2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu:
2.3.1.1. Dung dịch natri tungstat: 120g/l:
Lấy 13,6072g Na2WO4.2H2O 99% (m=329,86 g/mol) hòa tan trong nước và định mức đến 100ml.
2.3.1.2. Dung dịch axit sulfuric 5%:
Lấy 5,15ml H2SO4 (96-98%) cho vào bình định mức 100 ml có sẵn nước cất và định mức đến vạch.
2.3.1.3. Dung dịch propanol 0,25g/l:
+ Pha dung dịch propanol 10g/l: Dùng micropipet hút chính xác 1,26ml propanol 99% (d=0,803 g/ml) cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
+ Pha dung dịch propanol 0,25g/l: Hút chính xác 2,50ml propanol 10g/l cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
2.3.1.4. Các dung dịch ethanol:
+ Pha dung dịch 10g/l: Dùng micropipet hút 2,532ml ethanol 99,99% (d = 0,790g/ml) cho vào bình định mức 200ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
+ Từ dung dịch trên ta chuẩn bị các dung dịch: 30mg/100ml, 50mg/100ml; 100mg/100ml; 200mg/100ml; 300mg/100ml và 400mg/100ml để dựng đường chuẩn.
+ Các dung dịch dùng để khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi.
2.3.1.5. Dung dịch máu có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu:
Lấy 2,5ml ethanol 1000mg/100ml cho vào bình định mức 25ml và định mức bằng máu (máu tươi không có cồn, được thu sau 5 ngày không có sử dụng rượu, bia hoặc đồ uống có cồn) đến vạch, lắc đều.
2.3.2. Chuẩn bị mẫu:
2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử:
- Bước 1: Lấy 0,2ml máu cho vào ống nghiệm. - Bước 2: Cho thêm vào 1,8ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6:Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2- 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Tách lớp chất lỏng ở trên. Ta thu được dung dịch mẫu thử.
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn:
- Bước 1: Lấy 0,2ml máu, thêm 0,2ml chuẩn ethanol ….mg/100ml cho vào ống nghiệm.
- Bước 2: Cho thêm vào 1,6ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6: Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2 - 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Tách lớp chất lỏng ở trên. Ta thu được dung dịch mẫu thử.
2.3.2.3. Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Từ các dung dịch chuẩn gốc ethanol ở các nồng độ 30mg/100ml; 50mg/100ml; 100mg/100ml; 200mg/100ml; 300mg/100ml và 400mg/100ml, quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn tương tự như chuẩn bị mẫu thử, nhưng chỉ thay
0,2ml máu bằng 0,2ml chuẩn tương ứng. Cụ thể, quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn như sau:
- Bước 1: Lấy 0,2ml chuẩn ethanol …. mg/100ml cho vào ống nghiệm. - Bước 2: Cho thêm vào 1,8ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6: Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2 - 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Ta thu được dung dịch mẫu chuẩn.
2.3.2.4. Chuẩn bị mẫu trắng:
Quy trình chuẩn bị mẫu trắng tương tự như chuẩn bị mẫu thử (tiểu mục 2.3.2.1) nhưng chỉ thay 0,2ml máu bằng 0,2ml nước cất.
2.3.3. Thiết bị, điều kiện phân tích và trình tự tiêm mẫu [7]
2.3.3.1. Thiết bị phân tích:
- Sắc ký khí gắn đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID, Bruker - 456). - Cột mao quản: Supelcowax-10 (30m x 0,32mm x 0,25µm). - Hệ thống tiêm mẫu tự động: Autosampler 8400.
2.3.3.2. Điều kiện phân tích:
- Nhiệt độ buồng tiêm (injector): 200oC. - Chế độ tiêm: Chia dòng (1:20).
- Dòng qua cột: 1,13 ml/phút. - Chương trình nhiệt độ:
STT Tốc độ (oC /min) Nhiệt độ cuối (oC) Thời gian giữ (min)
1 - 40,00 5,00
- Nhiệt độ dectertor : 250oC.
- Tổng thời gian chương trình :15,00 min. - Thể tích tiêm mẫu: 1µL.
2.3.3.3. Trình tự tiêm mẫu:
Máy sau khi được cài đặt theo đúng điều kiện phân tích như trên. Trình tự tiêm mẫu được thực hiện như sau:
- Mẫu trắng.
- Mẫu chuẩn theo trình tự từ thấp đến cao (30mg → 400mg/100ml). - Mẫu thử.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn 3.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1):
Quy trình xử lý mẫu chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.2.3) giống như quy trình xử lý mẫu thử, chỉ khác ở bước 1 là thay 0,2ml máu bằng 0,2ml chuẩn ethanol ở các nồng độ 30/50/100/200/300/400mg/100ml. Tiến hành phân tích, ta có dữ liệu ở bảng (3.1).
Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP 1:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6 Sc 43,7 115,9 359,4 727,9 964,4 1648,5
Snc 732,3 1002,4 1392,9 1306,7 1096,4 1397,9
Sc/Snc 0,0596 0,1156 0,2580 0,5571 0,8796 1,1793
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1
y = 0,0030x - 0,0393 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Sc/Snc C (mg/100ml)
3.1.2. Xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu trắng (PP 2):
Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng, quy trình xử lý mẫu chuẩn giống như quy trình xử lý mẫu thêm chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.2.2)
- Nguồn gốc mẫu trắng: Thu trên cơ thể của bản thân, thu sau 5 ngày không sử dụng rượu bia hoặc thức uống có cồn.
- Tiến hành phân tích các mẫu, ta có dữ liệu ở bảng (3.2).
Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP2:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6
Sc 45 128,9 309,1 642,6 1103,2 1349,3
Snc 758,4 1247,4 1144,6 1111,1 1221,4 1127,3
Sc/Snc 0,0593 0,1033 0,2701 0,5783 0,9032 1,1969
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP2
y = 0,0031x - 0,0419 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400 500 Sc/Snc C
3.1.3. Xây dựng đƣờng chuẩn với chuẩn tinh khiết, không xử lý mẫu chuẩn (PP3):
Mục đích của phương pháp này là đơn giản quy trình xử lý mẫu và so sánh kết quả với hai phương pháp trên.
Quy trình xử lý mẫu của phương pháp này khác với PP 1 ở bước 2 (thêm 2,3ml nước) và bỏ qua bước 5, 6 (không thêm 0,3ml natri tungstat và 0,2ml axit sulfuric). Tiến hành phân tích các mẫu, ta có dữ liệu ở bảng (3.3).
Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP3:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6
Sc 56 93,9 287,6 265,1 541,7 444,1
Snc 911,2 743,2 1031,1 470,5 606,4 379,1
Sc/Snc 0,0615 0,1263 0,2789 0,5634 0,8933 1,1715
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3
y = 0,0030x - 0,0245 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400 500 C (mg/100ml) Sc / Snc
* Từ 3 đồ thị trên ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng:
y = ax + b
Từ các phương trình đường chuẩn trên ta tính được nồng độ ethanol trong máu (x) từ tỉ lệ diện tích peak ethanol/propanol (y) của mẫu thử:
x = (y - b)/a
Trong đó: y: tỷ lệ diện tích peak chất chuẩn/nội chuẩn (Sc/Snc). x: nồng độ ethanol (mg/100ml).
3.1.4. So sánh kết quả các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn
Để có cơ sở so sánh độ đúng của 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn nêu trên, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu máu có nồng độ đã biết trước (ký hiệu M1) và mẫu máu chưa biết nồng độ (ký hiệu M2).
- Mẫu máu ký hiệu M1 có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu, là mẫu trắng thêm chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.1.5).
- Mẫu máu ký hiệu M2 là mẫu do khách hàng gửi.
Bảng 3.4: Tỉ lệ diện tích peak và nồng độ của các mẫu M1 và M2 tính theo
3 phương pháp xây dựng đường chuẩn:
Mẫu M1 Mẫu M1’ Mẫu M2 Mẫu M2’
Sm 309,4 281 694,6 536,1 Snc 1215,8 1060,2 1037,7 774,9 Sm/Snc 0,2545 0,2650 0,6694 0,6918 Sm/Snc (trung bình) M1-TB = 0,2598 M2-TB = 0,6806 CPP 1 (mg/100ml) 99,70 / 100 239,97 CPP 2 (mg/100ml) 97,32 / 100 233,06 CPP 3 (mg/100ml) 94,77 / 100 235,03
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn
(PP 1; PP 2; PP 3), thuận lợi và khó khăn của quy trình xử lý chuẩn, chúng tôi xin chọn phương pháp xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1) để đem so sánh kết quả với phương pháp một điểm chuẩn và tính các kết quả thực nghiệm ở phần sau.
3.2. Khảo sát phƣơng pháp một điểm chuẩn
Trong phần này, chúng tôi lấy tỉ lệ diện tích Sc/Snc của các điểm chuẩn
ở nồng độ 50; 100; 200; 300; 400mg/100ml của PP 1 để tính kết quả nồng
độ của mẫu thử CM2-TB và so sánh kết quả với phương pháp đường chuẩn. Tính phần trăm độ sai lệch của hai phương pháp theo phương trình sau:
Độ sai lệch (%) = |CPPĐC - CPP1ĐC|*100 CPPĐC
Với: CPPĐC và CPP1ĐC là nồng độ mẫu thử tính theo phương pháp đường chuẩn và phương pháp một điểm chuẩn.
Bảng 3.5: Kết quả nồng độ mẫu CM2-TBvà độ sai lệch giữa phương pháp
đường chuẩn (PP1) và phương pháp một điểm chuẩn:
Tên mẫu PP 1 Điểm 50
(mg/100ml) Điểm 100 (mg/100ml) Điểm 200 (mg/100ml) Điểm 300 (mg/100ml) Điểm 400 (mg/100ml) CM2-TB (mg/100ml) 239,9 7 294,38 263,80 244,34 232,13 230,85 Độ sai lệch (%) 22,67 9,93 1,82 3,28 3,80 Nhận xét:
- Nếu chúng ta chọn điểm chuẩn không phù hợp (điểm 50mg/100ml, không gần với nồng độ của mẫu thử cần phân tích) thì phương pháp một điểm chuẩn có độ sai lệch rất lớn so với phương pháp đường chuẩn.
- Phương pháp một điểm chuẩn có kết quả gần đúng với phương pháp đường chuẩn khi ta chọn được điểm chuẩn có nồng độ gần với nồng độ mẫu cần phân tích (điểm 200mg/100ml). Nhưng trong thực tế của công tác phân tích nồng độ cồn trong máu là chúng ta không biết trước khoảng nồng độ cồn trong máu của mẫu cần phân tích nên chúng ta không chọn được điểm chuẩn phù hợp.
3.3. Khảo sát hiệu suất thu hồi
Mục đích khảo sát hiệu suất thu hồi là xác định độ đúng của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát hiệu suất bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu thử ở 3 nồng độ: Thấp, trung bình và cao.
- Mẫu thử M3 là mẫu do khách hàng gửi.
- Quy trình xử lý mẫu thêm chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.2.2) và tính kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi theo phương pháp xây dựng đường chuẩn (PP 1; có phương trình y = 0,0030x – 0,0393).
Bảng 3.6: Kết quả khảo sát hiệu suất thu hồi (H%):
Tên mẫu CThêm vào
(mg/100ml) CThu đƣợc (mg/100ml) CTrung bình (mg/100ml) H% M3 0 94,56 93,86 M3 0 93,16 M3 +50 50 142,36 143,32 98,93% M3 +50 50 144,29 M3+100 100 190,34 190,85 96,99% M3 + 100 100 191,37 M3 + 200 200 286,58 286,74 96,44% M3 + 200 200 286,89
Nhận xét: Hiệu suất thu hồi của phương pháp cao (96-99%). 3.4. Khảo sát độ lặp lại
Mục đích xác định độ lặp lại là để xác định độ ổn định của thiết bị và phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát độ ổn định của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp trên hai nền mẫu là mẫu chuẩn và mẫu thử. Tính độ lặp lại dựa vào nồng độ của mẫu.
3.4.1. Độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị:
Tiến hành xử lý 1 mẫu chuẩn và 1 mẫu thử (M4) giống như quy trình xử lý mẫu của phương pháp đường chuẩn 1 (PP 1; có phương trình y = 0,0030x – 0,0393).
- Mẫu chuẩn ở nồng độ ~ 50mg/100ml. - Mẫu thử M4 là mẫu do khách hàng gửi.
- Mỗi mẫu tiến hành phân tích 6 lần trong cùng điều kiện, tính kết quả độ lặp lại của thiết bị.
Bảng 3.7: Kết quả khảo sát độ lặp lại của thiết bị:
Tên mẫu Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 Lần 5 Lần 6 RSD% M ẫ u ch uẩ n Sc/Snc 0,1104 0,1123 0,1112 0,1098 0,1122 0,1101 0,72% CChuẩn (mg/100ml) 49,9 50,53 50,17 49,7 50,5 49,8 M ẫ u th ử M 4 Sc/Snc 0,6035 0,6085 0,6007 0,5981 0,6092 0,6060 0,68% CM4 (mg/100ml) 214,28 215,92 213,34 212,48 216,17 215,11
3.4.2. Độ lặp lại của phƣơng pháp:
Tiến hành xử lý 6 mẫu chuẩn và 6 mẫu thử giống như quy trình xử lý mẫu của phương pháp đường chuẩn 1 (PP 1; có phương trình y = 0,0030x – 0,0393).
- Mẫu chuẩn ở nồng độ ~ 30mg/100ml.
- Mẫu thử M5 là mẫu M1 được bảo quản đông đá, sau 72 ngày.
Tiến hành phân tích các mẫu trong cùng điều kiện và tính kết quả độ lặp lại của phương pháp.
Bảng 3.8: Kết quả khảo sát độ lặp lại của phương pháp:
Tên mẫu Mẫu 1 Mẫu 2 Mẫu 3 Mẫu 4 Mẫu 5 Mẫu 6 RSD%
M ẫ u ch uẩ n Sc/Snc 0,0486 0,0545 0,0611 0,0619 0,0630 0,0611 5,80% Nồng độ (mg/100ml) 29,29 31,25 33,45 33,75 34,12 33,46 M ẫ u th ử M 5 Sc/Snc 0,2346 0,2186 0,2258 0,2162 0,2201 0,2392 3,60% Nồng độ (mg/100ml) 78,98 74,25 76,39 73,56 74,71 80,34
Nhận xét: RSD% (thiết bị) < 1%; RSD% (phương pháp) < 6% đều
thấp hơn giới hạn cho phép.
3.5. Khảo sát giới hạn phát hiện và giới hạn định lƣợng 3.5.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD): 3.5.1. Khảo sát giới hạn phát hiện (LOD):
- Có nhiều PP xác định LOD, trong phần thực nghiệm này, chúng tôi chọn phương pháp xác định LOD thông qua tỷ lệ chiều cao của tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu đường nền. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại
- Chiều cao nhiễu đường nền (N) được xác định bằng cách phóng to đường nền ở nhiều vị trí khác nhau và tính chiều cao trung bình của nhiễu đường nền.
3.5.1.1. Chuẩn bị mẫu:
- Chuẩn bị các dung dịch chuẩn gốc ethanol ở các nồng độ: 8mg/100ml; 7mg/100ml; 6mg/100ml; 5mg/100ml; 4mg/100ml; 3mg/100ml; 2mg/100ml; 1mg/100ml; 0,5mg/100ml; 0,25mg/100ml.
- Quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn khảo sát giới hạn phát hiện giống như chuẩn bị mẫu thử, chỉ thay 0,2ml máu bằng 0,2ml dung dịch chuẩn gốc.
3.5.1.2. Tiến hành khảo sát:
* Tiến hành phân tích các mẫu từ nồng độ cao đến thấp, kết quả nhận thấy:
- Ở các nồng độ từ 10mg 2mg/100ml đều phát hiện peak ethanol. - Ở nồng độ nhỏ hơn hoặc bằng 1mg/100ml không phát hiện peak ethanol.
- Tính sơ bộ chiều cao của nhiễu đường nền (N) khoảng 70-80, trong khi chiều cao của peak ethanol (S) ở nồng độ 3mg/100ml là 92,9 và 2mg/100ml là 89,4 rất thấp, suy ra tỉ lệ S/N < 2.
* Do đó, khi tiến hành khảo sát độ lặp lại (4 lần) để xác định LOD của phương pháp, chúng tôi tiến hành khảo sát mẫu ở nồng độ 4mg/100ml.
Bảng 3.9: Xác định chiều cao của nhiễu đường nền (N) ở nồng độ
4mg/100ml:
STT Vị trí (phút) Giới hạn trên - dƣới
Chiều cao nhiễu
đƣờng nền Ghi chú
1 5,7 - 6,7 830 - 900 70 Phổ đồ:
4mg-lần 1
3 5,7 - 6,7 960 - 1030 70 Phổ đồ: 4mg-lần 2
4 8,7 - 9,7 960 - 1040 80
NTB (trung bình) 75
Bảng 3.10: Xác định độ lặp lại của chiều cao mẫu chuẩn (S) ở nồng độ
4mg/100ml: Lần 1 Lần 2 Lần 3 Lần 4 S 193,4 185,6 161,3 122,4 N 75 75 75 75 S/N 2,5787 2,4747 2,1507 1,6320 S/NTB(trung bình) 2,2090
Ta có: 2 < S/NTB< 3 đạt yêu cầu của phương pháp xác định LOD.
Giới hạn phát hiện của phương pháp: LOD = 4mg/100ml.
3.5.2. Tính giới hạn định lƣợng (LOQ):
Ta có: LOQ = (10.LOD)/3 = (10*4)/3 = 13,33mg/100ml.