3. Ý nghĩa khoa học và thực tiễn của ựề tài
2.5.4. Phương pháp RT-PCR phát hiện virus cúm gia cầm
* Phản ứng RT-PCR
Dùng ựể giám sát sự lưu hành của virus cúm A/H5N1 trên vịt ở các huyện nghiên cứụ
* Nguyên liệu
- Mẫu swab.
- Nước cất vô trùng (RNase free). - Quiagenệbuffer RLT có β-MẸ - Cồn Ethanol 70%.
- RNA ựối chứng dương tắnh M, H5 và H7. - Kắt chiết tách Qiagenệ RNeasy Mini Kit.
- Kắt RT/PCR One-Step RT/PCR với Platinium taq DNA polymerasẹ - Primer và probe cho H5N1
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 34 - RNase Inhibitor (13.3 units/ộl); MgCl2; ựệm TE PH 8.0, 1 x.
- β-Mercaptoethanol (β-ME). * Chiết tách ARN tổng số
Tách chiết ARN tổng số từ mẫu dịch ngoáy (swab) bằng Qiagenệ RNeasy Mini Kit. Các bước cụ thể như sau:
- Lắc mạnh (bằng máy Vortex) ống chứa dịch ngoáy và chuyển lượng 500ộl sang ống ly tâm nhỏ và ghi ký hiệu mẫụ
- Cho 500ộl Qiagenệ buffer RLT có β-ME vào ống ly tâm trên. Lắc ựều trên máy Vortex.
- Ly tâm (bằng máy Spindown) ựể dịch bệnh phẩm ựọng trên nắp trôi xuống ựáy ống. Cho 500ộl cồn ETOH 70% (ethanol), lắc mạnh bằng Vortex. Ly tâm mẫu ựã bị dung giải trong 5 phút, tốc ựộ 5000xg ở nhiệt ựộ phòng.
- Chuyển tất cả dịch nổi chứa mẫu bị dung giải sang cột RNeasyệQiagen ựã ghi sẵn ký hiệu mẫụ Ly tâm trong 15 giây tốc ựộ ≥ 8000xg ở nhiệt ựộ phòng. Kiểm tra dịch mẫu ựã thấm qua cột lọc chưạ Lặp lại bước này cho toàn bộ mẫu ựã qua cột lọc.
Ngoài ra có thể dùng ống hút Quivacệ ựể hút dịch mẫu và rửa thông qua cột thu mẫụ Phương pháp này làm tăng hiệu quả và không phải ly tâm cột lọc.
- Bổ sung 700ộl dung dịch rửa 1 (RW1 buffer) vào cột RNeasyệQiagen, ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000 xg, thay ống thu mẫu mới (collection tube) vào cột lọc.
- Cho 500ộl RPE buffer vào cột RNeasy và ly tâm trong 15 giây ở tốc ựộ ≥ 8000xg, thay ống thu mẫu mới vào cột lọc.
- Lặp lại bước trên 2 lần với dung dịch rửa RPE buffer. Sau lần rửa cuối cùng thay ống thu mẫu mới loại 2ml vào cột lọc.
- Ly tâm cột lọc trống không trong 2 phút ở tốc ựộ tối ựa (khoảng 72.000 vòng/giây), bỏ ống thu mẫụ
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 35 - đặt cột lọc vào ống thu hoạch hoặc ống 1,5 ml ựã ựược ghi sẵn ký hiệu mẫụ Cho 50ộl RNase free vào cột lọc. Chú ý không ựược chạm ựầu pipet vào mặt thạch Silica trong cột lọc. Ủ ở nhiệt ựộ phòng trong ắt nhất 1 phút. Tách ARN bằng cách ly tâm cột trong 1 phút ở 60.000 vòng/giâỵ Bỏ cột lọc RNeasyệ.
- Bảo quản mẫu ARN thu ựược ở 4oC trong thời gian ngắn trước khi làm RT-PCR, nếu sau 24 giờ, mẫu nên bảo quản ở -20oC hoặc nhiệt ựộ thấp hơn.
* Thực hiện phản ứng RT-PCR
- Primer và probe:
Bảng 2.1. Primer và probe ựặc hiệu cho virus cúm A/H5N1 Gen Primer/ Probe Chuỗi nucleotide (5Ỗ-3Ỗ) đầu 5Ỗ đầu 3Ỗ
M Probe TGCAGTCCTCGCTCACTGGGCACG FAM BHQ1
Xuôi CATGGARTGGCTAAAGACAAGACC
Ngược AGGGCATTTTGGACAAAKCGTCTA
H5 Probe TCAACAGTGGCGAGTTCCCTAGCA HEX BHQ1
Xuôi ACGTATGACTACCCGCAGTATTCA
Ngược AGACCAGCTACCATGATTGC
N1 Probe TGGTCTTGGCCAGACGGTGC FAM BHQ1
Xuôi TGGACTAGTGGGAGCAGCAT
Học viện Nông nghiệp Việt Nam Ờ Luận văn Thạc sỹ Khoa học Nông nghiệp Page 36
- Chuẩn bị Master mix theo thành phần ở bảng 2.2
Bảng 2.2. Thành phần phản ứng
Nguyên liệu Lượng (ộl)
Nước cất 4.5 2x Reaction buffer 12.5 MgCl2 (50mM) 1 Primer (xuôi) 0.5 Primer (ngược) 0.5 Probe 0.5 Enzyme mix 0.5 Tổng 20
+ Cho 20 ộl Master mix vào ống PCR. + Cho 5 ộl mẫu RNA vào ống PCR. + đặt ống PCR vào máy RT - PCR. + Chạy chương trình.
+ Chọn ựọc màu ở bước kéo dàị - Chu trình nhiệt:
50oC Ờ 15 phút 95oC Ờ 2 phút
40 x (95oC Ờ 10 giây + 58oC Ờ 50 giây) - đọc kết quả:
Xét nghiệm ựược công nhận khi:
đối chứng dương tắnh cho giá trị Ct ựã biết (ổ2) đối chứng âm tắnh không có Ct
Mẫu ựược coi là dương tắnh khi có Ct ≤ 35 Mẫu ựược coi là âm tắnh nếu không có Ct Mẫu ựược coi là nghi ngờ nếu Ct >35