DANH MỤC CÁC CHỮ VIẾT TẮT
MỞ ĐẦU
CHƢƠNG 1. TỔNG QUAN TÀI LIỆU
1.1. Nhiễm khuẩn huyết
1.1.1. Khái niệm, lịch sử và tình hình nhiễm khuẩn huyết trên thế giới và Việt Nam
Bảng 1.1 Tiêu chí đặt tên của ACCP / SCCM [16]
1.1.2. Dấu hiệu của nhiễm khuẩn huyết
1.2. Tác nhân vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết thƣờng gặp
1.2.2. Acinetobacter baumannii
1.2.3. Klebsiella pneumoniae
1.2.4. Pseudomonas aeruginosa
1.2.5. Escherichia coli
1.3. Các phƣơng pháp chẩn đoán nhiễm khuẩn huyết
1.3.2. Lai huỳnh quang tại chỗ
1.3.3. Các kỹ thuật khuếch đại DNA
1.3.3.1. Kỹ thuật PCR
1.3.3.2. Kỹ thuật Mutiplex PCR
1.3.3.3. Kỹ thuật Broad-range PCR
1.3.3.4. Kỹ thuật Real-time PCR
1.3.4. Giải trình tự
1.4. Multiplex PCR và ứng dụng
1.4.1. Giới thiệu chung về multiplex PCR
1.4.2. Các loại phản ứng multiplex PCR
Hình 1.7. Mô hình mô tả phản ứng multiplex PCR
1.4.3. Thiết kế mồi cho phản ứng multiplex PCR
1.4.4. Ƣu điểm của phƣơng pháp multiplex PCR
1.4.5. Tối ƣu hóa các thành phần cho phản ứng multiplex PCR
1.4.6. Ứng dụng của phản ứng multiplex PCR
1.4.7. Tình hình ứng dụng kỹ thuật PCR trong việc xác định các tác nhân nhiễm khuẩn huyết
CHƢƠNG 2. VẬT LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU
2.1. Vật liệu
2.1.1. Hóa chất và sinh phẩm
Bảng 2.1. Trình tự Nucleotide của các cặp mồi
2.1.2. Thiết bị
2.2. Phƣơng pháp nghiên cứu
2.2.1. Thiết kế primer
2.2.2. Tách chiết DNA
2.2.2.1. Tách chiết DNA từ các chủng vi khuẩn nuôi cấy bằng Kit QIAgen
2.2.2.2. Tách chiết DNA từ mẫu bệnh phẩm cấy máu bằng phương pháp đun sôi
2.2.2.3. Tách chiết DNA từ mẫu máu của bệnh nhân nghi nhiễm khuẩn huyết bằng kit tách DNA từ máu của QIAgen
2.2.3. Phƣơng pháp làm giàu DNA vi khuẩn
2.2.4. Xác định nồng độ DNA
2.2.5. Phƣơng pháp điện di DNA trên gel agarose
2.2.6. Phƣơng pháp PCR
2.2.7. Phƣơng pháp giải trình tự gen
2.2.8. Đạo đức trong nghiên cứu
CHƢƠNG 3. KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN
3.1. Kết quả lựa chọn và thiết kế mồi đặc hiệu gen đích
Bảng 3.1. Trình tự mồi và kích thƣớc sản phẩm PCR theo tính toán lý thuyết
3.2. Kết quả kiểm tra các cặp mồi bằng thực nghiệm
3.2.1. Kiểm tra DNA tổng số tách chiết từ các chủng vi khuẩn
3.2.2. Kết quả PCR kiểm tra từng cặp mồi đơn trên các chủng vi khuẩn đích
Hình 3.2. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích của các chủng vi khuẩn gây nhiễm khuẩn huyết tƣơng ứng.
3.2.4. Kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi
A B
3.2.5 Kết quả kiểm tra tính đặc hiệu của các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR
Hình 3.4. Kiểm tra tính đặc hiệu giữa các cặp mồi và các gen đích trong phản ứng multiplex PCR.
3.3. Kết quả tối ƣu phản ứng multiplex PCR xác định đồng thời 5 vi khuẩn đích
Hình 3.5. Tối ƣu nồng độ mồi cho phản ứng multiplex PCR.
3.3.2. Kết quả tối ƣu nhiệt độ gắn mồi của phản ứng multiplex PCR
Hình 3.6. Tối ƣu nhiệt độ gắn mồi cho phản ứng multiplex PCR
3.3.3. Kết quả lựa chọn Master Mix trong phản ứng multiplex PCR
Hình 3.7. Lựa chọn thành phần Mastermix trong phản ứng multiplex PCR
3.4. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các chủng nhiễm khuẩn thuần
Bảng 3.2. Kết quả thử nghiệm phản ứng multiplex PCR
3.5. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm
Hình 3.8. Thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên mẫu bệnh phẩm cấy máu.
Bảng 3.3. So sánh kết quả multiplex PCR trên các mẫu bệnh phẩm cấy máu
3.5.2. Kết quả thử nghiệm phƣơng pháp multiplex PCR trên các mẫu lâm sàng
KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ