Luận văn thạc sĩ tách dòng và thiết kế vector biểu hiện gen mã cho thụ thể neurokinin 1 ở người việt nam

ĐAI TRƯỜ NG ĐAI HO QUỐ C GIA HÀ NÔI C HO KHOA C HOC TỰ NHIÊN - Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGỪƠI VIỆT NAM LUÂN VĂN THAC SĨ KHOA HOC Hà Nội - 2012 ĐAI HO QUỐ C GIA HÀ NÔI C TRƯỜ NG ĐAI HO KHOA C HOC TỰ NHIÊN Lê Hồng Thu TÁCH DÒNG VÀ THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 Ở NGƯỜI VIỆT NAM Chuyên ngaǹ h: Sinh học thực nghiệm Mã số: 604230 LUÂN VĂN THAC NGƢỜ I HƢỚ NG DẪN KHOA HOC SĨ KHOA HOC : PGS.TS Võ Thị Thƣơng Lan Hà Nội - 2012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ch¬ng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1.1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 11 1.1.1 G protein 11 1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein 11 1.2 HỌ TACHYKININ Ở ĐỘNG VẬT CÓ VÚ 14 1.3 THỤ THỂ HỌ TACHYKININ VÀ THỤ THỂ NEUROKININ-1 18 1.3.1 Giới thiệu chung thụ thể họ tachykinin 18 1.3.2 Thụ thể neurokinin – 20 1.4 ỨNG DỤNG CỦA THỤ THỂ NEUROKININ-1 TRONG ĐIỀU TRỊ BỆNH 23 1.5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 26 Chƣơng 2: NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 28 2.1 NGUYÊN LIỆU 28 2.1.1 Mẫu vật 28 2.1.2 Các cặp mồi sử dụng 28 2.1.3 Các hệ thống vector 29 2.1.4 Chủng vi khuẩn 29 2.1.5 Hóa chất và thiết bị 29 2.2 PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 30 2.2.1 Sơ đồ nghiên cứu 30 2.2.2 Các kỹ thuật dùng nghiên cứu 31 2.2.2.1 Tách RNA tổng số 31 2.2.2.2 Phản ứng phiên mã ngược 32 2.2.2.3 Phản ứng PCR (Polymerase Chain Reaction) 32 2.2.2.4 Tinh DNA phương pháp gel 33 2.2.2.5 Nối ghép đoạn DNA vào vector 33 2.2.2.6 Kỹ thuật biến nạp 33 2.2.2.7 Sàng lọc khuẩn lạc 34 2.2.2.8 Tách plasmid .34 2.2.2.9 Kĩ thuật cắt sử dụng enzyme giới hạn .35 2.2.2.10 Kỹ thuật điện di 36 2.2.2.11 Phân tích trình tự cDNA cDNA-NK1 36 Chƣơng 3: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 37 3.1 TÁCH DÒNG GEN MÃ HÓA CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 TỪ PHỔI NGƢỜI 37 3.1.1 Tổng hợp cDNA từ mẫu phổi người 37 3.1.2 Khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.37 3.1.3 Khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1.39 3.1.4 Tách dòng đoạn 5’-NK1 và 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 41 3.1.5 Tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 44 3.1.6 Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 49 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 49 3.2.1 Thiết kế mồi 49 3.2.2 Tách dòng vector biểu mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin- 52 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vector biểu 56 KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ 57 KẾT LUẬN .57 KIẾN NGHỊ 57 TÀI LIỆU THAM KHẢO 58 \ DANH MỤC CÁC HÌNH Hình 1: Họ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) Hình 2: Cấu trúc chung thụ thể xuyên màng lần liên kết với G protein Hình 3: Sơ đồ cắt-nới gen mã hóa cho tachykinin đợng vật có vú Hình 4: Cấu trúc thụ thể NK1 mang chiều dài hịan chỉnh và NK1 có đầu carboxyl bị xén cụt 12 Hình 5: Sơ đồ nghiên cứu tách dịng và thiết kế vector biểu cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam 22 Hình 6: Sơ đồ khuếch đại đoạn 5’ và 3’-NK1 gen mã hóa cho neurokinin-1… Hình 7: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 .30 Hình 8: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 3’-NK1 cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 30 Hình 9: Điện di sản phẩm PCR dùng khuôn cDNA tổng hợp từ mồi oligo T khuếch đại đoạn 3’-NK1 30 Hình 10: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc với cặp mồi NK1 F/ NK1 R1 34 Hình 11: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn chèn 3’-NK1 cặp mồi NK1 F1/ NK1 R 35 Hình 12 Sơ đồ tách dòng đoạn cDNA hoàn chỉnh mã cho thụ thể neurokinin-1 .36 Hình 13: Điện di sản phẩm PCR khuếch đại đoạn 5’-NK1 cặp mồi pJET R/ NK1 R .37 Hình 14: Điện di sản phẩm cắt trước và sau tinh kit QIAquick Gel Extraction… 38 Hình 15: Điện di sản phẩm PCR sàng lọc khuẩn lạc mang đoạn cDNA NK1 hoàn chỉnh 40 Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK13 41 Hình 17: Điên di san̉ phâm̉ PCR với khn là vector taí tổ hơp pNK 1-3 và hai mồ i NK F3/NK1 R3 .43 Hình 18: Điên di san̉ phâm̉ cắ t ve ctor pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK với hai enzyme Hind III và Bam HI .44 Hình 19: Điên di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lac mang vector tái tổ hợp pCDNA 3- NK1 46 Hình 20: Điên di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lac mang vector tái tổ hơp pGFPN 1- NK1 47 DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT DNA Dedeoxyribonuleic acid pb base pair (cặp bazơ) kb kilobase = 1000 bp dNTP deoxyribonucleoside triphosphate E.col Escherichia coli LB Lubertani Both PCR Polymerase Chain Reception RNA Ribonucleic acid GPCR G protein coupled receptor TACR Tachykinin Receptor TM Transmembrane IL Ỉntacellular CIN V Chemotherapy induced nausea and vomiting MỞ ĐẦU Thụ thể neurokinin – tḥc nhóm thụ thể xun màng liên kết với G protein Khi thụ thể này tương tác với cấu tử gắn đặc hiệu SP dẫn truyền cảm giác đau đớn từ vùng thần kinh ngoại vi trung ương thần kinh, gây trạng thái lo âu và triệu chứng giống trầm cảm, mặt khác chúng có tác dụng gây kích thích co trơn và điều hòa phản ứng miễn dịch thể Trên sở nghiên cứu cấu trúc và chức thụ thể neurokinin-1, hãng dược phẩm đã cớ gắng tìm chất đối vận với thụ thể neurokinin-1 nhằm sản xuất thuốc giảm đau cho bệnh nhân bị chứng đau nửa đầu, thuốc chống trầm cảm, thuốc chống nôn cho bệnh nhân ung thư, … Tuy nhiên, công trình nghiên cứu thụ thể này người Việt Nam cịn chưa cơng bớ Chính vậy, với mục đích phân lập đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể này người Việt Nam và biểu chúng hệ thống tế bào đợng vật để chủ đợng nguồn gen và hệ thống sàng lọc thuốc từ nguồn dược liệu Việt Nam, đã tiến hành đề tài “Tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 ngườiViệt Nam” Đề tài thực Phịng thí nghiệm Sinh Y, Khoa Sinh học; Phịng Genomic tḥc Phịng thí nghiệm Trọng điểm Cơng nghệ Enzyme - Protein và Phịng Sinh học Phân tử thuộc Trung tâm nghiên cứu Khoa học sống,Trường Đại học Khoa học Tự nhiên, Đại học Quốc Gia Ha Nụi Chãơng 1.1 Chng 1: TNG QUAN TÀI LIỆU THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 1.1.1 G protein G protein lần phát và mô tả Alfred và Martin hai ông nghiên cứu tác động adrenaline đối với tế bào Với cơng trình này, hai ơng đã giành giải Nobel lý sinh – y học năm 1994 [4] G protein mợt nhóm protein lớn có chất là enzyme GTPases [46] Dựa vào kích thước người ta chia chúng thành hai họ: GTPases dạng monomer kích thước nhỏ và G protein dạng trimer kích thước lớn G protein kích thước lớn tạo thành từ tiểu đơn vị alpha (G α), beta (Gβ) và gamma (Gγ) Hai tiểu đơn vị beta (Gβ) và gamma (Gγ) hình thành phức dimer bền vững (Gβγ); phức này liên kết với tiểu đơn vị alpha (Gα) [29] G protein định vị mặt màng tế bào và hoạt hóa nhờ thụ thể liên kết với G protein (GPCRs) phân bố bề mặt màng tế bào 1.1.2 Thụ thể liên kết với G protein Họ thụ thể liên kết với G protein là phân tử protein kích thước nhỏ (350-500 acid amine) [45], phân thành phân họ khác dựa theo đợ tương đồng trình tự acid amine, chức và khả liên kết với cấu tử Đến đã người ta đã phát 367 thụ thể liên kết với G protein người, có khoảng 150 GPCRs tìm thấy chưa biết chức [52] 3.1.6 Giải trình tự cDNA hịan chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Chúng chọn khuẩn lạc NK1-3 để tách plasmid tái tổ hợp Plasmid này kí hiệu pNK1-3 Plasmid pNK1-3 giải trình tự hai chiều mồi vector pJET 1.2 F/ R Kết trình bày Phụ lục Kết so sánh với trình tự nucleotide cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 tách dịng từ não người Việt Nam, chúng tơi không thấy sai khác nào Cả hai trình tự này có nucleotide khác với trình tự ngân hàng liệu (Mã số NCBI: M81797.1) Điều này chứng tỏ khác biệt trình tự nucleotide gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam với trình tự nucleotide ngân hàng liệu là tính đa hình gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Như vậy, từ kết giải trình tự cho thấy chúng tơi đã tách dịng thành cơng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 từ mẫu phổi người Việt Nam 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ-1 3.2.1 Thiết kế mồi Để biểu cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người, sử dụng hai vector biểu tế bào động vật là pCDNA3 và pEGFP-N1 Bước cần chuyển đoạn cDNA đã tách dòng vector pJET1.2 sang hai hệ thống vector biểu Khi lựa chọn enzyme cắt giới hạn, không thấy enzyme nào vị trí đa điểm vector pEGFP-N1 và pCDNA3 thỏa mãn điều kiện cắt văng đoạn cDNA hoàn chỉnh từ vector tái tổ hợp pJET1.2-NK1 Vì vậy, chúng tơi đã thiết kế mồi NK1 F3/ NK1 R3 để chuyển cDNA-NK1 từ pNK1-3 sang vector biểu Trình tự cặp mồi NK1 F 3/ NK1 R3 thiết kế dựa vào trình tự cDNA hoàn chỉnh tách dịng từ phổi người Việt Nam Trong đầu 5’ mồi NK1 F3 thiết kế mang trình tự nhận biết cho enzyme cắt giới hạn HindIII và mồi NK1 F3 mang trình tự nhận biết cho enzyme BamHI Hình 16 + NK1 F3: 5’- + NK1 R3: 5’- ATTT AAGCTTACCATG ATAACGTCCTCC G AAGCTT Hind III ACCATG G Trình tự Kozak TAAGGATCC CTAGGAGAGCACATTG GGATCC - 3’ - 3’ Bam HI GTTACACGAGAGGATC CCTAGG AAT -5’-CTAGAAGATCGAAATGGATAACGTCCTCC /-/-/ pNK1 /-/-/ -CAATGTGCTCTCCTAGGGATCCTTA-3’-ATTT AAGCTTACCATGG ATAACGTCCTCC Hình 16: Sơ đồ thiết kế mồi NK1 F3/R3 để khuếch đại cDNA-NK1 từ vector pNK1-3 Mặt khác, chúng tơi sử dụng mã mở đầu trình tự cDNA NK1 thay mã mở đầu thiết kế sẵn vector biểu nên trình thiết kế mồi chúng tơi phải chèn thêm trình tự Kozak (ACCATGG) vào để làm tăng khả phiên mã và dịch mã gen tế bào nhận Với hai mồi thiết kế mới, khuếch đại cDNA từ pNK1-3 Thành phần và điều kiện phản ứng PCR thể Bảng 19 Bảng 19: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR khuếch đại cDNA-NK1 từ pNK1-3 cặp mồi NK1 F3/ NK1 R3 Thành phần H2O Thể tích (µl) 10.4 Điều kiện - Thời gian biến tính đầu tiên: 94oC, phút Đệm 10x (MgCl2 20 mM) 1.5 - Lặp lại chu kì: dNTPs (2 mM) 1.0 +Biến tính: 940C, 30 giây NK1 F3 (2 µM) 0.5 +Gắn mồi : 500C, 30 giây +Tổng hợp: 720C, 150 giây NK1 R3 (2 µM) 0.5 Pfu polymerase 0.1 +Biến tính: 940C, 30 giây pNK1-3 1.0 +Gắn mồi : 600C, 30 giây - Lặp lại 35 chu kỳ Tổng 15.0 +Tổng hợp: 720C, 150 giây - Thời gian tổng hợp sau cùng: 720C, 10 phút Trong phản ứng PCR, trình tự mồi thiết kế có mợt đoạn nucleotide tương đới dài khơng bắt cặp vào khuôn nên chu kỳ đầu tiên, hạ thấp nhiệt độ gắn mồi để nhân đoạn gen mong ḿn Ở chu kỳ tiếp theo, tăng nhiệt độ gắn mồi để đảm bảo tính đặc hiệu phản ứng Kết điện di sản phẩm PCR cho thấy đã thu băng có kích thước xấp xỉ 1237 bp trình bày Hình 17 Hình 17: di sản phẩm PCR với khuôn là vector taí tổ hơp pNK1-3 và hai mồi Điên NK1 F3/NK1 R3 Giếng 1: sản phẩm PCR khuếch đại cDNA NK 1; M: thang chuẩn SY 500; ĐC: đới chứ ng âm khơng có khuôn DNA Như cặp mồi thiết kế đã cho phép nhân đặc hiệu đoạn cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 Đồng thời đoạn DNA nhân có mang vị trí nhận biết cặp enzyme HindIII/ BamHI hai đầu 5’ và 3’ Sản phẩm PCR tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) và kí hiệu là eNK1 (expression NK1) 3.2.2 Tách dòng vector biểu mang cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin -1 Chúng tơi tách chiết và tinh hai loại plasmid pCDNA3 và pEGFP-N1 Hai plasmid này và đoạn eNK1 cắt với enzyme HindIII Sản phẩm cắt điện di và tinh kit High Pure Product purification kit (Roche) Sau đó, sản phẩm tinh tiếp tục cắt với BamHI Thành phần và điều kiện phản ứng cắt với enzyme trình bày Bảng 20 và Bảng 21 Bảng 20: Thành phần và điều kiện cho phản ứng cắt sản phẩm PCR chứa gen NK1 enzyme HindIII Thành phần Thể tích (µl) H2O 60.0 Đệm R 10x 15.0 eNK1(hoặc plasmid) 70.0 Hind III Tổng Điều kiện Ủ 370Ctrong 5.0 150.0 Bảng 21: Thành phần và điều kiện cho phản ứng với enzyme BamHI Thành phần Thể tích (µl) H2O 33.0 Đệm 10x Bam HI 10.0 Sản phẩm đã cắt với HindIII 54.0 Bam HI Tổng Điều kiện Ủ 370Ctrong 3.0 100.0 Qua bước cắt sản phẩm tinh High Pure Product Purification kit (Roche) và điện di kiểm tra Kết cuối thể Hình 18 Hình 18: Điên di sản phẩm cắt vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK với hai enzyme Hind III và Bam HI Giếng 1, 2, lần lươt là vector pCDNA 3, pEGFP-N1 và eNK1 không cắt; 1’, 2’, 3’: lần lươt là vect or pCDNA3, pEGFP-N1 và eNK1 sau cắt ; M1: marker kb; M2: thang chuẩn SY-500 Sau tinh , eNK1 đưa vào vector pCDNA và pEGFP-N1 với thành phần trình bày Ban̉ g 22 Bảng 22: Thành phần và điều kiện phản ứng nới cDNA mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vào vector pCDNA3 và pEGFP-N1 Thành phần Thể tích(µl) Thành phần Thể tích (µl) Đệm 10x 2.0 Đệm 10x 2.0 eNK1cắt 8.5 eNK1 cắt 10.0 Plasmid pCDNA3 cắt 8.5 Plasmid pEGFP-N1 cắt 7.0 T4 ligase 1.0 T4 ligase 1.0 Tổng 20.0 Tổng 20.0 Điều kiện: Ủ 16 0C qua đêm Hai hỗn hơp nối đươc biến nap riêng biệt vaò chun̉ g vi khuẩn E coli DH5α theo phương phaṕ sốc nhiệt (Mục 2.2.2.6) Khuẩn lạc nhận plasmid pCDNA3 mọc mơi trường có kháng sinh ampicillin (50µg/ml) Khuẩn lạc nhận plasmid pEGFP-N1 mọc mơi trường có kháng sinh Kanamycin (50µg/ml) Trên hai loại mơi trường , thu nhiều khuẩn lạc Để saǹ g loc khuẩn lac mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho NK1, chọn 14 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh ampicillin và 15 khuẩn lạc môi trường chứa kháng sinh kanamycin làm khuôn cho phản ứng PCR với căp mồi NK phần và điều kiện phản ứ ng đươc F3/ NK1 R3 Thành thể hiên Bảng 23 Bảng 23: Thành phần và điều kiện phản ứng PCR kiểm tra cDNA-NK1 thể biến nạp Thành phần H2O Thể tích (µl) 10.0 Điều kiện - Thời gian biến tính đầu tiên: Đệm 10x 1.5 94oC, phút dNTPs (2 mM) 1.0 - Lặp lại 40 chu kì: NK1 F3 (10 µM) 0.5 +Biến tính: 940C, 30 giây NK1 R3 (10 µM) 0.5 +Gắn mồi : 600C, 30 giây Taq DNA polymerase (1 u/ µl) 0.5 +Tổng hợp: 720C, 135 giây Khn 1.0 - Thời gian tổng hợp sau cùng: Tổng 15.0 720C, 10 phút Sản phẩm PCR điện di gel agarose (Hình 19 và Hình 20) Kết cho thấy với dòng vi khuẩn mang vector tái tổ hợp pCDNA3, đã thu 15 khuẩn lạc mang đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước mong ḿn (Hình 19).Với dịng chứa vector tái tổ hợp peGFP-N1, thu 13 15 khuẩn lạc chứa đoạn chèn cDNA-NK1 có kích thước mong ḿn (Hình 20) Hình 19: Điên di sản phẩm PCR kiểm tra khuẩn lac mang vector tái tổ hơp pCDNA3-NK1 Giếng 1A-14A: khuẩn lạc đánh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500 Hình 20: Điên di sả n phẩm PCR kiểm tra khuẩn lac mang vector tai tổ hơp ́ pGFPN1-NK1 Giếng 1E-15E: khuẩn lạc đánh số tương ứng ; giếng M: thang chuẩn SY-500 Như chúng đã tách dòng hai vector tái tổ hơp pCDNA 3-NK1 và pEGFPN1-NK1 mang cDNA hoàn chỉnh mã cho NK Dựa vào ảnh điện di , lựa chọn hai khuẩn lạc 11A và 5E Các vector tái tổ hợp hai khuẩn lạc này kí hiệu là pCDNA 3-NK1-11 và pEGFP-N1-NK1-5 Chúng tơi tách chiết hai loại plasmid tái tổ hợp để giải trình tư.c̣ 3.2.3 Giải trình tự gen mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 vector biểu Để khẳng định có mặt cDNA-NK1 vector biểu hiện, hai vector biểu hiên pCDNA3-NK1-11 và peGFP -N1-NK1-5 đươc giả i trình tư c̣ m ột chiều từ đầu 5’ đoạn chèn NK1 mồi của vector Kế t quả giả i trình tư c̣ cDNA-NK1 hai c̣ thố ng vector biể u hiên cho thấy 750 bp phía đầu 5’ cDNA-NK1 khơng có bấ t kỳ sư c̣ sai khá c nà o so vớ i trình tư c̣ cDNA gố c vector tách dòng pNK1-3 Điề u đó chứ ng tỏ rằ ng đã thành công việc thiết kế vector bi ểu mang cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin-1 người Việt Nam KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ KẾT LUẬN Với kết thu đưa kết luận sau: Tách dịng thành cơng cDNA hoàn chỉnh mã hóa cho thụ thể neurokinin – phổi người Việt Nam cDNA-NK1 có kích thước 1338 bp có nucleotide (ở vị trí 184, 333, 370, 641, 996) khơng giớng với trình tự cDNANK1 ngân hang liệu, chứng tỏ đa hình gen mã cho thụ thể NK1 người Việt Nam Thiết kế thành công vector biểu pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA mã cho thụ thể NK1 phân lập từ phổi người Việt Nam KIẾN NGHỊ Chuyển nhiễm vector biểu pCDNA3 và pEGFP-N1 mang cDNA-NK1 vào hệ thống tế bào động vật để biểu thụ thể neurokinin – TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Võ Thị Thương Lan (2004), Sinh học phân tử, Nhà xuất Đại học Quốc gia, Hà Nội Đinh Đoàn Long, Đỗ Lê Thăng (2008), Cơ sở di truyền học phân tử tế bào, NXB Đại học Quốc gia, Hà Nội Tiếng Anh Almeida T A., Rojo J., Nieto P M., Pinto F M., Hernandez M., Martín J D., Candenas M L (2004), “Tachykinins and tachykinin receptors: structure and activity relationships”, Bentham Science Publishers, 11, pp 2045-2081 Alberts B., Johnson A., Lewis J., et al (2002), Molecular Biology of the Cell 4th edition, New York: Garland Science Baker S J., Morris J L., Gibbins I L (2003), “Cloning of a C-terminally truncated NK-1 receptor from guinea-pig nervous system”, Brain Res Mol Brain Res., 11(1-2), pp 136-47 Berger M (2012), “The Role of Neurokinin-1 Receptor in the Microenvironment of Inflammation and Cancer”, The Scientific World Journal, 2012, pp 381434 Bonner T I., Affolter H U., Young A C., Young W S (1987), “A cDNA encoding the precursor of the rat neuropeptide, neurokinin B”, Brain Res,388, pp 243–249 Boot J D., de Haas S., Tarasevych S., et al (2007), "Effect of an NK1/NK2 receptor antagonist on airway responses and inflammation to allergen in asthma", Am J Respir Crit Care Med., 175(5), pp 450–457 Buck S H., Burcher E., Shults C W., Lovenberg W., O'Donohue T L (1984), “Novel pharmacology of substance K-binding sites: a third type of tachykinin receptor”, Science, 226(4677), pp 987–989 10 Buck S H., Helke C J., Burcher E., Shults C W., O'Donohue T L (1986), “Pharmacologic characterization and autoradiographic distribution of binding sites for iodinated tachykinins in the rat central nervous system”, Peptides, 7(6), pp 1109-1120 11 Caberlotto L., Hurd Y L., Murdock P., Wahlin J P., Melotto S., Corsi M., Carletti R.(2003), “Neurokinin receptor and relative abundance of the short and long isoforms in the human brain”, Eur J Neurosci, 17(9), pp 17361746 12 Carter M S., Krause J E (1990), "Structure, expression, and some regulatory mechanisms of the rat preprotachykinin gene encoding substance P, neurokinin A, neuropeptide K, and neuropeptide gamma", J Neurosci., 10(7), pp 2203–2214 13 Chamindi S., Nassima A D., Jennie Z M., Guobo C., Bankole A J., Ming D L (2009), “Susceptibility locus in neurokinin-1 receptor gene associated with alcohol dependence”, Neuropsychopharmacology, 34(11), pp 2442– 2449 14 Chang M M., Leeman S E (1970), “Isolation of a sialagogic peptide from bovine hypothalamic tissue and its characterization as substance P.”, J Biol Chem, 245, pp 4784–4790 15 Cinzia S., Giovanna I., Giuliana F E., Severo S.,Vittorio E (2002), “The Tachykinin Peptide Family”, Pharmacological Reviews, 54(2), pp 285- 322 16 Cao Y Q., Mantyh P W., Carlson E J., Gillespie A M., Epstein C J., Basbaum A I (1998), “Primary afferent tachykinins are required to experience moderate to intense pain”, Nature, 392(6674), pp 390-394 17 CreutzfeldtW (1996), “Carcinoid tumors: development of our knowledge”, World J Surg, 20, pp 13126–13143 18 De Felipe C., Herrero J F., O'Brien J A., Palmer J A., Doyle C A., Smith A J., Laird J M., Belmonte C., Cervero F., Hunt S P (1998), “Altered nociception, analgesia and aggression in mice lacking the receptor for substance P”, Nature., 392(6674), pp 394-397 19 Erspamer V (1949), “Ricerche preliminari sulla moschatina”, Experientia, 5, pp 79 20 Erspamer V (1994), “Bioactive secretions of the integument in Amphibian Biology I The Integuments, eds Heatwole H., Barthalmus G T., Surrey Beatty & Sons, Chipping Norton, NSW, Australia, pp 178–350 21 Euler U S., Gaddum J H (1931), “An unidentified depressor substance in certain tissue extracts”, J Physiol., 72(1), pp 74–87 22 Fong T M., Anderson S A., Yu H., Huang R R., Strader C D (1992), “Differential activation of intracellular effector by two isoforms of human neurokinin-1 receptor”, Mol Pharmacol, 41(1), pp 24-30 23 Gerard N P., Eddy R L J., Shows T B., Gerard C (1990), “The human neurokinin A (substance K) receptor Molecular cloning of the gene, chromosome localization, and isolation of cDNA from tracheal and gastric t issues”, J Biol Chem, 265(33), pp 20455-20462 24 Gerard N P., Garraway L A., Eddy R L., Shows T B, (1991), “Human substance P receptor (NK-1): organization of the gene, chromosome localization and functional expression of cDNA clones”, Biochemistry, 30(44), pp 10640-10646 25 Groneberg D A., Harrison S., Dinh Q T., Geppetti P., Fischer A (2006), "Tachykinins in the respiratory tract", Curr Drug Targets, 7(8), pp 1005– 1010 26 Guard S., WatsonS P (1991), “Tachykinin receptor types: classification and membrane signaling mechanism”, Neurochem Int, 18, pp 149–165 27 Ho W Z., Lai J P., Zhu X H., Uvaydova M., Douglas S D (1997), “Human monocytes and macrophages express substance P and neurokinin- receptor”, Journal of Immunology, 159, pp 5654–5660 28 Hopkins B P., Steven J D., Petra B., Ian G., Alexander (1991), “Isolation and characterisation of the human lung NK-1 receptor cDNA”, Biochemical and Biophysical Research Communications, 180(2), pp 1110-1117 29 Hurowitz E H., Melnyk J M., Chen Y J., Kouros-Mehr H., Simon M.I., Shizuya H (2000), "Genomic characterization of the human heterotrimeric G protein alpha, beta, and gamma subunit genes", DNA Res, 7(2), pp 111–120 30 Jian P L., Saien L., Florin T., Morris F T., Laurie E K., Susan E L., Steven D D (2008), “Differences in the length of the carboxyl terminus mediate function properties of neurokinin-1 receptor”, Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of America, 105 (34), pp 12605-12610) 31 Kangawa K., Minamino N., Fukuda A., Matsuo H (1983), “Neuromedin K: a novel mammalian tachykinin identified in porcine spinal cord”, Biochem Biophys Res Commun., 114(2), pp 533-540 32 Kathryn E M., Catherine D S., Tung M F (1994), “Expression and solubilization of a recombinant human neurokinin-1 receptor in insect cells”, Journal of receptor research, 14(1), pp 63-73 33 Kimura S., Goto “Pharmacological K., Ogawa T., characterization of Sugita Y., novel Kanazawa mamamlian (1984), tachykinin, neurokinin alpha and neurokimin beta”, Neuroscience Research, 2, pp 97104 34 Marcinkiewicz N., Seidah N G., Chretien M (1993), “Les convertases des prohormones et le systéme nerveus”, Médecine/Science (Wash DC), 9, pp 553–561 35 Nakajima Y., Tsuchida K., NegishiM., Ito S., Nakanishi S (1992), “Direct linkage of three tachykinin receptors to stimulation of both phosphatidylinositol hydrolysis and cyclic AMP cascades in transfected Chinese hamster ovary cells”, J Biol Chem, 267, pp 2437–2442 36 Nakanishi S (1987), “Substance P precursor and kininogen: their structures, gene organizations and regulation”, Physiol Rev, 67, pp 1117–1142 37 Nawa H., Kotani H., Nakanishi S (1984), “Tissue-specific generation of two preprotachykinin mRNAs from one gene by alternative RNA splicing”, Nature (Lond), 312, pp 729–734 38 Oka Y., Saraiva L R., Kwan Y Y., Korsching S I (2009), “The fifth class of G alpha proteins”, Proc Natl Acad Sci USA, 106(5), pp 1484-1489 39 Page N M (2004), “Hemokinins and endokinins”, Cell Mol Life Sci, 61, pp 1652-1663 40 Pernow B (1983), “Substance P”, Pharmacol Rev, 35(2), pp 85-141 41 Rosso M., Mu˜noz M (2006), "Pharmacology Guide: In vitro pharmacology: concentration-response curves.", GlaxoWellcome 42 Quartara L.; Maggi C A (1997), "The tachykinin NK1 receptor Part I: Ligands and mechanisms of cellular activation", Neuropeptides, 31(6), pp 537–563 43 Rogers M P., Blackburn L (2010), “Use of neurokinin-1 receptor antagonists in patients receiving moderately or highly emetogenic chemotherapy”, Clin J Oncol Nurs., 14(4), pp 500-504 44 Rupnipak M J N, Kramer M S, (2002), “Substance P and related tachykinins”, Neuropsychopharmacology: The Fifth Generation of Progress, pp 169 – 177 45 Severini C., Salvadori S., Guerrini R., Falconieri-Erspamer G., Mignogna G., ErspamerV (2000), “Parallel bioassay of 39 tachykinins on 11 smooth muscle preparations Structure and receptor selectivity/affinity relationship”, Peptides, 21, pp 1587–1595 46 Spiegel A M (1987), “Signal transduction by guanine nucleotide binding proteins”, Mol Cell Endocrinol, 49(1), pp 1-16 47 Steiner D F., Smeekens S P., Ohagi S., Chan S J (1992), “The new enzymology of precursor processing endoproteases”, J Biol Chem,267, pp 23435–23438 48 Steven D D Kenvin G L, Jian P L (2008), “Neurokinin-1 receptor mARN expression diffirences in brains of HIV-infected individuals”, Journal of the neurological sciences, 272(1-2), pp 174-177 49 Stratowa C., Machat H., Burger E., Himmler A., Schafer R., Spevak W., Weyer U., Wiche-Castanon M., Czernilofsky A P (1995), “Functional characterization of the human neurokinin receptor NK1, NK2, NK3 based on a cellular assay system”, J of receptor and signal transduction research, 15(1-4), pp 617-630 50 Studer R., Trzeciak A., Lergier W (1973), “Isolierung und Aminosauren Sequenz von Substanz P aus Pferdedarm”, Helv Chim Acta, 56, pp 860– 866 51 Tae H J., Mathis G., Inhae J (1998) “G protein – coupled receptors”, The Journal of Biological Chemistry, 273(28), pp 17299-17302 52 Vassilatis D K., Hohmann J G., Zeng H., Li F., Ranchalis J E., Mortrud M T., Brown A., Rodriguez S S., Weller J R., Wright A C., Bergmann J E., Gaitanaris G A., (2003), “The G protein-coupled receptor repertoires of human and mouse”, PNAS, 100, pp 4903–4908 53 Wettschureck N., Offermanns S (2005), "Mammalian G proteins and their cell type specific functions", Physiol Rev., 85(4), pp 1159–204 54 Yu Z., Liwei L., Caren F., Gillian E W., Christopher J P (2000), “Hemokinin is a hematopoietic-specific tachykinin that regulates B lymphopoiesis”, Nature Immunology, 1, pp 392 – 397 55 Zimmer A., Zimmer A M., Baffi J., Usdin T., Reynolds K., König M., Palkovits M., Mezey E (1998), “Hypoalgesia in mice with a targeted deletion of the tachykinin gene”, Proc Natl Acad Sci USA., 95(5), pp 2630-2635 Trang web 56 http://gpcr.scripps.edu/ 57 http://www.nobelprize.org/nobel_prizes/medicine/laureates/1994/press.html 58 http://www.uniprot.org/uniprot/P25 59 http://www.ncbi.nlm.nih.gov/nuccore/M81797.1 60 http://themedicalbiochemistrypage.org/signal-transduction.php 61 http://pharmrev.aspetjournals.org/content/54/2/285/T5.expansion.ht 62 the neurokinin-1 receptor www.pnas.org ... hành đề tài ? ?Tách dòng thiết kế vector biểu gen mã hóa cho thụ thể neurokinin – người Việt Nam? ?? 1. 5 VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ HĨA CHO THỤ THỂ NEUROKININ- 1 Gen mã hóa cho thụ thể liên kết với G protein... 2 012 MỤC LỤC MỞ ĐẦU Ch¬ng TỔNG QUAN TÀI LIỆU 11 1. 1 THỤ THỂ LIÊN KẾT VỚI G PROTEIN 11 1. 1 .1 G protein 11 1. 1.2 Thụ thể liên kết với G protein 11 1. 2... neurokinin- 1 49 3.2 THIẾT KẾ VECTOR BIỂU HIỆN GEN MÃ CHO THỤ THỂ NEUROKININ- 1 49 3.2 .1 Thiết kế mồi 49 3.2.2 Tách dòng vector biểu mang cDNA mã hóa cho th ụ thể neurokinin-