Tài liệu Máy điện di_chương 15 docx

321 Chỉång 15 MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di dng âãø phạt hiãûn v xạc âënh ADN trong tãú bo vi sinh váût, thỉûc váût v âäüng váût. 15.1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC (ADN) V NGUN TÀÕC XẠC ÂËNH Gen l âån vë di truưn cå bn. Nọ l mäüt âoản ADN (âäi khi ARN) m hoạ thäng tin cho viãûc täøng håüp sn pháøm sinh hc xạc âënh (ch úu l protein). Nhỉỵng nghiãn cỉïu hiãûn âải vãư cáúu trục v chỉïc nàng ca ngun sinh cháút â måí ra nhỉỵng hiãøu biãút måïi vãư cáúu tảo v chỉïc nàng hoảt âäüng ca tãú bo. Cáúu trục ADN cho phẹp gii thêch tải sao lải cọ kh nàng tng trỉỵ v di truưn thäng tin tỉì thãú hãû ny sang thãú hãû khạc mäüt cạch äøn âënh v bàòng cạch no nọ thäng tin di tuưn åí dảng thỉï tỉû sàõp xãúp cạc gäúc nucleotit lải chuøn hoạ thnh phán tỉí protein chỉïc nàng. Näüi dung nãu trãn liãn quan âãún giạo l trung tám ca di truưn phán tỉí gäưm 3 âiãøm chênh: sao chẹp thäng tin di truưn tỉì ADN bäú mẻ sang ADN con cại, chuøn âäøi m di truưn tỉì ADN sang ARN - quạ trçnh phiãn m (transcription) v dëch m di truưn (translation) - thäng tin di truưn tỉì mARN âỉåüc chuøn sang trçnh tỉû sàõp xãúp âàûc hiãûu ca axit amin trong phán tỉí protein. Cäng nghãû ADN tại täø håüp - hiãûn l nãưn tng cho sỉû phạt triãøn nhỉ v bo ca ngnh cäng nghãû sinh hc hiãûn âải. Cạc phỉång phạp phán têch v täøng håüp hiãûn âải l tạch DNA, xạc âënh thỉï tỉû, täøng håüp, gàõn xen nọ vo vë trê nháút âënh bãn trong såüi ADN khạc âãø nhán lãn, v räưi lải tạch ra. Hiãûn nay hon ton cọ thãø nháûn biãút chênh xạc nhỉỵng âoản ADN âàûc hiãûu qua cháøn âoạn cạc bãûnh âàûc biãût. Âäúi våïi cạc bãûnh khi cạc gel chỉa âỉåüc xạc âënh thç viãûc cháøn âoạn kẹm chênh xạc. Mäüt bäü d tçm âån gin chè l mäüt khục ADN (hồûc ARN) cọ thãø tçm khục bäø sung våïi nọ bàòng cạch lai (hybridization). Cọ thãø phạt hiãûn sỉû bàõt càûp ny bàòng nhiãưu cạch, nhỉng phäø biãún nháút l sỉí dủng phỉång phạp tỉû chủp phọng xả våïi bäü d tçm cọ 32p (hçnh 15.1). 322 Viãûc lai bäü d tçm ADN våïi âoản ADN tạch råìi gi l Southern Blotting âỉåüc mä t trãn hçnh 15.1. Cạc âoản ADN hçnh thnh sau khi ADN bë endonucleaza restrictaza càõt s âỉåüc tạch råìi ra bàòng phỉång phạp âiãûn di trãn gel agaroza. Khong cạch di chuøn phủ thüc vo kêch thỉåïc âoản. Cng nh chảy cng nhanh. Sau khi â tạch råìi, ngỉåìi ta dng kiãưm âãø lm biãún tênh cạc âoản âọ v chuøn chụng lãn mng nylon. Táúm mng ny âỉåüc våïi dung dëch cọ cháút d tçm cháút phọng xả, nọ chè lai våïi cạc âoản ADN no chỉïa thỉï tỉû bäø sung. Viãûc xạc âënh thỉï tỉû ARN (vê dủ mARN) cng cọ thãø theo trçnh tỉû tạch bàòng âiãûn di ARN trãn gel, chuøn lãn mng nylon v cho lai våïi ADN probe âàûc hiãûu. Phỉång pha ïp ny gi l Northern Blotting. Hçnh 15.1. Lai “bäü d tçm” våïi âoản ADN, tạch ra bàòng âiãûn di v chuøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15.2. CÁÚU TRỤC CA MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di gäưm ba bäü pháûn cå bn: khay váûn hnh (hçnh 15.2), nàõp cọ âiãûn thãú cao v bưng gim xäúc. N hỉỵng âoản ADN s au khi càõt bàòng endonucleasa Tạch âiãûn di trãn gel agarosa B iãún tênh bàòng kiãưm âãø tạch såüi trung ho Cạc âoản AD N tạch ra theo kêch thỉåïc Vë trê âoản ADN chỉïa thỉ tỉû tỉång âäưng probe nhán dng  ënh vë A DN bàòng tia UV U Í vãût cọ ADN nhán dng såüi âån v cọ gàõn p họng xả R ỉía v s ỉû chủp p họng xảû P h bàòng mng nylon 323 Khay váûn hnh bao gäưm khn âục gel, khay di âäüng trong sút v bt âãûm bàòng caosu. Chøn bë khn gel nhỉ sau: lọt miãúng bt âãûm vo âạy khay di âäüng v sau âọ áún mảnh miãúng âãûm vo cảnh khay (ẹp cho âạy khay di âäüng lt hon ton vo khay khn trỉåïc khi hn kên vo miãúng bt). Trãn nàõp cọ âáưu ra ca m mu, âỉåüc näúi våïi ngưn âiãûn qua âiãûn cỉûc trãn âãú mạy (hçnh 15.3). Bưng gim xäúc cọ äúng näúi âiãûn cỉûc, bủc di chuøn v läù nảp etylen glycol / nỉåïc våïi t lãû 50/50 (hçnh 15.4). Ä Ú ng näúi âiãûn cỉûc B ủc di chuøn (häù tråü khay váûn hnh) N åi (läù) nảp 50/50 etylen g lycol / nỉåïc vo H çnh 15.4. B ưng gim xäúc H çnh 15.2. Khay váûn hnh UV khay di âäüng trong sút Miãúng bt âãûm K hn âục ge l M mu âáưu ra näúi âiãûn cỉûc trãn âãú mạy våïi ngưn âiãûn N àõp thiãút bë H çnh 15.3. Nàõp cọ âiãûn thãú cao 324 15.3. CU TRUẽC VN HAèNH 15.3.1. Chuỏứn bở dung dởch - Chuỏứn bở 250 ml dung dởch õóỷm. Hai dung dởch õóỷm õổồỹc sổớ duỷng phọứ bióỳn cho õióỷn di ADN õổồỹc chuỏứn bở theo cọng thổùc pha chóỳ dổồùi õỏy. 1. 10X Tris- borate-EDTA. Nguọửn cung cỏỳp chỏỳt õóỷm: (0,89 M tris; 0,89 M axit boric; 20 mM EDTA; pH- 8,2; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,89 M 108, 0g Axit boric (FW61.8): 0,89M 55,0 g Dung dởch EDTA: (0,5M; pH 8,0) 0,02M 40,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml pH luọn luọn giổợ ồớ 8,2 Trổồùc khi sổớ duỷng vồùi dung dởch loaợng 0,5 X vồùi 45 mM base tris; 45 mM axit boric vaỡ 1 mM EDTA thổồỡng duỡng pha loaợng bồới vỗ nổồùc coù nhióỷt õọỹ thỏỳp 1X vồùi 89 mM base tris; 89 mM axit boric vaỡ 2 mM EDTA. 2. 10X Tris- acetate -EDTA Cung cỏỳp cho chỏỳt õóỷm (0,4 M tris; 0,2 M axit axetic; 10 mM EDTA; pH- 8,4; 1000 ml) Tris base(FW 121.1): 0,40 M 48,8 g Axit axetic (99,5%): 0,20 M 114,1 ml Dung dởch EDTA (0,5M; pH 0,8): 0,01M 20,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 1000,0 ml Khuỏỳy õóửu õổỡng laỡm giaớm pH. Pha loaợng tồùi 1X trổồùc khi sổớ duỷng tồùi 40 mM base tris; 20 mM axit axetic vaỡ 1 mM EDTA. 3. Dung dởch EDTA (etylen diamin tetraaxetic axit): (0,5M; pH 8,0; 100 ml) Na 2 EDTA.2H 2 O; (FW 372,2) 0,5 M 18,6 g Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 70,0 ml NaOH (10M) tồùi pH 8,0 5,0 ml Nổồùc õaợ õổồỹc khổớ ion hoaù: 100,0 ml - Chuỏứn bở bọỹ õóỷm taới mỏựu. óứ chuỏứn bở bọỹ õóỷm mỏựu cỏửn chuỏứn bở mỏựu õóỷm thổớ (dung dởch mỏựu) vaỡ bọỹ lổồỹc coù dung tờch khaùc nhau. Mỏựu õóỷm thổớ Dung dởch mỏựu (5X; 25% ficoll 400; 25% phenol bromua xanh; 10 ml) 325 Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 7,0 ml Ficoll 400: 2,5 mg Phenol bromua xanh (F 691,9): 25,0 mg Nỉåïc â âỉåüc khỉí ion hoạ: 10,0 ml Chụ 1: Sucroza v glyxerol cọ thãø sỉí dủng âãø thay thãú cho ficoll 400. Chụ 2: Xylen cyanol (0,25 %) m di chuøn cháûm hån phenol bromua xanh, thç cọ thãø tàng thãm mäüt lỉåüng nãúu mong mún, sỉû cä cản dung dëch agaroza âỉåüc xạc âënh khi thãm vo cọ liãn quan âãún polynucleotit. Thãø têch bãøø Bng 15.1. Nhỉỵng loải lỉåüc M säú lỉåüc Bãư dy, mm Âäü räüng, mm Dung têch Âäü sáu 80 - 6051 - 88 1 prep/2 ref 1,0 44/6 44/6 * 80 - 6052 - 07 1 prep/2 ref 1,5 44/6 66/9 * 80 - 6051 - 50 8 1,0 6,5 6,5 80 - 6051 - 69 8 1,5 6,5 9,7 80 - 6050 - 74 12 1,0 3,9 3,9 80 - 6050 - 93 12 1,5 3,9 5,8 80 - 6051 - 12 16 1,0 2,6 2,6 80 - 6050 - 31 16 1,5 2,6 3,9 - Chøn bë khong 7 ml dung dëch agaroza ỉïng våïi mäùi mililit chiãưu dy gel (vê dủ 1 gel 3 mm cáưn 0,3×7×10 = 21 ml). Ho tan agaroza trong dung dëch âãûm , âiãưu chènh nhiãût âäü häùn håüp. Cho phẹp lm mạt dung dëch âãún 50 0 C trỉåïc khi rọt vo khn. Âãø quan sạt sỉû phán ly trong hiãûn tỉåüng âiãûn chuøn thỉåìng thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch gel. 15.3.2. Âục gel - Thiãút bë âàût khay di âäüng: Mäüt tay giỉỵ chàût khn âục, tay kia âàût âáưu khay di âäüng ạp vo miãûng bt âãûm v sau âọ hả tháúp räưi âàût lãn âoản cúi ca khn âục. Âàût âáưu cn lải ca khay ạp sạt miãûng bt âãûm. - Chøn bë lỉåüc: Làõp hai rnh trong lỉåüc vo giỉỵa nhỉỵng âáưu äúc v màût sau lỉåüc. Siãút chàût äúc. Âàût lỉåüc vo mẹp khn v chènh pháưn cúi ca lỉåüc âãø cạch khay di âäüng khong 1 mm. Siãút chàût äúc âãø giỉỵ chàõc lỉåüc. - Di chuøn lỉåüc: Âàût khn làõp rạp lãn màût phàóng nàòm ngang. Âàût äúng nivä lãn khay di âäüng, nọ nhỉ thiãút bë kiãøm tra xem khn cọ âụng vë trê nàòm ngang khäng. 326 Hçnh 15.5. Màût sau lỉåüc, làõp trãn vnh ca khn âục, vë trê lỉåüc trong gel. Hai äúc hiãûu chènh lỉåüc. Âãø tảo hai rnh, âàût lỉåüc thỉï hai vo giỉỵa gel - Âäø dung dëch agaroza (âỉåüc lm lảnh âãún 50 0 C) vo khn âục. Âënh hỉåïng lỉåüc âãø cạc bãư màût lỉåüc gáưn miãúng âãûm bt nháút v âàût nọ lãn cảnh khay. Lỉåüc ln ln åí vo vë trê thàóng âỉïng âãø trạnh sỉû vàûn vẻo hçnh dảng. Âãø chảy lỉåüng máùu gáúp 2 láưn, âàût lỉåüc thỉï hai vo chênh giỉỵa khay. Cho phẹp thåìi gian täúi thiãøu âãø gel âàûc lải l 30 phụt. - Khi gel â kãút lải, láưn lỉåüt thạo lỉåüc cáøn tháûn. Nháúc mäüt pháưn v nghiãng nhẻ mäüt âáưu ca lỉåüc, sau âọ rụt tỉì tỉì ra khi gel (kẹo thàóng lỉåüc, tảo ra mäüt khong khäng âãø cọ thãø nháúc gel ra khi khay). - Thạo khay di âäüng v gel bàòng cạch nàõm láúy tay cáưm ca khay, áún âáưu ạp vo miãúng bt âãûm. Khi khay â sảch âãûm thç nháúc ra. Chuøn khay v gel tåïi chäù mạt. 15.3.3. Váûn hnh âiãûn di 1. Lm lảnh nãưn trỉåïc khi tiãún hnh, âàûc biãût khi dng âiãûn ạp cao hån hồûc khi sỉû phán ly quy âënh trãn 30 phụt. Chụ ï: Âãø tiãún hnh phán ly, hồûc l thãm 0,5 mg/ml etydi bromua vo dung dëch âãûm hồûc thãm 50 mg/ml etydi bromua vo bäü âãûm máùu. Âãø quan sạt, hy càõt âiãûn, thạo pháưn nàõp v giỉỵ ân cỉûc têm gáưn gel. Thãm tỉì tỉì etydi bromua vo dung dëch âãûm hay âãûm máùu. Phạt hiãûn bàòng phỉång phạp ny khäng nhảy bàòng cạch nhüm mu v nhçn qua thiãút bë soi. 2. Âäø dung dëch vo cạc khoang sao cho âãún khi âãûm cao hån gel khong 1 mm (khong 220 ml). 3. Nảp máù u. Thãm máùu vo 5X bäü âãûm ti máùu v träün (1/5 thãø têch l âãûm nảp vo). Sỉí dủng micropipet âãø nảp máùu, chụ trạnh âám thng hồûc tảo nãn nhiãưu bong bọng. 4. Âàût nàõp âãø catot (−, dáy âen) åí âoản cúi gáưn máùu nháút. (Máùu axit nucleic di chuøn vãư phêa anät, +, dáy â). Näúi cạc dáy mu (â våïi â, âen våïi âen) tåïi cạc ngưn âiãûn, nhỉ l ESP 2A200. Âàût mỉïc âiãûn ạp v thiãút bë báúm giåì (nãúu cọ sàơn) theo mỉïc âäü phán ly. Màût sau lỉåüc ÄÚc (2) L ỉåüc 327 Nhanh, âiãûn ạp cao Nhỉỵng ỉïng dủng no âọ, nhỉ l kiãøm tra cạc máùu, cọ thãø thỉûc hiãûn nhanh dỉåïi âiãưu kiãûn âiãûn ạp cao. Lm lảnh (−20 0 C ) v giåïi hản thåìi gian váûn hnh 5 phụt hồûc êt hån åí âiãûn ạp 500 V. Cháûm hån, âiãûn ạp cao hån Mäüt gradient âiãûn ạp 12V/cm (150V) trong 30 ÷ 40 phụt (sỉí dủng dung dëch âãûm 1% gel agaroza v 0,5 X TBE) càõt Hind III ca lamda ADN thnh cạc âoản 0,1 ÷ 23 kb. Hồûc, dng dung dëch nhỉ váûy, máùu ny cọ thãø chảy åí 24 V/cm (300V) thç cọ thãø phán càõt trong 20 ÷ 30 phụt. Lm lảnh thiãút bë trỉåïc khi tiãún hnh. Chụ : - Nãúu khäng âäø thãm mu vo cháút lng lm ngüi thç âàût trãn nãưn täúi âãø quan sạt dãù dng hån. - Âàût thiãút bë cn nọng lãn nãưn âỉåüc lm lảnh cọ thãø nh hỉåíng âãún nhiãût âäü xung quanh. Nãúu sỉû quạ nhiãût khäng âỉåü c kiãøm soạt, gel s tan hồûc thiãút bë s cong. - Etydi bromua l cháút àn da mảnh, nãn cáưn mang bao tay. - Âeo kênh chàõn tia UV v bo vãû da khi sỉí dủng ân UV. - Tênh gradient âiãûn ạp, chia âiãûn ạp âàût vo cho khong cạch giỉỵa cạc cỉûc 12,7 cm. Bng 15.2. Âiãûn ạp âàût vo v thåìi gian âãư nghë (1) Âiãûn ạp, V Gradient, V/cm Thåìi gian, phụt 500 40 5 (1) 400 31 10 (1) 300 24 20 (1) 200 16 30 ÷ 40 150 12 30 ÷ 60 Ghi chụ: (1) Âãø thåìi gian chảy êt hån hồûc bàòng 20 phụt, sỉí dủng 0,5X TBE v lm lảnh nãưn âãún −20 0 C trỉåïc khi sỉí dủng. Sau khi phán ly 1- Ngàõt âiãûn, thạo dáy dáùn, thạo nàõp. 2- Nãúu khäng thãm etydi bromua vo gel hồûc máùu trỉåïc khi chảy, nhüm gel trong dung dëch 0,5 ÷ 1 mg/ml etydi bromua trong nỉåïc hồûc âãûm. 3- Lm sảch thiãút bë. 328 Váûn hnh Cạc loải gel agaroza âỉåüc chøn bë láưn âáưu trong khn âục gel. Nhỉỵng máùu âỉåüc nảp vo trong cạc bãø chỉïa v âỉåüc phán ly. Thúc nhüm hunh quang C 12 H 20 BrN 3 cọ thãø âỉåüc thãm vo cháút âãûm âiãûn di hồûc gel hồûc c hai âãø tçm ra dáúu hiãûu ca quạ trçnh phán ly. Sau khi âiãûn di, gel cọ thãø cho mu, ghi lải mu, tháúm mu thãm hồûc sáúy tỉû âäüng. - Âäø âáưy läù våïi cháút ti lảnh. D khäng lm lảnh âi nỉỵa thç âiãưu quan trng l phi âäø âáưy läù våïi dung dëch lm lảnh âàûc trỉng trỉåïc khi sỉí dủng vç dung dëch cung cáúp ngưn nhiãût cáưn thiãút. Chøn bë 600 ml våïi 50/50 C 2 H 2 (OH) 2 /H 2 O - Âãø giụp xem cạc bãø chỉïa âỉåüc r rng hån trong khi nảp máùu, thãm 1 hồûc 2 git thúc nhüm ho tan hồûc mu thỉûc pháøm vo dung dëch lm lảnh. Tçm ra hai läù hng nảp nỉåïc åí pháưn trãn ca läù. Âäø âáưy läù hng âãún mỉïc cọ thãø nhỉ cháút lm lảnh bàòng äúng phun hồûc mạy båm våïi 50 ml. Báúm nụt caosu mu náu vo mäùi läù. - Sàõp xãúp dung dëch â chøn bë trong thng âạ hồûc bãn trong mạy lảnh hồûc t lảnh âãø khäng dỉåïi 20 0 C trong khong 1 giåì trỉåïc khi sỉí dủng (hoạ cháút âỉåüc dỉû trỉỵ trong phng lảnh hay t lảnh). Chụ : - Khäng âäø âáưy läù våïi cháút chäúng âäng thỉång mải, dung mäi hỉỵu cå hồûc nỉåïc cáút. - Khäng cáưn thiãút thay thãú cháút lm lảnh. 15.3.4. Tênh kãút qu Hiãûn tỉåüng âiãûn di cháút gel cọ thãø sỉí dủng nhỉỵng mnh nh ADN khong 0,1 kb hay nh hån loải gel polyacrylamit thỉåìng sỉí dủng nhỉỵng mnh nh hån 1 kb. Tênh âiãûn di ca ADN. Näưng âäü agaroza qui âënh cho quạ trçnh phán ly thnh nhỉỵng mnh våỵ våïi nhỉỵng kêch thỉåïc khạc nhau âỉåüc cho trong bng 15.3. Bng 15.3. Näưng âäü âãø âiãûn di ca cạc mnh våỵ ADN âäúi våïi cạc loải cháút khạc Âiãûn di, % Hiãûu qu ca nhỉỵng âoản thàóng âäúi våïi sỉû phán gii 0,5 1,0 ÷ 3,0 0,7 0,8 ÷ 12 1,0 0,5 ÷ 10 1,2 0,4 ÷ 7 1,5 0,2 ÷ 3 329 Nhỉỵng nhán täú khạc nh hỉåíng âãún kãút qu quạ trçnh phán ly bao gäưm: cháút âãûm, âiãûn ạp âàût vo, nhiãût âäü , cáúu tảo v sỉû cọ màût ca etydi brommua, cạc agaroza âàûc biãût cọ sàơn. Tiãu chøn chung cho âoản Hind III phage λ. Loải cho 8 mnh våỵ sàõp xãúp trong khong tỉì 0,1 âãún 23 kb cho mäùi càûp 2 såüi. Âãø phán gii täút, di chuøn trãn âoản 10 cm máút 45 phụt 1% gel agaroza trong gel 0,5 X TBE åí âiãûn ạp 150V. Tênh âiãûn di ca ARN ARN cọ thãø phán chia âỉûa theo kêch thỉåïc cå bn. Âãø trạnh tạc âäüng âãún thåìi k chuøn hoạ cáúu trục ARN âỉåüc biãún tênh trỉåïc hay sút thåìi gian âiãûn di. Vê dủ: âoản ARN â biãún tênh trỉåïc våïi glyoxal v âimetyl sunfoxit cọ thãø gel agaroza âäüc láûp, hay ARN cọ thãø bë càõt phán âoản. Gel agaroza chỉïa hydroxyt thu ngán II metyl hay focmaldehyt. 15.3.5 Sỉû phạt hiãûn ADN ADN cọ thãø âỉåüc phạt hiãûn nhåì sỉû phạt hunh quang ca liãn kãút etydi bromua (C 2 H 10 BrN 3 ) hay nhåì phỉång phạp chủp nh bàòng tia X ca âäưng vë phọng xả ADN. Etydi bromua (0,5 µg/ml) cọ thãø âỉåüc thãm vo dung dëch âãûm di chuøn, âãø quan sạt sỉû biãún âäüng ca máùu, vç sỉû phạt hunh quang ca thúc nhüm dỉåïi tạc dủng ca tia cỉûc têm s âỉåüc biãøu hiãûn åí dảng di (âãø xạc âënh âỉåüc sỉû biãún âäøi âọ; tàõt ngưn cung cáúp nàng lỉåüng v chuøn âäøi thnh pháưn agaroza c ra nàõp thiãút bë âënh tia cỉûc têm gáưn khay váûn hnh. Âàût nàõp lải v báût ân âãø bàõt lải sỉû âiãûn di). Ngoi ra, sau khi âiãûn di, gel biãún mu trong dung dëch ho tan (etydi bromua 10,5 µg/ml H 2 O) khong tỉì 10 âãún 60 phụt räưi quan sạt v chủp nh máùu bàòng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm. Âãø chủp nh gel, dng phỉång phạp chiãúu tia cỉûc têm trãn bãư màût tải mäùi vë trê åí âéa váûn hnh hồûc di chuøn nhẻ bn gel trãn bãư màût s quan sạt âỉåüc täúi âa (Âéa váûn hnh cọ 95 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm v 40 % ạnh sạng tràõng våïi bỉåïc sọng 254 nm). Quan sạt máùu bàòng tia cỉûc têm åí bỉåïc sọng 366 nm hồûc lm gim cỉåìng âäü tia cỉûc têm xúng 302 nm âãø gim sỉû phạt hunh quang ca etydi bromua khäng liãn kãút, gel cọ thãø bë máút mu båíi sỉû hụt áøm ca nọ trong 5 phụt våïi MgCl 2 0,01M hồûc trong 1 giåì våïi MgSO 4 0,001M. Sỉû máút mu â tảo âiãưu kiãûn dãù dng âãø phạt hiãûn hm lỉåüng ADN nh. 15.3.6. Nhỉỵng chụ cáưn thiãút Nàõp an ton phi âỉåüc làõp trỉåïc khi näúi ngưn âiãûn våïi ngưn cung cáúp nàng lỉåüng. 330 Tàõt táút c cạc cäng tàõc âiãûn v ngàõt ngưn cung cáúp âiãûn trỉåïc khi thạo nàõp an ton. Trỉåïc khi sỉí dủng láưn âáưu, lm âáưy läù våïi 1 lỉåüng 600 ml 50/50 etylen glycol/ nỉåïc âãø ngàn chàûn sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë. Läù chỉïa lỉåüng trãn cọ thãø âäø âáưy ngay c khi khäng cáưn lm lảnh theo u cáưu. Khäng sỉí dủng nỉåïc cáút, cháút chäúng âäng thỉång mải hồûc báút k dung mäi hỉỵu cå no âãø âäø vo läù âọ. Nỉåïc âỉåüc láúy ra khi âọng bàng. Nãúu khäng nọ bë hụt vo bãn trong dung dëch v phạ våỵ liãn kãút. Dung mäi hỉỵu cå s gáy ra sỉû täøn tháút hoạ cháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë. Khäng lm lảnh lỉåü ng dung dëch cho vo läù âọ dỉåïi −20 0 C (−4 0 F). Cọ thãø lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ trong thng âạ, mạy lm lảnh hồûc trong t lảnh. Khäng âiãưu chènh nhiãût âäü dung dëch âãûm hồûc gel trãn 50 0 C. Ngàn chàûn sỉû âun nọng quạ nhiãût bàòng cạch lm lảnh lỉåüng dung dëch âọ trỉåïc khi sỉí dủng. Âãø ngàn chàûn sỉû âun nọng quạ nhiãût trong quạ trçnh kẹo di chảy âiãûn ạp cao, thay thãú lỉåüng dung dëch thỉï nháút bàòng lỉåüng dung dëch thỉï 2 â âỉåüc lm lảnh. Sỉû âun nọng quạ nhiãût s gáy ra sỉû täøn tháút khäng thãø häưi phủc cho thiãút bë Lm sảch Sau mäùi láưn sỉí dủng, lm sảch thiãút bë bàòng cháút táøy nhẻ v nỉåïc, sục cáøn tháûn våïi nỉåïc cáút v lm khä bàòng khäng khê. Khäng âỉåüc âàût thiãút bë vo dung dëch hồûc khê thåm hồûc cạc hydrocacbon halogen hoạ, xeton, este, alcol (trãn 30%) hồûc axit âàûc (trãn 25%). Âãø trạnh lm báøn DNaza v ARNza, ngám cạc khoang chỉïa âãûm hồûc khn âục khong 10 phụt trong dung dëch H 2 O 2 3%, sau âọ sục cáøn tháûn våïi DEPC âỉåüc xỉí l räưi cho vo näưi háúp (dng nỉåïc â âỉåüc ion hoạ âãø háúp). Thay thãú miãúng bt âãûm Thạo nhỉỵng miãúng bt âãûm mn. Thạo v miãúng âãûm måïi. Sàõp âãûm cho thàóng v âãø nọ vo vë trê cúi ca khay dc theo cảnh ngàõn (7 cm), màût sau ca tỉåìng v sau âọ ẹp vo âụng vë trê. Làûp lải våïi miãúng âãûm thỉï hai trãn tỉåìng âäúi diãûn våïi miãúng âãûm thỉï nháút. 15.3.7. Âiãưu chènh thiãút bë âiãûn di Bãø chàõn máùu. Âãø cho gel âàûc lải täúi thiãøu l 30 phụt v giỉỵ åí nhiãût âäü phng trỉåïc khi thạo lỉåüc. Khi tha ïo lỉåüc giỉỵ åí cảnh ngàõn v náng nhẻ âãø trạnh gáùy gel. Giỉỵ âãø khäng hng bãø chỉïa, dng pipet âãø láúy máùu, cäú gàõng cho vo giỉỵa bãø v khäng lm thng âạy bãø. . 321 Chỉång 15 MẠY ÂIÃÛN DI Mạy âiãûn di dng âãø phạt hiãûn v xạc âënh ADN trong tãú bo vi sinh váût, thỉûc váût v âäüng váût. 15. 1. AXIT DEOXYRIBONUCLEIC. Hçnh 15. 1. Lai “bäü d tçm” våïi âoản ADN, tạch ra bàòng âiãûn di v chuøn sang táúm nylon (Southern blotting) 15. 2. CÁÚU TRỤC CA MẠY ÂIÃÛN DI Mạy