Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega 3 6 từ chủng vi tảo biển dị dưỡng việt nam schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho con người

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Lê Thị Thơm NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC HÀ NỘI – 2021 BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO VIỆN HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VIỆT NAM HỌC VIỆN KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Lê Thị Thơm Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG VIỆT NAM Schizochytrium mangrovei TB17 ĐỂ LÀM THỰC PHẨM BẢO VỆ SỨC KHỎE CHO CON NGƯỜI” Chuyên ngành: Hóa sinh học Mã số: 42 01 16 LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC NGƯỜI HƯỚNG DẪN KHOA HỌC: GS TS Đặng Diễm Hồng Hà Nội – 2021 i LỜI CẢM ƠN Lời đầu tiên, tơi xin bày tỏ lịng kính trọng biết ơn sâu sắc tới GS TS Đặng Diễm Hồng, ngun Trưởng Phịng Cơng nghệ Tảo - Viện Công nghệ Sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Công nghệ Việt Nam - người thầy định hướng, bảo tận tình kiến thức khoa học, tận tâm giúp đỡ tinh thần, vật chất, động viên tơi vượt qua nhiều trở ngại khó khăn để hồn thành luận án suốt năm qua Tơi trân trọng cảm ơn đến Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ sinh học, phận đào tạo Viện Công nghệ sinh học, Ban lãnh đạo Học viện Khoa học Cơng nghệ Việt Nam, phịng đào tạo học Viện Khoa học Công nghệ thầy cô giáo tham gia giảng dạy tạo điều kiện giúp đỡ, truyền đạt kiến thức cho suốt trình học tập nghiên cứu Tơi xin chân thành cảm ơn anh chị, bạn đồng nghiệp cơng tác phịng Cơng nghệ Tảo: TS Hồng Thị Minh Hiền, TS Ngơ Thị Hồi Thu, TS Hoàng Thị Lan Anh, TS Lưu Thị Tâm, TS Nguyễn Cẩm Hà, ThS Đinh Thị Ngọc Mai … cho tơi lời khun chân thành, đóng góp ý kiến giúp đỡ tơi hồn chỉnh số liệu luận án Tôi xin cảm ơn Khoa Dược lý – Học viện Quân Y giúp đỡ số thử nghiệm động vật thực nghiệm, TS Đồn Lan Phương – Viện Hóa học Các hợp chất Thiên nhiên - phân tích hàm lượng axít béo, Tổng cục Tiêu chuẩn Đo lường Chất lượng - kiểm tra chất lượng dầu, Công ty Cổ phần Dược phẩm Novaco - bao viên, đóng gói hồn thiện sản phẩm Luận án thực khuôn khổ đề tài cấp Bộ Cơng Thương “Nghiên cứu quy trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo omega-3 omega-6 (EPA, DHA, DPA) từ sinh khối vi tảo biển dị dưỡng” năm 2013 - 2015 thuộc Đề án phát triển ứng dụng công nghệ sinh học lĩnh vực công nghiệp chế biến đến năm 2020 PGS TS Đặng Diễm Hồng làm chủ nhiệm Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn đến gia đình, bạn bè người thân bên cạnh chia sẻ, động viên, giúp đỡ tạo điều kiện tốt cho tơi học tập, nghiên cứu hồn thành luận án Hà Nội, ngày tháng năm 20 Nghiên cứu sinh Lê Thị Thơm ii Lời cam đoan Tôi xin cam đoan: Đây cơng trình nghiên cứu số kết cộng tác với cộng khác Các số liệu kết trình bày luận án trung thực, phần cơng bố tạp chí khoa học chuyên ngành với đồng ý cho phép đồng tác giả Phần lại chưa cơng bố cơng trình khác Hà Nội, ngày tháng Tác giả Lê Thị Thơm năm 20 iii MỤC LỤC MỞ ĐẦU…… ………………………………………………………… CHƯƠNG TỔNG QUAN TÀI LIỆU………… …………………… 1.1.Giới thiệu chung axit béo, vai trò, nguồn gốc đường sinh tổng hợp axít béo…………………… ………………………………… Giới thiệu chung axit béo …… ……… ……… …………………… 1.1.1 Vai trò ứng dụng PUFAs………………….………………………… 1.1.2 Nguồn cung cấp PUFAs 1.1.3 Con đường sinh tổng hợp PUFAs vi tảo ………………………………… 14 1.1.4 1.2 Vi tảo biển dị dưỡng, công nghệ nhân nuôi sinh khối điều kiện ảnh hưởng đến trình nhân ni sinh khối ………………………… 18 1.2.1 Vị trí phân loại đặc điểm chi Schizochytrium …………… 18 1.2.2 Công nghệ nhân nuôi sinh khối vi tảo biển dị dưỡng giới………… 20 1.2.3 Công nghệ nhân nuôi sinh khối chi Schizochytrium quy mô khác sản xuất thương mại DHA……… 22 1.2.4 Một số điều kiện ảnh hưởng đến trình sinh trưởng sản xuất DHA thraustochytrid, đặc biệt chi Schizochytrium 24 1.3 1.3.1 1.3.2 1.3.3 1.3.4 Các phương pháp tách chiết, tinh PUFAs, bảo quản dầu………… 26 Các phương pháp tách chiết dầu thơ có chứa PUFAs……………….……… 26 Các phương pháp thủy phân dầu từ dầu thô ……….…………… 29 Các phương pháp tinh PUFAs, DHA, EPA, DPA ………………… 30 Bảo quản axit béo…………………… …………….……… ………… 33 1.4 Nghiên cứu tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập dầu tách chiết từ Schizochutrium người động vật … 35 Tình hình sản xuất tách chiết PUFAs từ VTBDD Việt Nam …… 36 CHƯƠNG VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU……… 38 Vật liệu…………………………………………………………………… 38 Chủng tảo điều kiện nhân nuôi sinh khối …………………………………… 38 Động vật thí nghiệm 38 Sinh khối tảo cặp mồi đặc hiệu 38 Địa điểm nghiên cứu 39 Hóa chất thiết bị sử dụng…………………………………… 39 Hóa chất…………………………………………………………………………… 39 Các dụng cụ thiết bị sử dụng………………………………………………… 39 Môi trường……………………………………………………………… 40 1.5 2.1 2.1.1 2.1.2 2.1.3 2.1.4 2.2 2.2.1 2.2.2 2.3 iv 2.4 2.4.1 2.4.2 2.4.3 2.4.4 2.5 2.5.1 2.5.2 2.5.3 2.5.4 2.5.5 2.5.6 2.6 Phương pháp nghiên cứu ……………………………………………… 41 Sàng lọc nhân nuôi sinh khối chủng tiềm hệ thống lên men khác cho tích lũy axit béo ω - cao ……………… 41 Phương pháp tách chiết lipit làm giàu hỗn hợp axít béo giàu ω - 44 Xác định tiêu chất lượng dầu……………………………………… 47 Tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên Algal oil omega (AOO-3-6) 50 Bố trí thí nghiệm 51 Sàng lọc nhanh chủng/loài tiềm cho sản xuất sinh khối giàu axit béo ω - 6……………………………………………………………………………… 51 Thí nghiệm nghiên cứu đặc điểm sinh lý, sinh hóa chủng tiềm năng… 52 Nhân ni sinh khối chủng S mangrovei TB17 hệ thống lên men khác (1, 5, 10, 30 150 Lít)……………………………………………… 52 Nghiên cứu ảnh hưởng số điều kiện đến q trình tách chiết dầu sinh học giàu axít béo ω - 54 Nghiên cứu khả bảo quản chất chống oxy hóa lên chất lượng dầu sinh học omega-3 omega-657 Nghiên cứu tính an tồn tác dụng tăng cường trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 57 3.1.7 Xử lý số liệu 58 CHƯƠNG KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN…………………………… 59 Sàng lọc chủng/loài tiềm lựa chọn điều kiện nhân ni sinh khối thích hợp quy mơ khác ………………………………… 59 Sàng lọc nhanh chủng/lồi tiềm cho sản xuất sinh khối giàu axit béo omega - 6………………………………………………………………………… 59 Lựa chọn điều kiện nhân ni sinh khối thích hợp chủng TB17 quy mơ bình tam giác lên sinh trưởng tích lũy axit béo…………………………… 62 Nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 10 Lít ……………… 68 Nhân ni sinh khối hệ thống lên men 30 Lít ……………………………… 70 Nhân nuôi sinh khối hệ thống lên men 150 Lít ………………………… 72 Các phương pháp nhân ni khác để cung cấp sinh khối giàu axít béo ω – 6………………………………………………………………………… 74 Thu hoạch sinh khối chủng S mangrovei TB17 ……………… 80 3.2 3.2.1 3.2.2 3.2.3 Tách chiết dầu sinh học giàu axit béo ω - từ SKK chủng TB17 …… 82 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng FFA …… 82 Sản xuất dầu sinh học giàu axít béo ω - dạng methyl este … 94 So sánh phương pháp tách chiết dầu (dạng FFA dạng methyl ester) từ 3.1 3.1.1 3.1.2 3.1.3 3.1.4 3.1.5 3.1.6 v sinh khối tươi SKK…………………… 3.2.4 Sản xuất đánh giá chất lượng dầu sinh họ mô 100g SKK/mẻ ……………………………… 3.3 Các điều kiện bảo quản dầu, sản xuất viên an toàn, tác dụng tăng cường trí nhớ, khả mềm AOO-3-6……………………………… Ảnh hưởng chất chống oxy hóa đến q axit béo ω - 6……………………………… 3.3.1 3.3.2 Nghiên cứu sản xuất viên nang mềm algal oil giàu axit béo ω – …… 3.3.3 Nghiên cứu tính an toàn tác dụng tăng cườ viên dầu tảo AOO-3-6……………………… KẾT LUẬN VÀ KIẾN NGHỊ……………… CÁC CƠNG TRÌNH KHOA HỌC ĐÃ CÔ TÀI LIỆU THAM KHẢO………………… PHỤ LỤC…………………………………… MỞ ĐẦU Hiện nay, nhu cầu sống đòi hỏi cao giá trị dinh dưỡng người khơng sử dụng loại dầu ăn thơng dụng mà cịn loại dầu đặc sản có giá trị cao (dầu salad, dầu chức năng) để phục vụ cho ăn cao cấp, nguyên liệu cho công nghiệp thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm Các loại dầu từ thực vật chứa axít béo khơng bão hịa có mạch cacbon ≤ 18 Trong loại dầu thực vật dầu lanh, canola đậu tương chứa axit béo khơng bão hịa đa nối đơi dạng omega-3 (polyunsaturated fatty acid omega 3; PUFAs ω-3) chủ yếu axít α-linolenic (ALA) loại dầu khác dầu bắp, dầu hạt vải, dầu nho…lại chứa chủ yếu PUFAs ω - Đối với loại axít béo ω-3 có số cacbon lớn 20 22 chủ yếu lại có nguồn gốc từ cá biển Nguồn cung cấp axít béo docosahexaenoic (DHA; C22:6) eicosapentaenoic (EPA; C20:5) loài cá nhiều mỡ cá trích, cá thu cá hồi Tuy nhiên, chất lượng dầu cá biển tự nhiên lại phụ thuộc vào lồi cá, mùa vụ vị trí đánh bắt Việc sử dụng dầu PUFAs có nguồn gốc từ cá phần thức ăn, kể cho trẻ nhỏ dược phẩm gặp số bất lợi có mặt tạp nhiễm polychlorinated biphenyls (PCBs) dioxin, kim loại nặng… mùi vị đặc trưng cá gây Hơn nữa, dầu cá biển thực tế hỗn hợp phức tạp axít béo có chiều dài mạch cacbon mức độ chưa bão hoà khác Do vậy, việc tinh chúng khó khăn địi hỏi chi phí tốn trước sử dụng chúng vào mục đích khác nâng cao giá trị sử dụng sản phẩm tạo so với giá trị ban đầu Dầu sinh học giàu PUFAs ω - sản xuất từ số loài vi tảo thu hút quan tâm nghiên cứu dần có vị trí đáng kể, không ngừng mở rộng phát triển mạnh mẽ thị trường thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người, dược phẩm giới nói chung Việt Nam nói riêng Vi tảo biển (VTB) sử dụng với nhiều mục đích khác nhau: khai thác chất có hoạt tính sinh học, để xử lý mơi trường, làm phân bón, nhiên liệu sinh học ứng dụng rộng rãi nuôi trồng thủy sản (NTTS) với số loài VTB quang tự dưỡng truyền thống Tuy nhiên, việc ni trồng VTB quang tự dưỡng có chi phí cao làm cho giá thành sản xuất sản phẩm từ sinh khối tảo có giá thành đắt, gây hạn chế cho việc thương mại hóa quy mô lớn Để khắc phục nhược điểm nêu trên, việc tìm kiếm, khai thác ứng dụng lồi vi tảo biển dị dưỡng (VTBDD) có chi Schizochytrium thu hút nhiều quan tâm nghiên cứu nhà khoa học nước mẻ Việt Nam hứa hẹn mang đến nhiều lợi ích thực tiễn cho đời sống người Các loài VTBDD thuộc chi Schizochytrium có khả tích lũy hàm lượng lipit cao, lên tới 70% sinh khối khô (SKK) hàm lượng -3 PUFAs EPA, DHA chiếm 30-50% so với axít béo tổng số (Total fatty acid - TFA) Vai trò của-3 PUFAs nêu chứng minh nhiều khía cạnh phát triển trí não trẻ nhỏ, sức khỏe hệ tim mạch, hệ thần kinh nhiều liệu pháp điều trị bệnh ung thư, trí nhớ, trầm cảm Hiện nay, chi VTBDD Schizochytrium coi ứng cử viên tiềm thay nguồn sản xuất-3 PUFAs truyền thống từ dầu cá Ở Việt Nam, nghiên cứu nhân nuôi sinh khối, tách chiết ứng dụng axít béo từ VTBDD cịn mẻ có nhiều tiềm ứng dụng Chính vậy, chúng tơi thực đề tài “Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Việt Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người” Mục tiêu nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng/loài VTBDD tối ưu điều kiện nhân nuôi sinh khối để thu sinh khối giàu axít béo ω - 6; Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axit béo ω - từ loài vi tảo biển dị dưỡng lựa chọn được; Sản xuất viên nang dầu sinh học giàu axít béo ω - có tính an toàn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên nang động vật thực nghiệm Sàng lọc chủng tiềm giàu axít béo ω - từ lồi VTBDD Việt Nam; tối ưu điều kiện nhân nuôi thu sinh khối chủng tiềm quy mơ bình tam giác, hệ thống khác (5, 10, 30 150 Lít); Tối ưu điều kiện tách chiết, tinh bảo quản dầu sinh học giàu axít béo ω - nhằm cung cấp nguyên liệu đảm bảo chất lượng ứng dụng làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người; Sản xuất viên nang Algae oil omega - (AOO-3-6) từ dầu sinh học giàu axít béo ω - đảm bảo chất lượng, có tính an tồn cao đánh giá tác dụng cải thiện trí nhớ, khả học tập viên AOO-3-6 mơ hình động vật thực nghiệm Những đóng góp luận án Luận án cơng trình Việt Nam nghiên cứu cách bản, có hệ thống về: sàng lọc, nhân nuôi sinh khối chủng vi tảo biển dị dưỡng tiềm Schizochytrium mangrovei TB17 phân lập tỉnh Thái Bình, Việt Nam có hàm lượng PUFAs ω - cao, DHA chiếm 42,68 ±1,76% so với TFA axit docosapentaenoic (DPA) chiếm 11,02 ± 1,14% so với TFA; lựa chọn điều PL-34 PL-35 PL-36 PL-37 PL-38 PL-39 PL-40 PL-41 PL-42 PL-43 PL-44 PL-45 PL-46 PL-47 PL-48 ... ? ?Nghiên cứu dầu sinh học giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? với mục đích lựa chọn chủng tiềm... giàu axit béo omega - từ chủng vi tảo biển dị dưỡng Vi? ??t Nam Schizochytrium mangrovei TB17 để làm thực phẩm bảo vệ sức khỏe cho người? ?? Mục tiêu nghiên cứu luận án Sàng lọc chủng/ loài VTBDD tối... TẠO VI? ??N HÀN LÂM KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ VI? ??T NAM HỌC VI? ??N KHOA HỌC VÀ CÔNG NGHỆ - NCS Lê Thị Thơm Đề tài: “NGHIÊN CỨU DẦU SINH HỌC GIÀU AXIT BÉO OMEGA - TỪ CHỦNG VI TẢO BIỂN DỊ DƯỠNG