Hoạt tính và sử dụng - Đối tượng nghiên cứu:- 123docz.net

3. Đối tượng nghiên cứu:

1.2.3. Hoạt tính và sử dụng

Đã có hơn 400 tài liệu về thành phần hoá học, dược lý lâm sàng nấm vân chi công bố khắp thế giới. Trong cuốn “Dược vật học” đời nhà Minh (Trung Quốc) ghi lại rằng: “Nấm vân chi đen và lục bồi bổ khí huyết, tăng năng lượng cuộc sống, và nó còn có tác dụng làm vững gân cốt. Nếu dùng vân chi trong một thời gian dài sẽ làm cho con người cảm thấy khoẻ mạnh, yêu đời, sôi nổi và sống lâu hơn”. Vân chi được dùng dưới dạng trà có tác dụng hạ thấp lượng cholesterrol máu, áp suất máu, chống chứng rối loại nhịp tim, điều khiển nồng độ đường trong máu.

Ở châu Á, nấm được dùng chung với các thành phần thảo mộc khác để chữa trị ung thư. Các báo cáo từ những năm 1960 đã cho thấy lợi ích về sức khỏe trong điều trị ung thư dạ dày khi uống trà “Saruno-koshikake” có chứa

nấm vân chi Trametes versicolor. Nghiên cứu đã chỉ ra rằng nấm này có hoạt tính kháng khuẩn, kháng virus và kháng khối u. Ngày nay, vân chi được sử dụng như một loại dược liệu trong hỗ trợ điều trị ung thư. Ở Nhật, năm 1987, PSK-chất trích từ vân chi chiếm ¼ thị phần dược phẩm trị ung thư (Fukushima, 1989). Ở Trung Quốc, vân chi được sử dụng để điều trị nhiều loại ung thư và cũng được dùng để trị bệnh viêm gan mãn tính, viêm nhiễm đường hô hấp, viêm cơ quan bài tiết và cơ quan tiêu hoá. Ngoài ra trong các bài thuốc cổ truyền của Trung Quốc, vân chi được dùng để tăng cường hiệu quả cho hệ miễn dịch, loại bỏ độc tố cơ thể, giảm đờm, tăng năng lượng và làm tinh thần sảng khoái, kéo dài tuổi thọ, hạ nhiệt do vân chi có tính hàn, vị ngọt.

Trong điều trị ung thư, khi sử dụng kết hợp PSP, PSK (hợp chất trích từ nấm) với hoá trị hay xạ trị sẽ làm tăng tỉ lệ sống còn của bệnh nhân ung thư và làm giảm các triệu chứng do hoá trị hay xạ trị gây ra. Các hợp chất trích từ vân chi rất an toàn khi sử dụng, không có phản ứng phụ, không độc. Chỉ tìm thấy một biểu hiện nhỏ khi sử dụng PSK là nó làm đen các đầu ngón tay ở một số rất ít bệnh nhân chịu tác dụng điều trị (khoảng 4/77 người mắc phải).

Một số biệt dược của nấm vân chi: Vân chi, Lục bảo Vân chi, (PSK) VPS – Coriolus versicolor, Coriolus-VPS® , PSK® , Yunzhi

Polysaccharide peptide (Trade mark Qing Kang), PSP polysaccharide-peptide (Landford).

Nấm vân chi sản xuất ra các enzyme phá gỗ như: laccaza, mangan peroxidaze (MnP), lignin peroxidaze (LnP). Các enzyme này đang được nghiên cứu ứng dụng trong lĩnh vực tẩy trắng bột cellulose. Laccaza từ nấm vân chi có thể phân huỷ một phần hợp chất clo của CPC, có thể declo hoá nhiều hợp chất clophenol do đó được dùng trong xử lý chất thải, khử màu chất thải từ khâu tẩy trắng.

của T. gibbosa có khả năng đưa đến tác dụng bảo vệ mạch. Nghiên cứu đã chứng minh rằng khi tiêm tĩnh mạch của T. gibbosa polysaccharides vô hiệu hóa thay đổi tính thấm của mạch máu, giảm tổng lượng protein trong tràn dịch màng phổi, tăng số lượng bạch cầu trung tính và bạch cầu ái toan trong khi giảm số lượng các tế bào lympho trong máu xung quanh.

Gần đây, người ta thấy rằng chiết xuất hữu cơ của Trametes gibbosum

(như Daedalea gibbosa) sợi nấm có tác dụng ức chế sự tăng trưởng của tế bào K562, một biểu hiện của bệnh bạch cầu dòng tủy mãn tính con người. Chiết xuất từ methanol T. gibbosa đã được chứng minh là có tác dụng ức chế nhẹ (<40% ) trên HIV.

Chiết xuất dung dịch nước và methanol từ quả thể của Trametes hirsuta

đã được thử nghiệm chứng minh có tác dụng kháng khuẩn và kháng nấm đối với năm loại nấm gây bệnh như Penicillium SPS, Aspergillus fumigatous,

Aspergillus niger, Aspergillus flavus và Mucour indicus và năm loại vi khuẩn như Escaureus và Pseudomonas aeruginosa, Salmonella typhi, Staphylococcus

Chương 2

PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Phương pháp nghiên cứu

2.1.1. Phương pháp lấy mẫu

Mẫu quả thể nấm được thu hái vào thời điểm thích hợp trong năm. Mẫu tươi sau khi lấy về được rửa sạch, để nơi thoáng mát hoặc sấy khô ở 400C. Mẫu được xử lý tiếp bằng phương pháp chiết chọn lọc với các dung môi thích hợp để thu được hỗn hợp các hợp chất dùng cho nghiên cứu được nêu ở phần thực nghiệm.

2.1.2. Phương pháp phân tích, phân tách các hỗn hợp và phân lập các hợp chất chất

Để phân tích và phân tách cũng như phân lập các hợp chất, sử dụng các phương pháp sắc ký như:

- Sắc ký lớp mỏng (TLC) phân tích được tiến hành trên bản mỏng kính silicagel Merck 60 F254 tráng sẵn, độ dày 0,2 mm.

- Sắc ký cột thường, sử dụng silicagel cỡ hạt 70-230 mesh (Merck) - Hiện màu: hơi iot và đèn UV 254 nm.

- Các phương pháp kết tinh phân đoạn.

2.1.3. Phương pháp khảo sát cấu trúc các hợp chất

Cấu trúc của các hợp chất được khảo sát nhờ sự kết hợp các phương pháp phổ:

- Phổ khối lượng (ESI-MS).

- Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR. - Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 13C-NMR. - Phổ DEPT.

- Phổ HSQC. - Phổ HMBC.

2.2. Hoá chất, dụng cụ và thiết bị

2.2.1. Hoá chất

Các dung môi dùng để ngâm chiết mẫu thực vật đều dùng loại tinh khiết (pure), khi dùng cho các loại sắc ký lớp mỏng và sắc ký cột sử dụng loại tinh khiết phân tích (PA). Dung môi được sử dụng là: hexan, metanol, butanol, etylaxetat, axeton và nước cất.

2.2.2. Dụng cụ và thiết bị

Nhiệt độ nóng chảy đo trên máy Yanaco MP-S3.

Phổ hồng ngoại IR được ghi trên máy Bruker 270-30, dạng viên nén KBr. Phổ ESI-MS đo trên máy micr OTOF-Q II 10187.

Phổ cộng hưởng từ hạt nhân 1H-NMR được đo trên máy Bruker 400MHz, phổ 13C-NMR, DEPT, HMBC, HSQC và COSY được đo trên máy Bruker 100 MHz (Khoa Hóa, Đại học Quốc gia Cheng Kung, Đài Loan).

2.3. Nghiên cứu các hợp chất

2.3.1. Phân lập các hợp chất

Quả thể Trametes cubensis được thu hái ở Kỳ Sơn -Nghệ An vào tháng 08/2012. Mẫu được định danh bởi PGS. TS. Ngô Anh, khoa Sinh, Trường Đại học khoa học Huế. Tiêu bản được lưu giữ khoa Hóa, Trường Đại học Vinh.

Quả thể nấm Trametes cubensis (6,4 kg) được thu thập và sấy khô ở nhiệt độ từ 400-500C trong 48 giờ, sau khi sấy khô và xay nhỏ ngâm với metanol trong thời gian 14 ngày, sau đó lọc và dịch lọc được cất giảm áp suất bằng thiết bị quay cất chân không thu được cao metanol (580 g). Phân bố cao metanol trong nước, sau đó chiết với các dung môi hexan và etyl axetat, quay cất chân không thu được 80 g cao hexan và 380 g cao etyl axetat.

Cao etyl axetat (380g) được phân tách bằng sắc ký cột silicagel, với hệ dung môi rửa giải là cloroform: metanol (30:1; 20:1; 15:1; 10:1; 6:1; 4:1; 2:1; 0:100 metanol), thu được 7 phân đoạn. Phân đoạn 2 gồm hai chất được phân tách bằng sắc ký lỏng hiệu năng cao (HPLC) bằng dung môi axetonitril : nước (90:10) thu được hợp chất A (8 mg) và hợp chất B (10 mg).

Sơ đồ 2.1. Phân lập hợp chất trong quả thể nấm Trametes cubensis

Sơ đồ 2.2. Phân lập hợp chất từ cao etylaxetat của nấm vân chi

(Trametes cucbensis)

Cao metanol (580g)

- Phân bố trong nước

- Chiết lần lượt với hexan, etylaxetat, dịch nước

Cao hexan (80g)

Cao etylaxetat (380g)

Dịch nước

- Ngâm với metanol - Cất thu hồi metanol

Trametes cubensis (6,4 kg) Cao etylaxetat (380g) F1 F2 F5 F7 A (8mg) (10mg) B

HPLC điều chế axetonitril : nước (90:10) - SKC cloroform : metanol

2.3.2. Một số dữ kiện về phổ tử ngoại, phổ khối và phổ cộng hưởng từ hạt nhân của chất đã phân lập nhân của chất đã phân lập

Hợp chất 1: tinh thể không màu; đ.n.c 280-2830C; IRmaxKBrcm-1: 3332 (- OH), 1720 (C=O carboxyl), 1648 (C=C), 890 (=CH2); ESI-MS m/z: 469 [M- H]+;1H-NMR (500 MHz, pyridin-d5)  (ppm): ; 13C-NMR (125 MHz, pyridin- d5)  (ppm) xem bảng 3.1.

Hợp chất 2: tinh thể không màu; đ.n.c 258-260 °C; IRmaxKBrcm-1: 3320 (- OH), 1718 (C=O carboxyl), 1632 (C=C); EI-MS m/z: 455 [M-H]+; 1H- NMR (pyridine-d5); 13C-NMR (pyridine-d5) xem bảng 3.2.

Chương 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Phân lập các hợp chất

Xác định cấu trúc của các hợp chất này bằng các phương pháp phổ

3.2. Xác định cấu trúc hợp chất A

Hợp chất A là tinh thể không màu, điểm nóng chảy tại 280 - 2830C. Phổ khối lượng ESI-MS (negative) của hợp chất A cho pic ion m/z 469 [M-H]+

tương ứng với công thức phân tử C31H50O3. Phổ hồng ngoại của hợp chất này có bước sóng hấp thụ cực đại tại 890 cm-1 đặc trưng của nhóm exometylen (=CH2), 1720 cm-1 của nhóm cacbonyl (C=O) và 3332 cm-1 của nhóm hydroxyl (-OH). Phổ 1H-NMR của hợp chất A cho thấy tín hiệu của các proton metyl tại 1,06 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 1,06 (3H, s, H-28), 1,00 (3H, s, H-29), 1,23 (3H, s, H-30), hai proton metyl ở trường cao 1,60 (H-26), 1,65 (H-27) và hai proton exometylen tại 4,88 và 4,92 ppm của H-31. Ngoài ra, phổ 1H-NMR còn xuất hiện tín hiệu của proton carbinol tại 3,45 (1H, t, H-3). Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất A xuất hiện tín hiệu của 31 cacbon, bao gồm 5 cacbon

metin, 10 cacbon metylen, 7 cacbon metyl, 4 cacbon olefinic, 1 cacbonyl và 4 cacbon bậc 4. Tín hiệu phổ 13C-NMR của hợp chất A cho thấy tín hiệu của 5

(24,5), đồng thời các tín hiệu cacbon còn lại cho thấy cấu trúc gồm một hệ thống bốn vòng trong đó có một liên kết đôi tại vị trí C-8 (135,4) và C-9 (134,3), một liên kết đôi tại C-31(107,0) và C-24 (155,9) và một cacbonyl tại C-21 (191,3). Phổ 13C-NMR còn xuất hiện tín hiệu tại C 78,0 ppm là tín hiệu của C-3 có gắn nhóm hydroxyl. Kết hợp phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, HSQC, HMBC cho thấy hợp chất 1 là một dẫn xuất của lanosterol. Từ số liệu phổ như trên và so sánh với tài liệu [60], có thể xác định cấu trúc của hợp chất A phù hợp với cấu

trúc của axit eburicoic. Hợp chất này đã được phân lập từ nấm Polyporus ailanthus, Polyporus arhracophilus Cooke, P. eucalyptorum Fr., P. sulfureus (Bull) Fr., Fomes officinalis Fr., và Lentinus dactyloides Clel.[60].

Bảng 3.1. Phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT của hợp chất A Cacbon DEPT 13C-NMR 1H-NMR Tài liệu Thực

nghiệm Tài liệu

Thực nghiệm 1 CH2 36,1 36.1 1,18 1,58 2 CH2 28,7 28,7 1,82 1,86 3 CH 78,0 78,0 3,43 dd (11,5; 4,5) 3,45 (1H, t) 4 C 39,5 39,5 5 CH 50,9 50,9 1,17 6 CH2 18,7 18,7 1,54 1,74 7 CH2 28,7 26,8 2,08 (2H) 8 C 135,2 135,4 9 C 134,3 134,3 10 C 37,4 37,4 11 CH2 21,3 21,3 1,98 (2H) 12 CH2 29,4 29,3 1,93 2,00 13 C 44,9 44,9 14 C 49,9 49,8 15 CH2 30,9 30,9 1,25 1,69 16 CH2 27,5 27,5 1,46 2,00 17 CH 47,7 47,7 2,45 18 CH3 16,3 16,3 1,07 s 1,06 (3H, s)

19 CH3 19,4 19,4 1,00 s 1,00 (3H, s) 20 CH 49,2 49,2 2,66 21 C 178,6 191,3 22 CH2 31,8 31,8 1,76 1,92 23 CH2 32,8 32,8 2,28 2,37 24 C 155,9 155,9 5,32 m 25 CH 34,2 34,2 26 CH3 22,0 22,0 1,61 s 1,60 (3H, s) 27 CH3 21,9 21,9 1,66 s 1,65 (3H, s) 28 CH3 28,6 28,6 1,07 s 1,06 (3H, s) 29 CH3 16,4 16,4 1,00 s 1,00 (3H, s) 30 CH3 24,5 24,5 1,24 s 1,23 (3H, s) 31 CH2 107,0 107,0 4,88 (1H,s) 4.92 (1H,s)

Hình 3.1. Phổ khối lượng của hợp chất A

Hình 3.3. Phổ 1H-NMR của hợp chất A

Hình 3.5. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất A

Hình 3.7. Phổ HMBC của hợp chất A

Hình 3.9. Phổ HSQC của hợp chất A

Hình 3.11.Phổ NOESY của hợp chất A

Hình 3.13. Phổ COSY của hợp chất A

3.3. Xác định cấu trúc hợp chất B

Hợp chất B là tinh thể không màu, điểm nóng chảy tại 258-260 °C. Phổ khối lượng EI-MS (negative) của hợp chất B cho pic ion m/z 455[M-H]+ tương ứng với công thức phân tử C30H48O3. Phổ hồng ngoại của hợp chất này có bước sóng hấp thụ cực đại tại 1718 cm-1 đặc trưng cho nhóm cacbonyl (C=O) và 3320 cm-1 của nhóm hydroxyl (-OH). Phổ 1H-NMR của hợp chất B cũng tương đồng

như của hợp chất A có sự xuất hiện của các tín hiệu proton metyl tại 1,06 (3H, s, H-18), 1,00 (3H, s, H-19), 1,60 (H-26), 1,65 (H-27), 1,06 (3H, s, H-28), 0,99 (3H, s, H-29), 1,23 (3H, s, H-30). Nhưng tín hiệu phổ 1H-NMR của hợp chất B cho thấy tín hiệu proton olefinic tại 5,32 (1H, t, H-24) thay thế cho tín hiệu exometylen trong hợp chất A. Phổ 13C-NMR và DEPT của hợp chất B cho thấy

tín hiệu của 30 cacbon trong đó 4 cacbon metin, 10 cacbon metylen, 7 cacbon metyl, 4 cacbon olefinic, 1 cacbonyl và 4 cacbon bậc 4. Các tín hiệu phổ cho thấy cấu trúc của hợp chất B cũng bao gồm một hệ thống bốn vòng, trong đó có

một liên kết đôi tại vị trí C-8 (135,0) và C-9 (134,3). Hợp chất B có sự xuất hiện tín hiệu của hai cacbon olefinic tại C-24 (124,9) và C-25 (134,6) và một cacbonyl tại C-21(178,7). Kết hợp phổ 1H-NMR, 13C-NMR và DEPT, HSQC, HMBC cho thấy hợp chất 1 là một dẫn xuất của lanosterol. Từ số liệu phổ như trên và so sánh với tài liệu [61], có thể xác định cấu trúc của hợp chất 2 phù hợp với cấu trúc của axit- 3β-hydroxylanosta-8,24-dien-21-oic. Hợp chất này đã được phân lập từ nấm Fomitopsis pinicola [61].

Bảng 3.2. Phổ 1H-, 13C-NMR và DEPT của hợp chất B

Cacbon DEPT 13C-NMR 1H-NMR

Tài liệu Thực nghiệm

1 CH2 36,1 36,1 1,18 1,58 2 CH2 28,7 28,7 1,82 1,86 3 CH 78,0 78,0 3,43 dd (11,5; 4,5) 3,42 (1H, t) 4 C 39,5 39,5 5 CH 50,9 50,9 1,17 6 CH2 18,7 18,7 1,54 1,74 7 CH2 28,7 26,8 2,08 (2H) 8 C 135,2 135,0 9 C 134,3 134,3 10 C 37,4 37,4 11 CH2 21,3 21,2 1,98 (2H) 12 CH2 29,4 29,4 1,93 2,00 13 C 44,9 44,9 14 C 49,9 49,9 15 CH2 30,9 30,9 1,25 1,69 16 CH2 27,5 27,5 1,46 2,00 17 CH 47,7 47,7 2,45

18 CH3 16,3 16,3 1,07(s) 1,06 (3H, s) 19 CH3 19,4 19,4 1,00(s) 1,00 (3H, s) 20 CH 49,2 49,0 2,66 21 C 178,6 178,7 22 CH2 31,8 33,3 1,76 1,92 23 CH2 32,8 26,7 2,28 2,37 24 CH 155,9 124,9 5,32 (m) 5,32 (1H, t) 25 C 34,2 131,7 26 CH3 22,0 25,8 1,61 (s) 1,60 (3H, s) 27 CH3 21,9 17,7 1,66 (s) 1,65 (3H, s) 28 CH3 28,6 28,6 1,07 (s) 1,06 (3H, s) 29 CH3 16,4 16,4 1,00(s) 0,99 (3H, s) 30 CH3 24,5 24,5 1,24 (s) 1,23 (3H, s)

Hình 3.15. Phổ khốilượng của hợp chất B

Hình 3.17. Phổ 1H-NMR của hợp chất B

Hình 3.19. Phổ 13C-NMR của hợp chất B

Hình 3.21. Phổ HMBC của hợp chất B

Hình 3.23. Phổ HSQC của hợp chất B

Hình 3.25. Phổ NOESY của hợp chất B

KẾT LUẬN

Nghiên cứu thành phần hoá học quả thể nấm Trametes cucbensis ở Kỳ Sơn – Nghệ An, chúng tôi đã thu được một số kết quả như sau:

- Bằng các phương pháp ngâm chiết với các dung môi chọn lọc rồi cất thu hồi dung môi đã thu được các cao tương ứng là cao hexan (80g) và cao etylaxetat (380g).

- Phân lập các hợp chất từ cao etylaxetat bằng các phương pháp sắc ký và kết tinh phân đoạn thu được chất A và B.

- Đã tiến hành sử dụng các phương pháp phổ hiện đại : phổ tử ngoại (UV), phổ hồng ngoại (IR), phổ khối lượng phun mù (ESI-MS), phổ cộng