Có nhiều cách để xác định LOD như: Dựa trên độ lệch chuẩn, đường chuẩn và tỉ lệ tính hiệu nhiễu nền.
Trong phần thực nghiệm này, chúng tôi xin chọn phương pháp xác định LOD dựa trên tỉ lệ chiều cao chất phân tích trên tính hiệu nhiễu nền.
Tiến hành phân tích các mẫu ở nồng độ thấp, mà ở đó còn có thể xuất hiện tín hiệu của chất phân tích. Số lần phân tích lặp lại 4 lần, xác định tỷ lệ tín hiệu chất phân tích chia cho nhiễu nền (S/N = Signal to noise ratio).
Trong đó:
- S: là chiều cao tín hiệu của chất phân tích. - N: là nhiễu đường nền.
Nhiễu đường nền được tính về hai phía của đường nền và tốt nhất là tính nhiễu lân cận hai bên của peak, bề rộng mỗi bên tối thiểu gấp 10 lần chiều rộng của peak tại nửa chiều cao. LOD được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 2 3 lần nhiễu đường nền, thông thường lấy: S/N =3.
Hình 1.5: Mô tả cách xác định LOD bằng cách tính S/N.
1.7.2. Giới hạn định lƣợng (LOQ)
1.7.2.1.Định nghĩa:
Giới hạn định lượng (LOQ) là nồng độ tối thiểu của một chất có trong mẫu thử mà ta có thể định lượng được bằng phương pháp khảo sát và cho kết
quả có độ chụm như mong muốn. LOQ chỉ áp dụng đối với các phương pháp định lượng.
Giống như LOD, có nhiều cách khác nhau để xác định LOQ, phụ thuộc vào từng phương pháp cụ thể mà lựa chọn cho phù hợp.
Việc xác định LOQ cần tính đến các yếu tố ảnh hưởng trong mẫu phân tích, do đó cần thực hiện trên nền mẫu thật. LOQ trong nhiều trường hợp có thể là điểm thấp nhất của khoảng tuyến tính.
Hình 1.6: Mô tả mối quan hệ giữa LOD, LOQ và khoảng tuyến tính.
1.7.2.2.Cách xác định:
Cũng có nhiều cách để xác định LOQ. Trong đề tài này, chúng tôi cũng chọn phương pháp xác định LOQ dựa trên tỉ lệ chất phân tích trên tính hiệu nhiễu đường nền.
LOQ được chấp nhận tại nồng độ mà tại đó tín hiệu lớn gấp 10 20 lần nhiễu đường nền, thông thường thường lấy: LOQ = S/N = 10
Trong thực nghiệm, LOQ được tính thông qua LOD như sau:
1.8. Phƣơng pháp khảo sát độ lặp lại [4], [6]
- Khi chọn thiết bị và xây dựng phương pháp để phân tích thì chúng ta cần khảo sát nhiều yếu tố như: Độ lặp lại, độ tái lặp, độ ổn định, độ đúng, … của quy trình và thiết bị phân tích để xác định các điều kiện tối ưu.
- Xác định độ lặp lại nhằm mục đính đánh giá độ chính xác của qui trình khi thực hiện trong cùng điều kiện về thiết bị, phòng thí nghiệm, con người trong một khoảng thời gian ngắn.
- Trong giới hạn của đề tài, chúng tôi chỉ khảo sát độ lặp lại (độ ổn định) của thiết bị và độ lặp lại của phương pháp trên hai nền mẫu là: Mẫu chuẩn và mẫu thử, tính toán kết quả theo công thức sau:
Ta có:
SD
RSD = SD/x RSD%= (SD/x)*100 Trong đó:
- xi : Kết quả phân tích của mỗi lần thực nghiệm. - x : Kết quả trung bình.
- n : Số lần thực nghiệm. - SD : Độ lệch chuẩn.
- RSD: Độ lệch chuẩn tương đối (độ lặp lại).
* Theo quy định của nhiều tổ chức châu Âu thì RSD% (thiết bị) <= ± 2%; RSD% (phương pháp) <= ± 15% cho tất cả các nồng độ, riêng ở nồng độ LOQ có thể chấp nhận giới hạn ± 20%.
1.9. Phƣơng pháp khảo sát hiệu suất thu hồi [4], [6]
* Để đánh giá một phương pháp, người ta thường xác định độ đúng của nó. Độ đúng của phương pháp là khái niệm chỉ mức độ gần nhau giữa kết quả
1 ) ( 1 2 n x x n i i
thử nghiệm và giá trị thực. Có nhiều cách xác định độ đúng: So sánh kết quả với phương pháp đối chiếu, sử dụng mẫu đã biết trước hàm lượng hoặc xác định độ thu hồi (độ tìm lại hay hiệu suất thu hồi).
Tuy nhiên, trong nhiều trường hợp không thể tìm hoặc áp dụng một phương pháp tiêu chuẩn khác để so sánh kết quả, cũng như không thể dễ dàng có được các mẫu chuẩn hoặc mẫu chuẩn được chứng nhận phù hợp với phương pháp. Do đó, độ đúng có thể thực hiện thông qua việc xác định đô thu hồi (hiệu suất thu hồi) của phương pháp.
* Phương pháp xác định hiệu suất thu hồi: Thêm chất chuẩn vào mẫu (mẫu thử hoặc mẫu trắng), phân tích các mẫu thêm chuẩn đó, làm lặp lại tối thiểu bốn lần bằng phương pháp khảo sát, tính hiệu suất thu hồi theo công thức sau:
H (%) = 100 * Cm+c – Cm Cc Trong đó:
- Cm: Nồng độ chất phân tích trong mẫu ban đầu (nếu mẫu trắng thì Cm = 0).
- Cc: Nồng độ chất chuẩn thêm vào.
- Cm+c: Nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn.
Trong thực nghiệm, chúng ta thường thêm chất chuẩn ở ba mức nồng độ là thấp, trung bình và cao, sao cho nồng độ chất phân tích trong mẫu thêm chuẩn nằm trong khoảng nồng độ làm việc (khoảng tuyến tính).
CHƢƠNG 2: PHƢƠNG PHÁP VÀ THỰC NGHIỆM 2.1. Dụng cụ và thiết bị nghiên cứu
2.1.1. Dụng cụ
- Kim tiêm, ống nghiệm đểthu và bảo quản mẫu. - Pipet vạch: 1ml; 2ml; 5ml; 10ml; 25ml.
- Micropipet: 1-100µl; 100-1000µl; 1000-5000µl.
- Bình định mức: 25ml; 50ml; 100ml; 200ml; 500ml; 1000ml.
- Các dụng cụ thủy tinh cần thiết khác: Becher, erlen, ống đong, …..
2.1.2. Thiết bị:
- Cân phân tích, có độ chính xác 0,0001g. - Máy lắc Voxtec.
- Máy ly tâm, tốc độ tối đa: 6000 vòng/phút. - Máy sắc ký khí (GC-FID; Bruker-456).
- Hệ thống tiêm mẫu tự động (Autosampler 8400). - Tủ lạnh bảo quản mẫu.
- Máy xét nghiệm sinh hóa.
2.2. Hóa chất
- Ethanol (C2H5OH 99,99%). - Propanol (C3H7OH 99%).
- Natri tungstat dyhydrate (Na2WO4.2H2O 99%). - Axit sulfuric (H2SO496-98%).
- Nước cất.
- Một số hóa chất cần thiết khác.
Các hóa chất và nước cất thuộc loại tinh khiết phân tích hoặc tinh khiết hóa học.
2.3. Các bƣớc tiến hành nghiên cứu, khảo sát bằng máy sắc ký khí 2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu: 2.3.1. Chuẩn bị hóa chất và mẫu máu:
2.3.1.1. Dung dịch natri tungstat: 120g/l:
Lấy 13,6072g Na2WO4.2H2O 99% (m=329,86 g/mol) hòa tan trong nước và định mức đến 100ml.
2.3.1.2. Dung dịch axit sulfuric 5%:
Lấy 5,15ml H2SO4 (96-98%) cho vào bình định mức 100 ml có sẵn nước cất và định mức đến vạch.
2.3.1.3. Dung dịch propanol 0,25g/l:
+ Pha dung dịch propanol 10g/l: Dùng micropipet hút chính xác 1,26ml propanol 99% (d=0,803 g/ml) cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
+ Pha dung dịch propanol 0,25g/l: Hút chính xác 2,50ml propanol 10g/l cho vào bình định mức 100 ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
2.3.1.4. Các dung dịch ethanol:
+ Pha dung dịch 10g/l: Dùng micropipet hút 2,532ml ethanol 99,99% (d = 0,790g/ml) cho vào bình định mức 200ml và định mức bằng nước cất đến vạch.
+ Từ dung dịch trên ta chuẩn bị các dung dịch: 30mg/100ml, 50mg/100ml; 100mg/100ml; 200mg/100ml; 300mg/100ml và 400mg/100ml để dựng đường chuẩn.
+ Các dung dịch dùng để khảo sát giới hạn phát hiện, giới hạn định lượng, độ lặp lại và hiệu suất thu hồi.
2.3.1.5. Dung dịch máu có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu:
Lấy 2,5ml ethanol 1000mg/100ml cho vào bình định mức 25ml và định mức bằng máu (máu tươi không có cồn, được thu sau 5 ngày không có sử dụng rượu, bia hoặc đồ uống có cồn) đến vạch, lắc đều.
2.3.2. Chuẩn bị mẫu:
2.3.2.1. Chuẩn bị mẫu thử:
- Bước 1: Lấy 0,2ml máu cho vào ống nghiệm. - Bước 2: Cho thêm vào 1,8ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6:Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2- 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Tách lớp chất lỏng ở trên. Ta thu được dung dịch mẫu thử.
2.3.2.2. Chuẩn bị mẫu thêm chuẩn:
- Bước 1: Lấy 0,2ml máu, thêm 0,2ml chuẩn ethanol ….mg/100ml cho vào ống nghiệm.
- Bước 2: Cho thêm vào 1,6ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6: Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2 - 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Tách lớp chất lỏng ở trên. Ta thu được dung dịch mẫu thử.
2.3.2.3. Chuẩn bị mẫu chuẩn:
Từ các dung dịch chuẩn gốc ethanol ở các nồng độ 30mg/100ml; 50mg/100ml; 100mg/100ml; 200mg/100ml; 300mg/100ml và 400mg/100ml, quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn tương tự như chuẩn bị mẫu thử, nhưng chỉ thay
0,2ml máu bằng 0,2ml chuẩn tương ứng. Cụ thể, quy trình chuẩn bị mẫu chuẩn như sau:
- Bước 1: Lấy 0,2ml chuẩn ethanol …. mg/100ml cho vào ống nghiệm. - Bước 2: Cho thêm vào 1,8ml nước cất.
- Bước 3: Thêm 2ml dung dịch nội chuẩn propanol 0,25g/l. - Bước 4: Lắc đều.
- Bước 5: Cho vào 0,3ml dung dịch natri tungstat 120g/l. - Bước 6: Thêm 0,2ml dung dịch axit sulfuric 5%.
- Bước 7: Lắc Voxtec trong vòng 2 - 3 phút.
- Bước 8: Ly tâm với tốc độ 3000 vòng/phút trong vòng 3 phút. - Bước 9: Ta thu được dung dịch mẫu chuẩn.
2.3.2.4. Chuẩn bị mẫu trắng:
Quy trình chuẩn bị mẫu trắng tương tự như chuẩn bị mẫu thử (tiểu mục 2.3.2.1) nhưng chỉ thay 0,2ml máu bằng 0,2ml nước cất.
2.3.3. Thiết bị, điều kiện phân tích và trình tự tiêm mẫu [7]
2.3.3.1. Thiết bị phân tích:
- Sắc ký khí gắn đầu dò ion hóa ngọn lửa (GC-FID, Bruker - 456). - Cột mao quản: Supelcowax-10 (30m x 0,32mm x 0,25µm). - Hệ thống tiêm mẫu tự động: Autosampler 8400.
2.3.3.2. Điều kiện phân tích:
- Nhiệt độ buồng tiêm (injector): 200oC. - Chế độ tiêm: Chia dòng (1:20).
- Dòng qua cột: 1,13 ml/phút. - Chương trình nhiệt độ:
STT Tốc độ (oC /min) Nhiệt độ cuối (oC) Thời gian giữ (min)
1 - 40,00 5,00
- Nhiệt độ dectertor : 250oC.
- Tổng thời gian chương trình :15,00 min. - Thể tích tiêm mẫu: 1µL.
2.3.3.3. Trình tự tiêm mẫu:
Máy sau khi được cài đặt theo đúng điều kiện phân tích như trên. Trình tự tiêm mẫu được thực hiện như sau:
- Mẫu trắng.
- Mẫu chuẩn theo trình tự từ thấp đến cao (30mg → 400mg/100ml). - Mẫu thử.
CHƢƠNG 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1. Khảo sát các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn 3.1.1. Xây dựng đƣờng chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1):
Quy trình xử lý mẫu chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.2.3) giống như quy trình xử lý mẫu thử, chỉ khác ở bước 1 là thay 0,2ml máu bằng 0,2ml chuẩn ethanol ở các nồng độ 30/50/100/200/300/400mg/100ml. Tiến hành phân tích, ta có dữ liệu ở bảng (3.1).
Bảng 3.1: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP 1:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6 Sc 43,7 115,9 359,4 727,9 964,4 1648,5
Snc 732,3 1002,4 1392,9 1306,7 1096,4 1397,9
Sc/Snc 0,0596 0,1156 0,2580 0,5571 0,8796 1,1793
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.1: Đường chuẩn theo PP 1
y = 0,0030x - 0,0393 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 50 100 150 200 250 300 350 400 450 Sc/Snc C (mg/100ml)
3.1.2. Xây dựng đƣờng chuẩn trên nền mẫu trắng (PP 2):
Xây dựng đường chuẩn bằng phương pháp thêm chuẩn vào mẫu trắng, quy trình xử lý mẫu chuẩn giống như quy trình xử lý mẫu thêm chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.2.2)
- Nguồn gốc mẫu trắng: Thu trên cơ thể của bản thân, thu sau 5 ngày không sử dụng rượu bia hoặc thức uống có cồn.
- Tiến hành phân tích các mẫu, ta có dữ liệu ở bảng (3.2).
Bảng 3.2: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP2:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6
Sc 45 128,9 309,1 642,6 1103,2 1349,3
Snc 758,4 1247,4 1144,6 1111,1 1221,4 1127,3
Sc/Snc 0,0593 0,1033 0,2701 0,5783 0,9032 1,1969
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.2: Đường chuẩn theo PP2
y = 0,0031x - 0,0419 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400 500 Sc/Snc C
3.1.3. Xây dựng đƣờng chuẩn với chuẩn tinh khiết, không xử lý mẫu chuẩn (PP3):
Mục đích của phương pháp này là đơn giản quy trình xử lý mẫu và so sánh kết quả với hai phương pháp trên.
Quy trình xử lý mẫu của phương pháp này khác với PP 1 ở bước 2 (thêm 2,3ml nước) và bỏ qua bước 5, 6 (không thêm 0,3ml natri tungstat và 0,2ml axit sulfuric). Tiến hành phân tích các mẫu, ta có dữ liệu ở bảng (3.3).
Bảng 3.3: Mối tương quan giữa nồng độ (C) và tỉ lệ diện tích (Sc/Snc)
các điểm chuẩn theo PP3:
Điểm 1 Điểm 2 Điểm 3 Điểm 4 Điểm 5 Điểm 6
Sc 56 93,9 287,6 265,1 541,7 444,1
Snc 911,2 743,2 1031,1 470,5 606,4 379,1
Sc/Snc 0,0615 0,1263 0,2789 0,5634 0,8933 1,1715
C (mg/100ml) 30 50 100 200 300 400
- Từ bảng dữ liệu trên ta vẽ đồ thị nồng độ C theo tỷ số Sc/Snc có
dạng:
Hình 3.3: Đường chuẩn theo PP 3
y = 0,0030x - 0,0245 R² = 0,9997 0 0.2 0.4 0.6 0.8 1 1.2 1.4 0 100 200 300 400 500 C (mg/100ml) Sc / Snc
* Từ 3 đồ thị trên ta có phƣơng trình đƣờng chuẩn có dạng:
y = ax + b
Từ các phương trình đường chuẩn trên ta tính được nồng độ ethanol trong máu (x) từ tỉ lệ diện tích peak ethanol/propanol (y) của mẫu thử:
x = (y - b)/a
Trong đó: y: tỷ lệ diện tích peak chất chuẩn/nội chuẩn (Sc/Snc). x: nồng độ ethanol (mg/100ml).
3.1.4. So sánh kết quả các phƣơng pháp xây dựng đƣờng chuẩn
Để có cơ sở so sánh độ đúng của 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn nêu trên, chúng tôi tiến hành xử lý mẫu máu có nồng độ đã biết trước (ký hiệu M1) và mẫu máu chưa biết nồng độ (ký hiệu M2).
- Mẫu máu ký hiệu M1 có nồng độ 100mg ethanol/100ml máu, là mẫu trắng thêm chuẩn (trình bày ở tiểu mục 2.3.1.5).
- Mẫu máu ký hiệu M2 là mẫu do khách hàng gửi.
Bảng 3.4: Tỉ lệ diện tích peak và nồng độ của các mẫu M1 và M2 tính theo
3 phương pháp xây dựng đường chuẩn:
Mẫu M1 Mẫu M1’ Mẫu M2 Mẫu M2’
Sm 309,4 281 694,6 536,1 Snc 1215,8 1060,2 1037,7 774,9 Sm/Snc 0,2545 0,2650 0,6694 0,6918 Sm/Snc (trung bình) M1-TB = 0,2598 M2-TB = 0,6806 CPP 1 (mg/100ml) 99,70 / 100 239,97 CPP 2 (mg/100ml) 97,32 / 100 233,06 CPP 3 (mg/100ml) 94,77 / 100 235,03
Nhận xét: Qua kết quả khảo sát 3 phương pháp xây dựng đường chuẩn
(PP 1; PP 2; PP 3), thuận lợi và khó khăn của quy trình xử lý chuẩn, chúng tôi xin chọn phương pháp xây dựng đường chuẩn với chuẩn tinh khiết (PP 1) để đem so sánh kết quả với phương pháp một điểm chuẩn và tính các kết quả thực nghiệm ở phần sau.
3.2. Khảo sát phƣơng pháp một điểm chuẩn
Trong phần này, chúng tôi lấy tỉ lệ diện tích Sc/Snc của các điểm chuẩn
ở nồng độ 50; 100; 200; 300; 400mg/100ml của PP 1 để tính kết quả nồng
độ của mẫu thử CM2-TB và so sánh kết quả với phương pháp đường chuẩn. Tính phần trăm độ sai lệch của hai phương pháp theo phương trình sau:
Độ sai lệch (%) = |CPPĐC - CPP1ĐC|*100 CPPĐC
Với: CPPĐC và CPP1ĐC là nồng độ mẫu thử tính theo phương pháp đường chuẩn và phương pháp một điểm chuẩn.
Bảng 3.5: Kết quả nồng độ mẫu CM2-TBvà độ sai lệch giữa phương pháp
đường chuẩn (PP1) và phương pháp một điểm chuẩn:
Tên mẫu PP 1 Điểm 50
(mg/100ml) Điểm 100 (mg/100ml) Điểm 200 (mg/100ml) Điểm 300 (mg/100ml) Điểm 400 (mg/100ml) CM2-TB (mg/100ml) 239,9 7 294,38 263,80 244,34 232,13 230,85 Độ sai lệch (%) 22,67 9,93 1,82 3,28 3,80