trong, không mầu 7,13 Trong, vàng nhạt 7,24 pH 6,5, đệm phosphat Trong, không mầu 6,59 Trong, không mầu 6,59 Trong, vàng nhạt 6,52 pH 7,0, đệm phosphat Trong, không mầu 7,01 Trong, không mầu 7,01 Trong,vàng nhạt 7,32 '<© 7.4 5 7.2 JCV 7 ,p3' 6.8 s 3 ■o 6.6 cs 6.4 u X 6.2 Q- 6 m □ Mới pha H Sau lọc □ Nhiệt TK pH6,5-B pH7,0-B pH6,5-P Mẫu thử pH7,0-P
Hình3: Ánh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến độ ổn định về pH của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Nhận xét:
- Cảm quan: nói chung ở cả hai hệ đệm, sau khi pha và dung dịch được lọc tiệt khuẩn vẫn trong, không mầu, ngược lại dung dịch được tiệt khuẩn ở
- Lọc tiệt khuẩn không làm thay đổi pH của dung dịch thuốc nhỏ mắt lúc mới pha. Trái lại dung dịch được tiệt khuẩn ở 100°C/30 phút pH của dung dịch có pH < 7, có xu hướng giảm xuống và pH > 7 lại có xu hướng tăng lên. Bảng 4: Ảnh hưởng của phương pháp tiệt khuẩn đến độ ổn định về hàm lượng
dược chất của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Chỉ tiêu Dung-.
dịch
Sau khi pha Sau lọc
loại khuẩn (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Sau tiệt khuẩn
100°c/phút c% % hàm lượng % hàm lượng còn lại % hàm lượng còn lại pH 6,5 đệm boric- borat 0,36 100 100 99,78 pH 7,0 đệm boric- borat 0,37 100 100 99,98 pH 6,5 đệm phosphat 0,43 100 100 99,67 pH 7,0 đệm phosphat 0,42 100 100 99,92 100.1 õ 100 1 99.9 t 99.8 « I 99.7 ^ 99.6 99.5 pH6,5-B pH7,0-B pH6,5-P pH7,0-P Mẫu thử E3 Mới pha H Sau lọc □ Nhiệt TK
Hình 2: Ảnh hưởng của phương pháp tiết khuẩn đến độ ổn định về hàm lượng dược chất của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Kết quả thực nghiệm cho thây:
màng có lỗ xốp 0,22ị^m, khác với khi tiệt khuẩn ở 100°C/30 phút, hàm lượng cloramphenicol giảm đi do nhiệt đã thúc đẩy phản ứng phân huỷ cloramphenicol.
- Bằng thực nghiệm, chúng tôi thấy dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% không nên dùng nhiệt để tiệt khuẩn. Phương pháp lọc vô khuẩn bằng màng có lỗ xốp 0,22|im là thích hợp nhất để dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% đạt được các chỉ tiêu chất lượng cả về cảm quan, pH và hàm lượng dược chất.
2.3.3. Ảnh hưởng của pH và loại hệ đệm
Các dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% được pha chế, bảo quản và đánh giá như được nêu ở mục 2.2.2. Kết quả thực nghiệm ghi ở bảng 5 ,6, 7 và biểu diễn bằng biểu đồ hình 5, 6, 7, 8.
Bảng 5: Ảnh hưởng của pH và loại hệ đệm đến độ ổn định về cảm quan của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Chỉ tiêu
Cảm quan lúc mới pha
Cảm quan sau hai tháng D D ^ \
Phòng TAS Phòng KTAS Cửa sổ
pH6,0/đệm borat Trong không mầu Trong không mầu
Trong, vàng nhạt
Trong, vàng đỏ pH6,5/đệm borat Trong không mầu Trong không
mầu
Trong, vàng nhạt
Trong, vàng đậm pH7,0/đệm borat Trong không mầu Trong không
mầu
Trong, vàng nhạt
Trong, vàng đậm pH7,5/đệm borat Trong không mẩu Trong không
mầu
Trong, vàng Trong, vàng đỏ pH6,0/đệm
phosphat
Trong không mầu Trong không mầu
Trong, vàng Trong, vàng đậm pH6,5/đệm
phosphat
Trong không mầu Trong không mầu
Trong, vàng Trong, vàng đậm pH7,0/đệm (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
phosphat
Trong không mầu Trong không mầu
Trong, vàng Vàng đậm tủa nâu pH7,5/đệm
phosphat
Trong không mầu Trong không mầu
Trong, vàng Vàng đậm tủa nâu
K ết quả trong nghiên cứu trên cho thấy:
■ Dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% có pH 6, đến pH 7,5, pha trong trong hệ đệm borat, hoặc trong hệ đệm phosphat, khi bảo quản ở điều kiện phòng tránh ánh sáng không có sự thay đổi về cảm quan so với dung dịch mới pha. Nhưng khi có tác động của ánh sáng (bảo quản trong phòng không bọc tránh ánh sáng, hoặc để ngoài cửa sổ) thì pH có ảnh hưởng rõ rệt. Đối với dung dịch pha trong hệ đệm borat có pH 6,5 đến 7,0 ít biến đổi hơn so với dung dịch có pH 6,0 và 7,5, còn dung dịch thuốc pha trong hệ đệm phosphat có pH 6,0 đến 6,5 ít biến đổi hơn dung dịch có pH 7,0 đến 7,5.
■ Dung dịch thuốc pha trong hệ đệm phosphat có pH 7,0 đến 7,5, bảo quản ở ngoài cửa sổ có xuất hiện kết tủa mầu nâu mà điều đó không xuất hiện đối với dung dịch thuốc pha trong hệ đệm borat ở cùng pH và cùng điều kiện bảo quản.
Bảng 6: Ảnh hưởng của pH và loại hệ đệm đến sự thay đổi của pH dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4%
tiêu
DD pH mới pha
PH sau khi bảo quản 2 tháng
Phòng TAS Phòng KTAS Cửa sổ
pH6,0/đệm borat 6,29 6,20 6,14 3,78 pH6,5/đệm borat 6,57 6,51 6,38 3,17 pH7,0/đệm borat 7,02 7,39 7,36 6,75 pH7,5/đệm borat 7,59 7,70 7,63 7,23 pH6,0/đệm phosphat 6,04 6,10 5,96 4,34 pH6,5/đệm phosphat 6,59 6,68 6,50 5,23 pH7,0/đệm phosphat 7,01 7,42 7,40 7,22 pH7,5/đệm phosphat 7,72 8,09 8,00 7,64
□ Mới pha B TAS ■ KTAS □ Cửa sổ pH6,0-B pH6,5-B pH7,0-B Mẫu thử pH7,5-B
H ìn h 5: Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi pH dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% pha trong hệ đệm borat sau 2 tháng bảo quản
□ Mới pha BTAS ■ KTAS □ Cửa sổ pH6,0-P pH6,5-P pH7,0-P Mẩu thử pH7,5-P
Hình 4: Ảnh hưởng của pH đến sự thay đổi pH của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% pha trong hệ đệm phosphat sau 2 tháng bảo quản
Theo kết quả nghiên cứu trên cho thây
- Dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% có pH khác nhau khi bảo quản ở các điều kiện khác nhau bị thay đổi pH ở mức độ khác nhau. pH bị giảm nhiều khi cho dung dịch thuốc chịu tác động trực tiếp của ánh sáng, pH ít thay đổi khi bảo quản dung dịch thuốc ở nhiệt độ phòng tránh ánh sáng.
- Các dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% có pH<7, dưới tác động của ánh sáng pH giảm rất nhiều so với pH của dung dịch thuốc mới
pha. Cũng trong điều kiện đó pH của các dung dịch thuốc có pH > 7 thay đổi không đáng kể.
> Kết quả thực nghiệm cũng cho thấy dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% có pH 7,0, và pH 7,5, bị thay đổi pH không đáng kể, chứng tỏ dung dịch thuốc bền ở pH 7,0 đến 7,5.
Bảng 7: Ảnh hưởng của pH và hệ đệm đến độ ổn định về hàm lượng dược chất dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4%
Chỉ tiêu Hàm lượng ban đầu
Hàm lượng của dược chất còn lại sau 2 tháng bảo quản
Dung dịcn^v
c% % Hàm
lượng (adsbygoogle = window.adsbygoogle || []).push({});
Phòng TAS Phòng KTAS Ngoài cửa sổ
pH6,0/đệm borat 0,39 100 97,20 95,99 73,06 pH6,5/đệm borat 0,42 100 97,26 93,69 77,56 pH7,0/đệm borat 0,43 100 97,96 94,01 88,21 pH7,5/đệm borat 0,41 100 98,12 95,28 89,24 pH6,0/đệm phosphat 0,39 100 84,10 78,56 65,02 pH6,5/đệm phosphat 0,43 100 92,43 82,67 68,09 pH7,0/đệm phosphat 0,42 100 94,88 86,09 70,34 pH7,5/đệm phosphat 0,42 100 92,53 84,78 69,76
Hình 7: Ảnh hưởng của pH đến độ ổn định về hàm lượng dược chất dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% pha trong hệ đệm borat 0,2M
□ mới pha BTAS □ KTAS □ Ngoài cửa sổ pH6,0-P pH6,5-P pH7,0-P pH7,5-P Mẫu thử
H ình 8: Ảnh hưởng của pH đến độ ổn định về hàm lượng dược chất của dung dịch thuốc nhỏ mắt cloramphenicol 0,4% pha trong hệ đệm
phosphat 0,067M sau thời gian 2 tháng bảo quản
Kết quả thực nghiệm cho thấy:
- Trong cùng điều kiện bảo quản hàm lượng cloramphenicol trong các dung dịch thuốc cloramphenicol 0,4% có pH khác nhau cũng khác nhau. Các
© *3 Ậ a ầ £ o & I uz. 95 88 81 74 67 60
dung dịch thuốc pH 7,0 hoặc 7,5, hàm lượng cloramphenicol bị giảm ít hơn so với các dung dịch thuốc có pH 6,0 hoặc 6,5.
Trong cùng một giá trị pH hàm lượng cloram phenicol còn lại trong các dung dịch thuốc nhỏ mắt cloram phenicol 0,4% pha trong hệ đệm borat cao hơn so với hàm lượng cloram phenicol pha trong hệ