- Phản ứng với dung dịch kiềm: Dung dịch mẫu thử đ-ợc pha nh- trên. Chia dung dịch
mẫu vào 2 ống nghiệm: một ống đối chứng, ống kia thêm vài giọt NaOH 10%. Phản ứng d- ơng tính khi xuất hiện màu vàng, vàng cam.
- Phản ứng với FeCl3: Nhỏ dung dịch FeCl3 trong HC1 0,5N vào ống nghiệm đựng mẫu
thử đ-ợc pha loãng bằng ethanol 96%. Phản ứng có kết quả d-ơng tính khi dung dịch có màu lục, tía, lam, xanh đen hay đen.
2.2.2.1.4.Định tính glycoside Phản ứng Keller-Killian:
Thuốc thử Keller-Killian:
Dung dịch A: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid acetic 10%. Dung dịch B: thêm 0,5ml dung dịch FeCl3 5% vào 50ml acid sunfuric đặc.
Ph- ơng pháp: Cho cặn dịch chiết vào ống nghiệm. Thêm lml dung dịch A lắc cho tan hết, nghiêng ống nghiệm từ từ cho dung dịch B vào. Phản ứng d- ơng tính khi xuất hiện vòng nâu đỏ giữa 2 lớp chất lỏng.
Mẫu thử đ- ợc pha trong dung dịch acid acetic 2% với một 1- ợng thích hợp để làm các phản ứng.
Phản ứng với thuốc thử Bouchardat (hỗn hợp KI và I2 trong dung dịch HC1): Phản
ứng cho kết tủa màu nâu sẫm.
Phản ứng với thuốc thử Vans-Mayer (hỗn hợp HgCl2 và KI trong n- ớc): Phản ứng
cho kết tủa màu trắng ánh vàng.
Phản ứng với thuốc thử Dragendroff (hỗn hợp Bi(N03)3 )và KI trong dung dịch acid acetic): Phản ứng cho màu vàng da cam đến đỏ.
2.2.22. Định ỉ-ợng hợp chất polyphenol tổng số theo ph-ơng pháp Folin - Cỉocalteau 'Xây dựng ả- ờng chuẩn acid gallic Hóa chất:
+ Dung dịch gốc acid gallic nồng độ 5000 mg/1 gồm: 0,5 g acid gallic + 10 ml ethanol + 90 ml H20.
+ Dung dịch Na2C03 20%, dung dịch thuốc thử Folin - Ciocalteau. Tiến hành:
+ Pha loãng dung dịch acid gallic theo cốc nồng độ 0, 50, 100, 150, 250, 500 mg/1.
+ Chuẩn bị 6 cốc định 1- ợng đánh số từ 1 đến 6, lần 1- ợt mỗi cốc cho
20ml dung dịch acid gallic với các nồng độ nêu trên + 1,58 ml H20 + 100 ml thuốc thử
Folin - Ciocalteau. Sau 5 phút cho thêm 300 ml dung dịch Na2C03. Để hỗn hợp phản
ứng trong 2 giờ ở 20°c rồi đo OD b- ớc súng 765 nm .
+ Dụng đường chuân acid gallic.
mg/1 acid gallic OD765 nm 1 0 0,009 2 50 0,060 3 100 0,115 4 150 0,168 5 250 0,263 6 500 0,519
Kết quả xây dựng đ- ờng chuẩn acid gallic
- Định ỉ- ợng polyphenol tổng số
Cân 10 mg mẫu thử thuộc mỗi phân đoạn dịch chiết hoà tan trong 1 ml ethanol 80%, bổ sung thêm n- ớc cất vào cho đủ 10 ml dung dịch để thu đ- ợc dung dịch gốc có nồng độ chất tan là 10.000 mg/1. Lấy 1 ml dung dịch gốc hòa với 9 ml n- ớc cất thu đ- ợc dung dịch cao có nồng độ 1000 mgA.
Tiến hành thử nghiệm t- ơng tự nh- đối với dung dịch acid gallic, xác định giá trị OD, từ đó tính nồng độ polyphenol trong dung dịch và thành phần phần trăm về khồi 1- ợng polyphenol trong mỗi phân đoạn dịch chiết.
Theo đó:
Hàm 1- ợng polyphenol trong dung dịch = 1000.( OD - 0,0128) (mg/1)
2.2.2.3. Phân tích thành phần các hợp chất tự nhiên bằng sắc ký lớp mỏng Chúng tôi
tiến hành sắc ký trên bản mỏng tráng sẵn silicagel Merck
Alufolien 60 F254. Hệ dung môi chạy sắc ký là TEAF: 5:3:1:1 (toluen - ethylaxetat - acetone - acid formic), Hiện màu bằng dung dịch H2S0410%, Xác định hệ số Rf theo
công thức: Rf = a/b
- a: Khoảng di chuyển của chất nghiên cứu - b: Khoảng di chuyển của dung môi