B io te chno log yandB iop ro ce s sEng inee r ing20 :389 -395(2015 ) DO I10 1007 / s12257 -014 -0799 -5 RESEARCHPAPER E v a lu a t i ono fFun g a lL a c t i cA c idA c cumu l a t i onU s in gG l y c e r o la sth e S o l eC a rb onS ou r c e X i a oq in gW an g ,Zh enhu a Ru an ,W eb s t e r Gu an ,R ob e r tK r a em e r ,Y u anZh on g ,and Y anL iu R e c e i v e d :1 6N o v em b e r2 4/R e v i s e d :2 8M a r c h2 5/ A c c e p t e d :1 A p r i l2 ©T h eK o r e a nS o c i e t yf o rB i o t e c h n o l o g ya n dB i o e n g i n e e r i n ga n dS p r i n g e r2 d u et oi t sa b u n d a n c ea n dr e l a t i v e l yc h e a pp r i c er e s u l t i n g f r omt h er a p i dg r ow t ho ft h eb i o d i e s e li n d u s t r y[ , ] C om p a r e d t o t h ec h em i c a la n d t h e rm a lp r o c e s s e so fg l y c e r o l u t i l i z a t i o n ,m i c r o b i a lf e rm e n t a t i o np r o v i d e sa ne n v i r o n m e n t a l l yf r i e n d l ya p p r o a c ht oc o n v e r tg l y c e r o li n t ov a l u e a d d e dp r o d u c t s M a n ym i c r o o r g a n i sm sa r ea b l e t om e t a b o l i z e g l y c e r o la sp a r to ff i n ec h em i c a lp r o d u c t i o np r o c e s s e s ,s u c h a s1 , p r o p a n e d i o lp r o d u c t i o nf r omC l o s t r i d i umB u t y r i c um a n dK l e b s i e l l aP n e um o n i a e,d i h y d r o x y a c e t o n ef r omG l u c o n o b a c t e ro x y d a n s ,a n dK l e b s i e l l ap n e um o n i a e,s u c c i n i c a c i df r omA n a e r o b i o s p i r i l l ums u c c i n i c i p r o d u c e n s ,h y d r o g e n f r omE n t e r o b a c t e rA e r o g e n e s, a n dD l a c t i ca c i df r om E s c h e r i c h i ac o l i[ ] H ow e v e r ,l im i t e di n f o rm a t i o ni s a v a i l a b l ea b o u tt h eg l y c e r o lu t i l i z a t i o no ff i l am e n t o u sf u n g i [ ] T h ef i l am e n t o u sf u n g u sR h i z o p u so r y z a ew a ss e l e c t e d t oi n v e s t i g a t ef u n g a lg l y c e r o lu t i l i z a t i o nf o rl a c t i ca c i d a c c um u l a t i o n L a c t i ca c i dh a sb e e nw i d e l yu s e di nt h ef o o di n d u s t r ya s a na c i d u l a n t ,f l a v o r i n g ,a n dp r e s e r v a t i v e[ ] O v e rt h ep a s t t e ny e a r s ,e c o l o g i c a lc o n c e r n sh a v ed r i v e ni t su s ea sa u b s t r a t ei nt h ep r o d u c t i o no ft h eb i o d e g r a d a b l ep l a s t i c K e yw o rd s :R h i z o p u so r y z a e , l a c t i ca c i d ,g l y c e r o l ,p y r u v a t e s p o l y l a c t i ca c i d ,w h i c hr e q u i r e sah i g h l yp u r i f i e d ,p r e f e r a b l y L (+ ) l a c t i ca c i da n h y d r o u sm o n om e r[ ] C om p a r e dt ot h e b a c t e r i a ls y n t h e s i so fl a c t i ca c i di s om e r s ,t h ef u n g u s In t r odu c t i on R o r y z a ei sa b l et os y n t h e s i z eo p t i c a l l yp u r eL (+ ) l a c t i c c i di nr e l a t i v e l ys im p l em e d i a[ ] V a r i o u sc a r b o ns o u r c e s G l y c e r o lh a sr e c e n t l yg a i n e ds i g n i f i c a n ta t t e n t i o na sa n a u c ss t a r c n dp e n t o s eh a v eb e e ns t u d i e df o rt h e i r a t t r a c t i v ef e e d s t o c kf o rv a l u e a d d e dc h em i c a lp r o d u c t i o n s e f f e c t so n l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yR o r y z a e[ ] H ow e v e r , l i m i t e d i n f o r m a t i o n i s a v a i l a b l e r e g a r d i n g g l y c e r o l u t i l i z a t i o n X i a o q i n gW a n g ,Z h e n h u aR u a n ,R o b e r tK r a em e r ,Y u a nZ h o n g ,Y a nL i u* b y R o r y z a e f o r l a c t i c a c i d p r o d u c t i o n B i o s y s t em sa n dA g r i c u l t u r a lE n g i n e e r i n g ,M i c h i g a nS t a t eU n i v e r s i t y ,E a s t L a n s i n g ,M I4 8 ,USA T h e r e f o r e ,t h eo b j e c t i v e so ft h i ss t u d yw e r et oi n v e s t i g a t e T e l :+ 7 ;F a x :+ 2 t h eg l y c e r o lc o n v e r s i o nt ol a c t i ca c i db yR o r y z a ea n dt o E -m a i l : l i u y a n 6@m s u e d u e v a l u a t et h em a i nf a c t o r st h a ti n f l u e n c et h ee f f i c i e n c yo f W e b s t e rG u a n l a c t i ca c i da c c um u l a t i o n C h em i c a lE n g i n e e r i n g ,C a l i f o r n i aI n s t i t u t eo fT e c h n o l o g y ,P a s a d e n a ,CA Ab s t r a c t T h i ss t u d yi n v e s t i g a t e dt h eg l y c e r o lu t i l i z a t i o n f o rl a c t i ca c i da c c um u l a t i o nb yt h ef i l am e n t o u sf u n g u s R h i z o p u so r y z a e9 3a n dc om p a r e d i tw i t h t h ec o n v e n t i o n a l c a r b o ns o u r c eg l u c o s e N ol a c t i ca c i da c c um u l a t e di nt h e o g l y c e r o lm e d i aa t3 C ,i nc o n t r a s tt ot h eg l u c o s em e d i a o I n c r e a s i n gt h et em p e r a t u r ef r om3 0t o3 Cl e dt oa6 3% d e c r e a s e i n t h ea v e r a g eg r ow t hr a t eo fR o r y z a ei ng l y c e r o l m e d i aa n da6 1%i n c r e a s ei nt h ea v e r a g ec e l lm a s sy i e l d , o a n dt h ec u l t u r e so ng l y c e r o lm e d i aa t3 Cw e r ea b l et o g e n e r a t e0 6g /Ll a c t i ca c i d W h i l e ,r a i s i n gt em p e r a t u r e s i g n i f i c a n t l y i n h i b i t e d l a c t i ca c i dp r o d u c t i o no ng l u c o s em e d i a M o r e o v e r ,s u p p l em e n t i n gc u l t u r e sw i t hs o d i ump y r u v a t e s i g n i f i c a n t l yim p r o v e dt h el a c t i ca c i ds y n t h e s i so fR o r y z a e o ng l y c e r o lm e d i a ,w i t hl a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o n sr e a c h i n g o o 3g /La t3 7Ca n d0 7g /La t3 0C ,r e s p e c t i v e l y O u r r e s u l t si n d i c a t et h a tg l y c e r o lu t i l i z a t i o nf o rl a c t i ca c i d a c c um u l a t i o nb yR h i z o p u ss p.i sl im i t e db yt h ea v a i l a b i l i t y o fi n t r a c e l l u l a rp y r u v a t e ,a n dc o n t r o l l i n gp y r u v a t ef l owi sa k e yt oe n h a n c i n gt h el a c t i ca c i da c c um u l a t i o n 1 ,USA 390 M a t e r i a l sand M e th od s Fun g a ls t r a inandsp o r ein o cu lump r ep a r a t i on T h eS t r a i nR h i z o p u so r y z a e NRRL3 5(A TCC9 ) , o b t a i n e df r omAm e r i c a nT y p eC u l t u r eC o l l e c t i o n(M a n a s s a s , VA ,USA ) ,w a sg r ow no np o t a t od e x t r o s ea g a t3 0oCf o r tw ow e e k s S p o r e sw e r ew a s h e da sd e s c r i b e dp r e v i o u s l y [ 1 ] ,a n d t h es p o r es o l u t i o nw a ss t o r e da tac o n c e n t r a t i o no f o 1× s p o r e s /mLa t4 C B io te chno log yandB iop ro ce s sEng inee r ing20 :389 -395(2015 ) LDH ,e l im i n a t i n gt h ee f f e c t so fo t h e re n z ym e si nt h ec r u d e e x t r a c ta n dp r o v i d i n gm o r ea c c u r a t ed a t a T h ef r e e z e d r i e dc e l lm a s sw a sg r o u n di nl i q u i dn i t r o g e n w i t m o r t a n dp e s t l e T h ec o l de x t r a c t i o ns o l u t i o n c o n t a i n i n g0 1m o l /Lb i s t r i s p r o p a n e( pH6 )a n d1mm o l /L d i t h i o t h r e i t o lw a sa d d e dt ot h ep ow d e r( : 1w / v )t od i s s o l v e t h es o l u b l ep r o t e i no ni c ef o r1h T h es u s p e n s i o nw a s c e n t r i f u g e da t1 , 0×ga t4 °Cf o r5m i n ,a n d t h es u p e r n a t a n t w a su s e da st h ec r u d ee n z ym ee x t r a c t[ , ] R e d u c t i v e l a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s e(LDH )a c t i v i t y(LDHi st h e e n z ym et h a tc a t a l y z e st h ec o n v e r s i o no fp y r u v a t et ol a c t i c a c i d )w a sd e t e rm i n e db yt h et o t a lam o u n to fl a c t i ca c i d g e n e r a t e df r oms o d i ump y r u v a t ei nt h ef o l l ow i n gr e a c t i o n s y s t em :a1 mLr e a c t i o nm i x t u r ec o n s i s t e f0 1m o l /L b i s t r i s p r o p a n eb u f f e r( pH6 )w i t h2 mm o l /L NADH a n d4 0mm o l /Ls o d i ump y r u v a t e R e a c t i o nm i x t u r e sw i t h o u t c r u d ee n z ym ee x t r a c t so rw i t h o u ts u b s t r a t e sw e r eu s e da s c o n t r o l s T h er e a c t i o nw a ss t a r t e db ya d d i n g0 2mLc r u d e o e n z ym ee x t r a c t s ,i n c u b a t e da t3 0Cf o r5 m i n ,a n dt h e n o t e rm i n a t e db y2 0m i ni n c u b a t i o ni na1 0 Cw a t e rb a t h O n eu n i to fr e d u c t i v eLDHw a sd e f i n e da st h eam o u n to f e n z ym er e q u i r e d t og e n e r a t e1µm o l l a c t i ca c i df r omp y r u v a t e p e rm i n u t e Cu l t i v a t i on 1g /L ) T h es a l t su s e df o rb a t c hc u l t u r ei n c l u d e : KH2PO4( (M a l l i n c k r o d tB a k k e r ) ;M gC l · 6H O( 5g /L )(M a l l i n c k r o d t 2 B a k k e r ) ;Z nSO4· 7H O( 4m g /L )(S i gm a ) ;M nSO4·H O 2 · 6H O( 6m g /L )(S i gm a ) ; ( 6m g /L )(S i gm a ) ;C oC l 2 F eSO4· 7H O( 7m g /L )(S i gm a ) T h es o l en i t r o g e ns o u r c e f o l le x p e r im e n t sw a s1g /L NH C l(S i gm a ) G l u c o s e (S i gm a )a n dg l y c e r o lw e r eu s e da sc a r b o ns o u r c e s ,w i t h i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so f1 ,3 ,5 ,a n d7 0g /L T oi n i t i a t e t h ec u l t u r e ,0 mLs p o r es o l u t i o nw a si n o c u l a t e di n t o 0mLE r l e nm e y e rf l a s k sf i l l e dw i t h1 0 mLo fg r ow t h m e d i uma n dg r ow no nar o t a r ys h a k e r(T h e rm oS c i e n t i f i c ) w i t hs h a k i n ga t1 0r pma t3 0o r3 °C D u r i n gt h e c u l t i v a t i o n ,C aCO w a s a d d e d t o t h e b r o t h t o m a i n t a i n t h e C a l cu l a t i on so fk in e t i cp a r am e t e r s pHa ta p p r o x im a t e l y4~5 T h em a x im ums p e c i f i cg r ow t hr a t e(µmax)w a sd e t e rm i n e d An a l y t i c a lm e th od s f r omt h es l o p eo ft h es t r a i g h t l i n ep a r t( e x p o n e n t i a lp h a s e ) M y c e l i ac e l lm a s sw a sc o l l e c t e db yf i l t r a t i o n ,w a s h e dw i t h o ft h eg r ow t hc u r v eb yp l o t t i n gt h el o g a r i t hmo fc e l lm a s s 6m o l /L HC lt on e u t r a l i z et h ee x c e s sC aCO o n c e n t r a t i o nv e r s u sf e rm e n t a t i o nt im e C e l lm a s sy i e l d nt h ec e l l c 3i )w a sc a l c u l a t e da sg r am so fc e l lm a s so b t a i n e dp e r m a s s ,a n dt h e nw a s h e dw i t hd i s t i l l e dw a t e r T h ew a s h e d (Y x / s r amo fg l u c o s eo rg l y c e r o lc o n s um e da tt h ee n ft h e c e l lm a s sw a sd r i e da t9 5±0 °Co v e r n i g h tu n t i la g a t c hc u l t u r e[ ] c o n s t a n tw e i g h tw a sa c h i e v e d G l u c o s e ,g l y c e r o l ,e t h a n o l , b l a c t i ca c i da n t h e ro r g a n i ca c i d sw e r ed e t e c t e db yHPLC e q u i p p e dw i t B i o r a d Am i n e x HPX 7Ho r g a n i ca c i d c o l um na n dar e f r a c t i v ei n d e xd e t e c t o r[ ] T h em o b i l e R e su l t sandD i s cu s s i on p h a s ew a s5mm o l /Ls u l f u r i ca c i da taf l owr a t eo f0 6mL /m i n T h ec o l um nt em p e r a t u r ew a ss e tt o6 °C C omp a r i s ono fg r ow thk in e t i c sande x t r a c e l lu l a r m e t ab o l i t e so fR o r y z a e ATCC9 3g r ow in gong l y c e r o l R edu c t i v el a c t i ca c idd eh yd r o g en a s ea c t i v i t ya s s a y andg lu c o s ea t3 °C L a c t i cd e h y d r o g e n a s e(LDH )a c t i v i t y i s t r a d i t i o n a l l ya s s a y e d T oc om p a r et h eg r ow t n de x t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e so f a ta na b s o r b a n c eo f3 0nmt om o n i t o rt h ed e c r e a s ei n R o r y z a eA TCC9 3o ng l u c o s ea n dg l y c e r o lm e d i a , t h er e d u c e dn i c o t i n am i d ea d e n i n ed i n u c l e o t i d e(NADH ) s p o r e sw e r ed i r e c t l yc u l t i v a t e di nt h em e d i aw i t hv a r i o u s c o n c e n t r a t i o nd u r i n gt h er e a c t i o n[ ] O n eu n i t(U )o f i n i t i a lc o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ea n dg l y c e r o l( ,3 ,5 , e n z ym a t i ca c t i v i t yw a sd e f i n e da st h eam o u n to fe n z ym e a n d7 0g /L )a taf i x e dn i t r o g e nc o n c e n t r a t i o n( 1g /LNH C l ) + n e c e s s a r yt oc o n v e r t1µm o lo f NADHt oNAD h es p e c i f i cg r ow t hr a t e so f0 6/ hr p e rm i n T em a i n e dc o n s t a n ta s [ ] H ow e v e r , t h i sm e t h o d i sn o ts u i t a b l ef o n a l y z i n g t h e g l u c o s ec o n c e n t r a t i o nv a r i e d ,w h e r e a s t h eh i g h e s tc e l lm a s s a c t i v i t yo fc r u d ee n z ym ee x t r a c t s ,a so t h e ro x i d o r e d u c t a s e s y i e l d(Y )o f0 3g / gw a so b t a i n e da t t h e l ow e s tc o n c e n t r a t i o n x / s s u c sp y r u v a t ed e c a r b o x y l a s ea n da l c o h o ld e h y d r o g e n a s e o f1 0g /L(C ·N r a t i oo f1 8m o l /m o l )(F i g S 1Aa n d i nt h ee x t r a c t sm a ya l s oa f f e c tt h e NADHc o n c e n t r a t i o n T a b l e1 ) L a c t i ca c i da c c um u l a t i o ns t a r t e da t4 4ha n d a n di n t e r f e r ew i t ht h es p e c t r o p h o t om e t r i cr e a d i n g s[ ] p e a k e da t2 0g /La t8 9hw i t h t h e7 0g /Lg l u c o s ec o n c e n t r a t i o n T h e r e f o r e ,am o d i f i e dm e t h o dw a sd e v e l o p e dt od e f i n et h e (C /Nr a t i oo f1 8m o l /m o l )(F i g S 1E ) C om p a r e dw i t h LDHa c t i v i t yb a s e nl a c t i ca c i d ,t h es p e c i f i cp r o d u c to f g l u c o s ec u l t i v a t i o n ,g l y c e r o lc o n c e n t r a t i o ne x e r t e dd i f f e r e n t E va lua t iono fFunga lLa c t i cA c idA c cumu la t ionU s ing G l yce ro la stheSo leCa rbonSou r ce 391 * T ab l e1 G r ow t hk i n e t i c so fR o r y z a ei ng l y c e r o la n dg l u c o s em e d i aa t3 ºC G l y c e r o l C /N(m o l /m o l ) / h ) µmax( g / g ) Yx/s( 0g /L 0g /L 0g /L G l u c o s e 0g /L 2 0 0g /L 3 0g /L 0g /L 0 0g /L * D a t ap o i n t sr e p r e s e n t t h em e a n so f tw or e p l i c a t e s e f f e c t so nt h eg r ow t hr a t ea n dc e l lm a s sy i e l d(T a b l e1a n d F i g S 1C ) T h es p e c i f i cg r ow t hr a t e sr em a i n e da t0 / hf o r t h ec u l t u r e sw i t hg l y c e r o lc o n c e n t r a t i o n sa b o v e3 0g /L ,f i v e t im e sh i g h e rt h a nt h er a t eo f0 / hw i t h1 0g /L g l y c e r o l H ow e v e r ,t h eh i g h e s tc e l lm a s sy i e l d( 4g / g )w a so b t a i n e d w i t h1 0g /Lg l y c e r o l ,w h i c hm a yb ec a u s e db yt h el ow i n i t i a lC /Nr a t i o( 4m o l /m o l )i nt h ec u l t u r em e d i um T h eo v e r a l lc e l lm a s sy i e l d sw e r eh i g h e ro ng l y c e r o l t h a no ng l u c o s e ,a l t h o u g ht h eo v e r a l ls p e c i f i cg r ow t hr a t e s o ng l y c e r o lw e r ed r am a t i c a l l yl ow e rt h a nt h o s eo ng l u c o s e (T a b l e1 ) T h i sr e s u l tc a nb ei n t e r p r e t e db yc om p a r i n gt h e p r o d u c t so b t a i n e df r omtw oc a r b o ns o u r c e s I nc o n t r a s tt o g l u c o s ef e rm e n t a t i o n ,a lm o s tn oe x t r a c e l l u l a rm e t a b o l i t e s s u c sa c e t a t e ,f o rm a t e ,o rl a c t i ca c i dw e r ed e t e c t e di n g l y c e r o lc u l t u r e s T h i sm e a n st h a tt h em a j o r i t yo fg l y c e r o l w a su t i l i z e db yt h es t r a i nf o rp r o p a g a t i o n ,r e s u l t i n gi na h i g h e rc e l lm a s sy i e l d T od a t e ,l im i t e ds t u d i e sh a v eb e e nc o n d u c t e nt h e g l y c e r o lc o n v e r s i o nf o r l a c t i ca c i da c c um u l a t i o nb yR h i z o p u s s p ,a l t h o u g ht h e r ea r er e p o r t so ng l y c e r o lm e t a b o l i smb y b a c t e r i a[ ] ,y e a s t[ , ]a n ds om ef u n g i[ ] T h e s e s t u d i e sc o n c l u d e dt h a tt h e r ew e r etw om a i nm e t a b o l i c p a t hw a y so fg l y c e r o lu t i l i z a t i o n :1 )t h eg l y c e r o li sp h o s p h o r y l a t e db yg l y c e r o lk i n a s e t of o rmg l y c e r o l p h o s p h a t e (G -P ) ,a n dt h eG -Pi sd e h y d r o g e n a t e db yG -P d e h y d r o g e n a s e t of o rmd i h y d r o x y a c e t o n ep h o s p h a t e ;2 ) t h e g l y c e r o li sd e h y d r o g e n a t e db yg l y c e r o ld e h y d r o g e n a s e , f o l l ow e db yt h ep h o s p h o r y l a t i o no fd i h y d r o x y a c e t o n e B o t h p a t hw a y sa r ec o n n e c t e dt ot h ef o rm a t i o no fp y r u v a t ea n d m e r g e di n t ot h ec e n t r a lm e t a b o l i cp a t hw a y[ , , , ] T h e r e f o r e ,l a c t i ca c i dp r o d u c e db yR o r y z a ec u l t i v a t e n g l y c e r o lw a se x p e c t e dt ob es y n t h e s i z e df r omp y r u v a t eb y l a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s e(LDH ) ,s im i l a r l yt ot h eg l u c o s e p y r u v a t e l a c t i ca c i dp a t hw a y I n t e r e s t i n g l y ,t h ee x p e r im e n t a l d a t as h owt h a tn ol a c t i ca c i dw a sd e t e c t e di nt h eb r o t h w h e ng l y c e r o lw a su s e da st h es o l ec a r b o ns o u r c e T h i s r e s u l tm i g h tb eb e c a u s eg l y c e r o lh a sah i g h e rd e g r e eo f r e d u c t i o np e rc a r b o nt h a ng l u c o s e ,w i t ht h er e s u l tt h a tl a c t i c a c i da c c um u l a t i o nf r omg l y c e r o lm a yn o tb ep r e f e r r e d u n d e e r o b i cc o n d i t i o n s T h ea v e r a g ed e g r e e so fr e d u c t i o n p e rc a r b o ni ng l y c e r o l( κglycerol)a n dl a c t i ca c i d( κlacticacid) a r e4 7a n d4 ,r e s p e c t i v e l y[ , ] T h ep a t hw a yw h e r e l a c t i ca c i di st h ef i n a lp r o d u c tc a n n o ta c h i e v er e d o x F i g G e n e r a t i o na n dc o n s um p t i o no fr e d u c i n ge q u i v a l e n t sd u r i n g t h ec o n v e r s i o no fg l y c e r o la n dg l u c o s e B r o k e nl i n e sr e p r e s e n t m u l t i p l es t e p s H ,NADH /FADH2/QH ;PEP ,p h o s p h o e n o l p y r u v a t e ; PYR ,p y r u v a t e b a l a n c el i k et h ep a t hw a yf r omg l u c o s e( κglucose=4 )t o l a c t i ca c i d[ ] T h i si sa l s oim p l i e db yF i g 1[ ] F o r g l u c o s ef e rm e n t a t i o n ,1 m o l eo fr e d o xp ow e rs y n t h e s i z e d f r om0 5m o l eo fg l u c o s et o1 m o l eo fp y r u v a t ec a nb e c o n s um e d i np r o d u c i n g1m o l eo f l a c t i ca c i df r omp y r u v a t e r e d u c t i o n ,a n dt h er e d o xp ow e rc a nb eb a l a n c e db yt h e g l u c o s e p y r u v a t e l a c t i ca c i dp a t hw a y H ow e v e r , t h ep a t hw a y f r om1 m o l eo fg l y c e r o lt o1 m o l eo fp y r u v a t eg e n e r a t e s 2m o l e so fr e d o xp ow e r[ , ] ,w h e r e a so n l y1 m o l eo f r e d o xp ow e ri sc o n s um e di nt h er e d u c t i o no fp y r u v a t et o l a c t i ca c i d A st h er e d o xp ow e ri s n ’ tb a l a n c e di nt h e g l y c e r o l p y r u v a t e l a c t i ca c i dp a t hw a y ,t h i sp a t hw a yi sn o t f a v o r e d I ti sa l s od i f f i c u l tt ob a l a n c et h er e d o xp ow e rf r om g l y c e r o lt ot h ec e l lm a s sa st h ed e g r e eo fr e d u c t i o np e r c a r b o ni nt h ef u n g a lc e l lm a s si s4 2( c e l lm a s sf o rm u l a , CH1 O0.6N0.1)[ ] T h e r e f o r e ,t oa c h i e v et h eb a l a n c eo f r e d o xp ow e r ,u n d e e r o b i cc o n d i t i o n sg l y c e r o lu t i l i z a t i o n p r e f e r st h ep a t hw a yw i t hCO a s t h e f i n a l p r o d u c t , s o t h a t t h ee x c e s sr e d o xp ow e rf r omt h es y n t h e s i so ft h ec e l lm a s s a n t h e rh o u s e k e e p i n gm e t a b o l i t e sc a nb ec om p l e t e l y c o n s um e d L a c t i ca c idd eh yd r o g en a s ea c t i v i t y As t u d yo nl a c t i ca c i v e r p r o d u c t i o nb yt h eR o r y z a e 392 B io te chno log yandB iop ro ce s sEng inee r ing20 :389 -395(2015 ) * T ab l e2 LDHr e d u c t i v ea c t i v i t yo fR o r y z a ei ng l y c e r o lc u l t u r ea t3 ºC I n t r a c e l l u l a rLDHa c t i v i t yi n1 0gg l y c e r o l /Lm e d i um C u l t u r et im e( h ) LDHr e d u c t i v ea c t i v i t y(U⋅ g ) L a c t i ca c i d( g /L ) I n t r a c e l l u l a rLDHa c t i v i t yi n1 0gg l u c o s e /L m e d i um C u l t u r et im e( h ) ) LDHr e d u c t i v ea c t i v i t y(U⋅ g L a c t i ca c i d( g /L ) - 6 - - - 1 6 - 4 0 * D a t ap o i n t sr e p r e s e n t t h em e a n so f tw or e p l i c a t e s m u t a n tb yB a ie ta l s h ow e dt h a tt h ep y r u v a t en o d ew a st h e p r i n c i p a ln o d ei nt h el a c t i ca c i dp a t hw a ya n di n d i c a t e dt h a t p y r u v a t e t o e t h a n o la n dp y r u v a t e t oa c e t y lC oAa r et h e tw om a j o rp a t hw a y sc om p e t i n gw i t ht h ep y r u v a t e t o l a c t i c a c i dp a t hw a yf o rp y r u v a t e[ 2 ] N i c o t i n am i d ea d e n i n e + d i n u c l e o t i d e(NAD )d e p e n d e n tl a c t i ca c i dd e h y d r o g e n a s e (LDH ,EC1 )a n dp y r u v a t ed e h y d r o g e n a s e(PDH )a r e t h ep r im a r ye n z ym e sr e s p o n s i b l ef o rc o n v e r t i n gp y r u v a t e i n t ol a c t i ca c i da n da c e t y lC oA ,r e s p e c t i v e l y[ ] D a v i d e ta l e l u c i d a t e dt h a tt h ea c t i v i t yo fPDHw a ss i g n i f i c a n t l y u p r e g u l a t e di ng l y c e r o lm e t a b o l i smc om p a r e dt og l u c o s e m e t a b o l i sm[ ] C o n s i d e r i n gt h a tn oe x t r a c e l l u l a re t h a n o l w a sd e t e c t e di ng l y c e r o lc u l t u r e( d a t an o ts h ow n ) ,i ti s a s s um e dt h a tm o s y r u v a t ei sc o n v e r t e di n t oa c e t y lC oA b yt h eu p r e g u l a t e dPDHa n dt h a tl e s sp y r u v a t ec a nb e a c c e s s e db yLDH M o r e o v e r ,M a z um d a re ta l o b s e r v e d t h a t LDHc o u l dn o tb ea c t i v a t e da tl owp y r u v a t ec o n c e n t r a t i o n s i nv i v o[ ] T h e r e f o r e ,t h eLDHa c t i v i t ya n dt h ei n t r a c e l l u l a r p y r u v a t el e v e lw e r ep r e d i c t e dt ob ec r i t i c a lt ot h ef u n g a l l a c t i ca c i da c c um u l a t i o nf r omg l y c e r o l A ss h ow ni nT a b l e2 ,l a c t i ca c i da c c um u l a t i o no ng l u c o s e m e d i um i n c r e a s e da s t h e i n t r a c e l l u l a rLDHa c t i v i t y i n c r e a s e d T h el a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o nr e a c h e di t sm a x im uma t 8g /L ,w i t ht h eh i g h e s t LDHa c t i v i t yo f1 4U / gd r y b i om a s s W h i l eR o r y z a ec u l t i v a t i o no ng l y c e r o lm e d i um d i dn o r o d u c ea n yd e t e c t a b l el a c t i ca c i dd u r i n gt h e f e rm e n t a t i o n ,m i n o rLDHa c t i v i t y( 5U / g )w a so b s e r v e d a t6 5h o ft h ec u l t u r e(T a b l e2 ) ,d em o n s t r a t i n gt h e p r e s e n c eo fi n t r a c e l l u l a rLDHe n z ym ea tt h eb e g i n n i n go f t h ee x p o n e n t i a lg r ow t hp h a s e(T a b l e2a n dF i g S c ) I tw a s h y p o t h e s i z e dt h a ti nv i v oLDHm a yn o tb ea c t i v a t e dd u et o t h el owc o n c e n t r a t i o no fa c c e s s i b l ep y r u v a t er e s u l t i n gf r om t h eu p r e g u l a t e dp y r u v a t ed e h y d r o g e n a s ec om p l e x A sa r e s u l t ,n ol a c t i ca c i dw a sp r o d u c e di nv i v o I nt h ei nv i t r o a s s a y ,h ow e v e r ,a ne x c e s so fp y r u v a t ea n d NADH w e r e s u p p l i e di nt h er e a c t i o ns y s t em ,e n a b l i n g LDHt ob e a c t i v a t e da n dr e d u c ep y r u v a t et ol a c t i ca c i dw i t h NADH T h eu n d e t e c t a b l eLDHa c t i v i t ya f t e r6 5hi sl i k e l yb e c a u s e e x t r em e l yw e a ka c t i v i t yc a n n o tb ed e t e c t e dd u et ot h e l im i t e ds e n s i t i v i t yo ft h i sm e t h o d O v e r a l l ,t h ee x p e r im e n t a l r e s u l t s ,a l o n gw i t ht h eo b s e r v a t i o n sf r om D a v i de ta l a n d M a z um d a re ta l ,s u g g e s tt h a tt h ea c c e s s i b i l i t yo fLDHt o p y r u v a t ei st h ek e yt oa c h i e v i n gl a c t i ca c i da c c um u l a t i o n f r omg l y c e r o l T h u s ,t h ee f f e c t so fc u l t u r et em p e r a t u r ea n d p y r u v a t ec o n c e n t r a t i o no nf u n g a lg l y c e r o lm e t a b o l i smw e r e s t u d i e d t of u r t h e rv e r i f y t h er o l eo fp y r u v a t ea n dLDHd u r i n g l a c t i ca c i da c c um u l a t i o n E f f e c t so ft emp e r a tu r eong l y c e r o lu t i l i z a t i onand l a c t i ca c ids yn th e s i sund e e r ob i cc ond i t i on s T h eo p t im a lc u l t u r et em p e r a t u r eo fR o r y z a eA TCC9 f o rl a c t i ca c i da c c um u l a t i o no ng l u c o s em e d i umh a sb e e n r e p o r t e dt ob ea p p r o x im a t e l y2 ~3 ºC[ ] A sm o s t e n z ym e si nv i v oa r es e n s i t i v et ot em p e r a t u r ec h a n g e s ,t h e e x p r e s s i o na n da c t i v i t yo ft h ei n t r a c e l l u l a re n z ym e sLDH a n dPDHw e r ee x p e c t e dt or e s p o n dd i f f e r e n t l yt oc h a n g e s i nt em p e r a t u r e O u rh y p o t h e s e sw e r et h a tu n d e re l e v a t e d t em p e r a t u r e ,LDHa n dPDHm i g h tb er e g u l a t e da td i f f e r e n t l e v e l sa n dd i r e c tt h eg l y c e r o lp a t hw a y st ow a r d sl a c t i ca c i d a c c um u l a t i o n T o t e s t t h i sh y p o t h e s i s ,R o r y z a ew a sc u l t u r e d o nb o t hg l y c e r o la n dg l u c o s em e d i aa ta ne l e v a t e d t em p e r a t u r e o o f3 C I nt h eR o r y z a ec u l t u r eo ng l u c o s em e d i um ,t h eh i g h e s t s p e c i f i cg r ow t hr a t eµ a s0 / h ,a n dt h em a x im umc e l l m a x w f0 3g / gw a so b t a i n e da tt h ei n i t i a lg l u c o s e m a s sy i e l dYx/so c o n c e n t r a t i o no f1 0g /L( i n i t i a lC /Nr a t i oo f1 8m o l /m o l ) o (F i g 2Aa n dT a b l e3 ) T h ec e l lm a s sy i e l da t3 Co n g l y c e r o lr em a i n e ds im i l a rc om p a r e dt og l y c e r o lc u l t u r e sa t o C ,w h e r e a st h ea v e r a g eg r ow t hr a t ei ng l u c o s em e d i um o s i g n i f i c a n t l yd e c r e a s e d t oo n l y2 1%o f t h a ta t3 C(T a b l e s1 a n d3 ) As i g n i f i c a n td i f f e r e n c ew a sa l s oo b s e r v e di nl a c t i c a c i da c c um u l a t i o nb e tw e e nt h etw ot em p e r a t u r e s T h e m a x im uml a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o no f1 1g /Lo b s e r v e da t o Cw a so n l y5 5%o ft h eh i g h e s tc o n c e n t r a t i o n( 0g /L ) o a t3 0C(F i g s S 1Ea n d2C ) S im i l a r l yt og l u c o s ef e rm e n t a t i o n ,h i g h e rt em p e r a t u r e c o n s i d e r a b l yr e d u c e dt h ea v e r a g eg r ow t hr a t eo fR o r y z a e i ng l y c e r o lm e d i umb yn e a r l y6 3%(T a b l e s1a n d3 ,F i g s 2D a n dS 1C ) I n t e r e s t i n g l y ,a t3 °C ,t h ec e l lm a s sy i e l dw a s im p r o v e db y3 ,5 ,a n d1 0%a n dm a x im uml a c t i ca c i d E va lua t iono fFunga lLa c t i cA c idA c cumu la t ionU s ing G l yce ro la stheSo leCa rbonSou r ce 393 F i g I n v e s t i g a t i o no ft h eg r ow t hk i n e t i c s ,s u b s t r a t eu t i l i z a t i o n ,a n dl a c t i ca c i dp r o d u c t i o no fR o r y z a ei ng l u c o s ea n dg l y c e r o lm e d i aa t ºC (A )G r ow t hc u r v ei ng l u c o s em e d i um ,(B )g l u c o s eu t i l i z a t i o n ,(C )l a c t i ca c i da c c um u l a t i o ni ng l u c o s em e d i um ,(D )g r ow t hc u r v ei n g l y c e r o lm e d i um ,(E )g l y c e r o lu t i l i z a t i o n ,(F )l a c t i ca c i da c c um u l a t i o n i ng l y c e r o lm e d i um D a t ap o i n t sr e p r e s e n t t h em e a n so ftw or e p l i c a t e s * T ab l e3 G r ow t hk i n e t i c so fR o r y z a ei ng l y c e r o la n dg l u c o s em e d i aa t3 ºC G l y c e r o l I n i t i a lC /N (m o l /m o l ) / h ) µmax ( Yx/s( g / g ) 0g /L 0g /L 0g /L G l u c o s e 0g /L 2 0 0g /L 3 0g /L 0g /L 0g /L * D a t ap o i n t sr e p r e s e n t t h em e a n so f tw or e p l i c a t e s u g g e s t i n gt h a tl a c t i ca c i dc a na c ta sac a r b o ns o u r c ef o r c o n c e n t r a t i o n sw e r e0 ,0 6a n d0 6g /Li n3 ,5 0a n d s o r y z a e[ ] 0g /Lg l y c e r o lm e d i a ,r e s p e c t i v e l y(F i g 2F ) A f t e rr e a c h i n g R a n dc a nb eu s e ds im u l t a n e o u s l yw i t hg l y c e r o l t h e m a x im um ,l a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o n sl e v e l e f f S i g n i f i c a n t l yi n c r e a s e dc e l lm a s sy i e l d sa n dd e c r e a s e d o (F i g 2F )w i t hc o n t i n u e dg l y c e r o lc o n s um p t i o n(F i g 2E ) , g r ow t hr a t e si ng l y c e r o lm e d i aa t3 Ci n d i c a t et h a tl e s s 394 B io te chno log yandB iop ro ce s sEng inee r ing20 :389 -395(2015 ) F i g I n v e s t i g a t i o no fl a c t i ca c i da c c um u l a t i o nw h e ns o d i ump y r u v a t ei sa d d e dt ot h ec u l t u r e T r e a tm e n tA :4 mMs o d i ump y r u v a t e w a sa d d e dt ot h eb r o t he v e r y2 4h T r e a tm e n tB :8 mMs o d i ump y r u v a t ew a sa d d e dt ot h eb r o t he v e r y2 4h T r e a tm e n tC :c o n t r o l t r e a tm e n tw i t h o u tt h ea d d i t i o no fs o d i ump y r u v a t e T h es am em e d i umw a su s e df o l lt r e a tm e n t s (A )L a c t i ca c i da c c um u l a t i o na t3 ºC , (B )g l y c e r o lu t i l i z a t i o na t3 ºC ,(C )l a c t i ca c i da c c um u l a t i o na t3 ºC ,(D )g l y c e r o lu t i l i z a t i o na t3 ºC T h ed a t ap o i n t sr e p r e s e n tt h em e a n s o ftw or e p l i c a t e s c a r b o nf r omg l y c e r o lw a so x i d i z e dt oc a r b o nd i o x i d ea t h i g h e rt em p e r a t u r ea n dt h a tt h eTCAc y c l ea n dr e s p i r a t o r y c h a i nw e r ep a r t i a l l yi n h i b i t e da th i g h e rt em p e r a t u r e[ ] T h e r e f o r e ,t h ea b i l i t yo f LDHt oc om p e t ew i t ho t h e r p y r u v a t eb r a n c hp o i n te n z ym e ss u c sPDHf o rp y r u v a t e m a yb e i n d i r e c t l y im p r o v e d C o r r e s p o n d i n g l y , t h e l a c t i ca c i d a c c um u l a t i o nw a se n h a n c e d Enh an c em en to f l a c t i ca c ida c cumu l a t i onong l y c e r o l m ed iumb yin c r e a s in gth ein t r a c e l lu l a rp y ru v a t el e v e l T h er e s u l t so ft h ep r e v i o u ss e c t i o na l s os u g g e s tt h a tt h e i n t r a c e l l u l a rp y r u v a t ec o n c e n t r a t i o nw o u l db ec r i t i c a lf o r f u n g a ll a c t i ca c i ds y n t h e s i sb ym e t a b o l i z i n gg l y c e r o l T o c o n f i rm ,s o d i ump y r u v a t ew a sd o s e d i n t o t h ec u l t u r em e d i a e v e r y2 4ha tt h r e el e v e l so f0 ,4 ,a n d8 0mm o l /Lf o rb o t h 0a n d3 °Cc u l t u r e s(F i g ) W h e ns o d i um p y r u v a t ew a sa d d e d ,l a c t i ca c i dw a s o d e t e c t e di nt h e3 Cc u l t u r eb e g i n n i n ga t7 0h A tt h ee n d o ft h ef e rm e n t a t i o n( 6h ) ,t h el a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o n s i nt h ec u l t u r e ss u p p l i e dw i t h4 0a n d8 mm o l /Ls o d i um p y r u v a t er e a c h e d0 7a n d0 4g /L(F i g 3A ) ,r e s p e c t i v e l y u l t u r e ,t h el a c t i ca c i da c c um u l a t i o no c c u r r e d F o rt h e3 7oCc a t5 0hf o rt h ec u l t u r ec o n t a i n i n gs o d i ump y r u v a t e ,a r o u n d o n ed a ye a r l i e rt h a nt h ec o n t r o lc u l t u r ew i t h o u ts o d i um p y r u v a t e T h em a x im uml a c t i ca c i dc o n c e n t r a t i o n sr e a c h e d 3a n d1 0g /Lf o r4 0a n d8 mm o l /Ls o d i ump y r u v a t e t r e a tm e n t s ,w h i c hw e r ee n h a n c e db y2a n d1 4t im e sf r om t h ec o n t r o l ,r e s p e c t i v e l y(F i g 3C ) A tb o t ht em p e r a t u r e s , t h ec u l t u r ew i t h4 0mm o l /Ls o d i ump y r u v a t ee x h i b i t e db e t t e r l a c t i ca c i ds y n t h e s i st h a n8 mm o l /Ls o d i ump y r u v a t e , w h i c hm i g h tb ed u et ot h en e g a t i v eim p a c to ft h eh i g h s o d i umi o nc o n c e n t r a t i o no nf u n g a lc e l l s M o r e o v e r ,a d d i n g s o d i um p y r u v a t eim p r o v e dg l y c e r o lu t i l i z a t i o na tb o t h o t em p e r a t u r e s(F i g s 3Ba n d3D ) ,p a r t i c u l a r l ya t3 7C ,w h e r e g l y c e r o lc o n s um p t i o nw a si n c r e a s e db y1 5a n d1 3%i n t h ep r e s e n c eo f4 0a n d8 0mm o l /Ls o d i ump y r u v a t ec om p a r e d w i t ht h ec o n t r o l s ,r e s p e c t i v e l y I na d d i t i o n ,R o r y z a ec u l t u r e o np y r u v a t ea st h es o l ec a r b o ns o u r c ey i e l d e da lm o s tn o g r ow t tb o t ht em p e r a t u r e s( d a t an o ts h ow n ) T h e r e f o r e , t h ei n t r a c e l l u l a rl e v e lo fp y r u v a t ei sc r i t i c a lf o rl a c t i ca c i d s y n t h e s i sf r omg l y c e r o lb yR o r y z a e.T h e s er e s u l t sa l s o i n d i c a t et h a tl a c t i ca c i dp r o d u c t i o nc o u l db eim p r o v e db y e i t h e ri n c r e a s i n gt h eLDHe x p r e s s i o nl e v e lt od i v e r tm o r e p y r u v a t e t o l a c t i ca c i df r omo t h e rb r a n c hp o i n t sa n d im p r o v e E va lua t iono fFunga lLa c t i cA c idA c cumu la t ionU s ing G l yce ro la stheSo leCa rbonSou r ce t h ec o n v e r s i o ne f f i c i e n c yo fl a c t i ca c i da c c um u l a t i o n[ ] , o rb yp a r t i a l l yi n h i b i t i n gPDHb yk n o c k i n gd ow nc e r t a i n g e n e ss ot h a tm o r ep y r u v a t ei sa v a i l a b l ef o r LDHt o p r o d u c el a c t i ca c i d T h i ss t u d ye v a l u a t e d t h ep o s s i b i l i t yo f l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n f r omg l y c e r o lb yt h ef i l am e n t o u sf u n g u sR o r y z a e.D u et o t h eh i g h e rd e g r e eo fr e d u c t i o np e rc a r b o no fg l y c e r o l ,t h e TCAc y c l ea n dt h er e s p i r a t o r ya r ep r e f e r r e di ng l y c e r o l m e t a b o l i smo v e rt h ep a t hw a yo fl a c t i ca c i da c c um u l a t i o n , a n d t h eLDHa c c e s s i b i l i t yo fp y r u v a t em i g h tb e l im i t e d B y i n c r e a s i n gt h ec u l t u r et em p e r a t u r ef r om3 0t o3 °C ,l a c t i c a c i da c c um u l a t i o nw a sa c h i e v e ng l y c e r o lm e d i um , p r o b a b l yd u et ot h ep a r t i a li n h i b i t i o no ft h eTCAc y c l ea n d t h er e s p i r a t o r yc h a i na ta ne l e v a t e d t em p e r a t u r e T h ea d d i t i o n o fs o d i ump y r u v a t ee n h a n c e dt h el a c t i ca c i dp r o d u c t i o n b yt h ec u l t u r eo ng l y c e r o lm e d i um ,d em o n s t r a t i n gt h e im p o r t a n c eo fa na c c e s s i b l ei n t r a c e l l u l a rp y r u v a t ep o o lf o r LDHi nl a c t i ca c i ds y n t h e s i s R e f e r en c e s R a hm a t ,N ,A Z A b d u l l a h ,a n dA R M o h am e d( )R e c e n t p r o g r e s so ni n n o v a t i v ea n dp o t e n t i a lt e c h n o l o g i e sf o rg l y c e r o l t r a n s f o rm a t i o ni n t of u e la d d i t i v e s :Ac r i t i c a lr e v i ew R e n ew a b l e &S u s t a i n a b l eE n e r g yR e v i ew s.1 :9 0 Y a z d a n i ,S S a n dR G o n z a l e z( 0 )A n a e r o b i cf e rm e n t a t i o no f g l y c e r o l :Ap a t ht oe c o n om i cv i a b i l i t yf o rt h eb i o f u e l si n d u s t r y C u r r O p i n B i o t e c h n o l.1 :2 M a z um d a r ,S ,J M C l om b u r g ,a n dR G o n z a l e z( )E s c h e r i c h i ac o l is t r a i n se n g i n e e r e df o rh om o f e rm e n t a t i v ep r o d u c t i o no f D l a c t i ca c i d f r omg l y c e r o l A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l.7 :4 3 C a s t r o ,I M a n dM C L o u r e i r o -D i a s( 9 )G l y c e r o lu t i l i z a t i o n i nF u s a r i umo x y s p o r umv a r l i n i :R e g u l a t i o no ft r a n s p o r ta n d m e t a b o l i sm J G e n M i c r o b i o l :1 J e n n i n g s ,D H ( )P o l y o lm e t a b o l i smi nf u n g i A d v M i c r o b P h y s i o l.2 :1 9 W i t t e v e e n ,C F ,P v a nd eV o n d e r v o o r t ,C D i j k em a ,K Sw a r t , a n dJ V i s s e r( 9 )C h a r a c t e r i z a t i o no fag l y c e r o lk i n a s em u t a n t o fA s p e r g i l l u sn i g e r J G e n M i c r o b i o l :1 9 L i u ,Y ,W L i a o ,C L i u ,a n dS C h e n( 0 )O p t im i z a t i o no fL (+ ) l a c t i ca c i dp r o d u c t i o nu s i n gp e l l e t i z e df i l am e n t o u sR h i z o p u s o r y z a eNRRL3 A p p l B i o c h em B i o t e c h n o l.1 :8 4 L o n g a c r e ,A ,J M R e im e r s ,J E G a n n o n ,a n dB E W r i g h t ( 9 )F l u xa n a l y s i so fg l u c o s em e t a b o l i smi nr h i z o p u so r y z a e f o rt h ep u r p o s eo fi n c r e a s i n gl a c t a t ey i e l d s F u n g a lG e n e t B i o l :3 T h i t i p r a s e r t ,S ,S S o o k s a i ,a n dN T h o n g c h u l( 1 )I nv i v or e g u l a t i o no fa l c o h o ld e h y d r o g e n a s ea n dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s ei n 395 R h i z o p u so r y z a et oim p r o v eL l a c t i ca c i df e rm e n t a t i o n A p p l B i o c h em B i o t e c h n o l.1 :1 2 M a a s ,R H ,J S p r i n g e r ,G E g g i n k ,a n dR A W e u s t h u i s( 0 ) X y l o s em e t a b o l i smi nt h ef u n g u sR h i z o p u so r y z a e :E f f e c to f g r ow t n dr e s p i r a t i o no n L+ l a c t i ca c i dp r o d u c t i o n J I n d M i c r o b i o l B i o t e c h n o l.3 :5 1 L i u ,Y ,W L i a o ,a n dS C h e n( 0 )S t u d yo fp e l l e tf o rm a t i o no f f i l am e n t o u sf u n g iR h i z o p u so r y z a eu s i n ga m u l t i p l el o g i s t i c r e g r e s s i o nm o d e l B i o t e c h n o l B i o e n g.9 :1 R u a n ,Z ,M Z a n o t t i ,X W a n g ,C D u c e y ,a n dY L i u( 2 ) E v a l u a t i o no fl i p i da c c um u l a t i o nf r oml i g n o c e l l u l o s i cs u g a r sb y M o r t i e r e l l s a b e l l i n af o rb i o d i e s e lp r o d u c t i o n B i o r e s o u rT e c h n o l 1 :1 S k o r y ,C D ( 0 )I s o l a t i o na n de x p r e s s i o no fl a c t a t ed e h y d r o g e n a s eg e n e sf r omR h i z o p u so r y z a e A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l 6 :2 3 M u r a r k a ,A ,Y D h a rm a d i ,S S Y a z d a n i ,a n dR G o n z a l e z ( 0 )F e rm e n t a t i v eu t i l i z a t i o no fg l y c e r o lb yE s c h e r i c h i ac o l i a n di t sim p l i c a t i o n sf o rt h ep r o d u c t i o no ff u e l sa n dc h em i c a l s A p p l E n v i r o n M i c r o b i o l.7 :1 1 D h a rm a d i ,Y ,A M u r a r k a ,a n dR G o n z a l e z( 0 )A n a e r o b i c f e rm e n t a t i o no fg l y c e r o lb yE s c h e r i c h i ac o l i:An ewp l a t f o rmf o r m e t a b o l i ce n g i n e e r i n g B i o t e c h n o l B i o e n g.9 :8 D u r n i n ,G ,J C l om b u r g ,Z Y e a t e s ,P J A l v a r e z ,K Z y g o u r a k i s , P C am p b e l l ,a n dR G o n z a l e z( 0 )U n d e r s t a n d i n ga n dh a r n e s s i n gt h em i c r o a e r o b i cm e t a b o l i smo fg l y c e r o li nE s c h e r i c h i a c o l i B i o t e c h n o l B i o e n g.1 :1 G a n c e d o ,C ,J M G a n c e d o ,a n dA S o l s( )G l y c e r o lm e t a b o l i smi ny e a s t s P a t hw a y so fu t i l i z a t i o na n dp r o d u c t i o n E u r J B i o c h em.5 :1 M a y ,J W ,J H M a r s h a l l ,a n dJ S l o a n( )G l y c e r o lu t i l i z a t i o nb ys c h i z o s a c c h a r omy c e s p om b e-p h o s p h o r y l a t i o no fd i h y d r o x y a c e t o n eb yas p e c i f i ck i n a s ea st h e2 n dS t e p J G e n M i c r o b i o l.1 :1 7 6 L i n ,E C ( )G l y c e r o ld i s s im i l a t i o na n d i t sr e g u l a t i o n i nb a c t e r i a A n n u R e v M i c r o b i o l.3 :5 5 V i l l a d s e n ,J ,J H N i e l s e n ,a n dG L i d é n( 1 )B i o r e a c t i o ne n g i n e e r i n gp r i n c i p l e s r de d S p r i n g e r ,NY ,USA C e r v a n t e s ,F J ,S G P a v l o s t a t h i s ,a n dA C V a nH a a n d e l( 0 ) A d va n c e db i o l o g i c a lt r e a tm e n r o c e s s e sf o ri n d u s t r i a lw a s t ew a t e r s I n :I n t e r g r a t e dE n v i r o nm e n t a lT e c h n o l o g yS e r i e s p IWAP u b l i s h i n g ,L o n d o n 2 B a i ,D M ,X M Z h a o ,X G L i ,a n dS M X u( 0 )S t r a i n im p r o v em e n to fR h i z o p u so r y z a ef o ro v e r p r o d u c t i o nO fL (+ ) l a c t i ca c i da n dm e t a b o l i cf l u xa n a l y s i so fm u t a n t s B i o c h em E n g J :4 S k o r y ,C D ( 0 )L a c t i ca c i dp r o d u c t i o nb yR h i z o p u so r y z a e t r a n s f o rm a n t sw i t hm o d i f i e dl a c t a t ed e h y d r o g e n a s ea c t i v i t y A p p l M i c r o b i o l B i o t e c h n o l.6 :2 D a v i d ,H ,G H o fm a n n ,A P O l i v e i r a ,H J a rm e r ,a n dJ N i e l s e n ( 0 )M e t a b o l i cn e tw o r kd r i v e na n a l y s i so fg e n om e -w i d et r a n s c r i p t i o nd a t af r omA s p e r g i l l u sn i d u l a n s G e n om eB i o l.7 :R P r a s a d ,A R ,C K K u r u p ,a n dR M a h e s hw a r i( 9 )E f f e c to f t em p e r a t u r eo nr e s p i r a t i o no fa m e s o p h i l i ca n dat h e rm o p h i l i c f u n g u s P l a n tP h y s i o l.6 :3 ... yg l y c e r o lk i n a s e t of o rmg l y c e r o l p h o s p h a t e (G -P ) ,a n dt h eG -Pi sd e h y d r o g e n a t e db yG -P d e h y d r o g e n a s e t of o rmd i h y d r o x y a c e... so fr e d u c t i o n p e rc a r b o ni ng l y c e r o l( κglycerol)a n dl a c t i ca c i d( κlacticacid) a r e4 7a n d4 ,r e s p e c t i v e l y[ , ] T h ep a t hw a yw h e r e l a c t i ca... ec o n c e n t r a t i o no nf u n g a lg l y c e r o lm e t a b o l i smw e r e s t u d i e d t of u r t h e rv e r i f y t h er o l eo fp y r u v a t ea n dLDHd u r i n g l a c t i ca c i da