Nghiên cứu chuyển gen coda nhằm nâng cao khả năng chịu hạn của cây đậu tương (glycine max (l ) merrill) TT

ĐẠI HỌC THÁI NGUYÊN TRƯỜNG ĐẠI HỌC SƯ PHẠM Ngô Mạnh Dũng NGHIÊN CỨU CHUYỂN GEN codA NHẰM NÂNG CAO KHẢ NĂNG CHỊU HẠN CỦA CÂY ĐẬU TƯƠNG (Glycine max (L.) Merrill) Ngành: Di truyền học Mã số: 9420121 TÓM TẮT LUẬN ÁN TIẾN SĨ SINH HỌC THÁI NGUYÊN - 2021 Cơng trình hồn thành : Trường Đại học Sư phạm - Đại học Thái Nguyên Người hướng dẫn khoa học: PGS TS Chu Hoàng Hà GS.TS Chu Hoàng Mậu Phản biện 1: Phản biện 2: Phản biện 3: Luận án bảo vệ trước Hội đồng đánh giá luận án cấp Trường họp tại: Trường Đại học Sư phạm-Đại học Thái Nguyên Vào hồi phút, ngày tháng năm 2021 Có thể tìm hiểu luận án tại: Thư viện Quốc gia Việt Nam Trung tâm học liệu Đại học Thái Nguyên Thư viện Trường Đại học Sư phạm – Đại học Thái Nguyên MỞ ĐẦU Đặt vấn đề Biến đổi khí hậu, nước biển dâng diễn quy mơ tồn cầu dẫn tới tình trạng hạn hán, đặc biệt hạn mặn ngày kéo dài, gây khó khăn lớn cho ngành sản xuất nông nghiệp Stress hạn gia tăng trở thành trở ngại lớn, gây ảnh hưởng nghiêm trọng đến suất sản lượng nơng nghiệp tồn cầu Đậu tương nông nghiệp quan trọng giới, nguồn cung cấp protein bổ dưỡng với chi phí thấp giữ vai trị cải tạo đất nơng nghiệp Cây đậu tương thuộc nhóm trồng chịu hạn Stress hạn nguyên nhân làm giảm suất, sản lượng đậu tương Trong bối cảnh nay, vấn đề nâng cao khả chịu hạn đậu tương để giảm thiểu thiệt hại suất điều kiện môi trường thiếu nước nhiệm vụ cấp bách nhà chọn giống nông nghiệp Việc cải thiện khả chịu hạn đậu tương quan tâm nghiên cứu với nhiều hướng tiếp cận khác nhau, đó, kỹ thuật chuyển gen mở triển vọng lớn việc cải thiện đặc tính chịu hạn đậu tương Đặc tính chịu hạn tính trạng số lượng phức tạp, chịu ảnh hưởng hệ thống gen mục tiêu Sự biểu gen tác động trực tiếp đến đặc tính chịu hạn điều hịa chức nhóm gen chịu hạn… Một hướng nghiên cứu tiếp cận chế chống chịu hạn làm gia tăng chất giúp bảo vệ áp suất thẩm thấu tế bào khỏi cân nước Trong đó, glycine betaine (GB) chất bảo vệ thẩm thấu nghiên cứu rộng rãi Một số trồng chuyển gen mã hoá enzyme liên quan đến sinh tổng hợp GB thể khả chống chịu với điều kiện bất lợi mơi trường chịu nóng, chịu lạnh, chịu hạn chịu mặn Phương pháp chuyển gen codA từ A globiformis vào loại trồng đậu xanh, khoai tây, cà chua… để nâng cao khả chống chịu điều kiện stress phi sinh học khác chứng minh phương pháp đơn giản hiệu Tại Việt Nam, gen codA mã hố sinh tổng hợp GB chuyển thành cơng vào xoan, thuốc cho thấy khả chịu hạn, chịu mặn Chính vậy, việc nghiên cứu tăng cường biểu gen codA liên quan đến sinh tổng hợp GB nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tương giúp phát triển tốt hơn, cho suất sản lượng cao điều kiện mơi trường bất lợi nghiên cứu mang tính thực tiễn cần thiết Xuất phát từ sở khoa học nhu cầu thực tiễn tạo giống đậu tương có khả chống chịu hạn cơng nghệ chuyển gen, lựa chọn thực đề tài luận án “Nghiên cứu chuyển gen codA nhằm nâng cao khả chịu hạn đậu tương (Glycine max (L.) Merrill)” Mục tiêu nghiên cứu Biến nạp cấu trúc mang gen chuyển codA vào đậu tương tạo đậu tương chuyển gen codA mã hóa choline oxydase có khả chịu hạn cao không chuyển gen Nội dung nghiên cứu 3.1 Nghiên cứu tạo cấu trúc chuyển gen mang gen codA vector biểu thực vật 1) Thiết kế vector biểu gen thực vật chứa cấu trúc mang gen codA 2) Biến nạp cấu trúc chuyển gen mang gen codA vào mô thuốc Đánh giá hoạt động biểu gen chuyển codA dòng thuốc chuyển gen 3.2 Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen codA đậu tương 1) Nghiên cứu ảnh hưởng nồng độ phosphinothricin (ppt) đến khả tạo chồi từ mầm đậu tương 2) Phân tích ảnh hưởng nồng độ khuẩn thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi đậu tương 3) Phân tích ảnh hưởng nồng độ kháng sinh thời gian diệt khuẩn đến phát sinh sinh trưởng chồi đậu tương 3.3 Nghiên cứu biến nạp cấu trúc mang gen codA vào giống đậu tương ĐT22 tạo đậu tương chuyển gen chịu hạn 1) Biến nạp di truyền tạo đậu tương chuyển gen codA 2) Phân tích đậu tương chuyển gen codA 3) Đánh giá khả chịu hạn số dòng đậu tương chuyển gen codA Những đóng góp luận án Luận án cơng trình nghiên cứu Việt Nam tạo thành công đậu tương mang gen codA tăng khả chịu hạn so với đậu tương không mang gen Luận án cơng trình có hệ thống với nội dung trình bày từ thiết kế vector chuyển gen thực vật, phân tích biểu gen tạo dịng chuyển gen codA có hàm lượng GB tích luỹ cao Cụ thể là: 1) Đã xác định yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA tạo đa chồi giống đậu tương ĐT22 Nồng độ PPT mg/l giai đoạn cảm ứng tạo chồi môi trường SIM nồng độ PPT 1,5 mg/l giai đoạn kéo dài chồi mơi trường SEM; dịch khuẩn có giá trị OD 650= 0,6, thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng nuôi cấy ngày tối diệt khuẩn cefotaxime 500 mg/l thích hợp cho cảm ứng tạo chồi kéo dài chồi môi trường chọn lọc 2) Lần gen codA chuyển thành công biểu mạnh đậu tương Việt Nam Sự biểu gen chuyển codA đậu tương chuyển gen làm tăng hàm lượng GB, proline, tăng hoạt độ POD, giảm hàm lượng MDA so với cây đậu tương không chuyển gen 3) Bốn dòng đậu tương chuyển gen codA hệ T1 đánh giá, hàm lượng GB dòng đậu tương chuyển gen tăng từ 248,9% - 288,3% so với không chuyển gen; hàm lượng proline tăng 1,5- lần, hoạt động POD tăng gấp lần hàm lượng MDA giảm 0,5 lần so với không chuyển gen Ý nghĩa khoa học thực tiễn đề tài luận án Kết nghiên cứu đạt luận án có giá trị khoa học thực tiễn tiếp cận nghiên cứu nâng cao khả chống chịu stress phi sinh học đậu tưương kỹ thuật chuyển gen Về mặt khoa học, kết luận án chứng minh tăng cường biểu gen codA mã hóa enzyme chìa khóa đường sinh tổng hợp GB làm tăng khả chống chịu hạn đậu tương Kết nghiên cứu sở khoa học để cải thiện khả chống chịu yếu tố bất lợi ngoại cảnh thực vật nói chung họ đậu nói riêng kỹ thuật biểu gen Kết đăng tải báo khoa học tài liệu tham khảo có giá trị phục vụ nghiên cứu giảng dạy sinh học Về mặt thực tiễn, dòng đậu tương chuyển gen codA sử dụng làm vật liệu phục vụ chọn giống đậu tương có khả chống chịu hạn Kết nghiên cứu luận án áp dụng vào giống họ đậu loài thực vật khác định hướng nghiên cứu nhằm nâng cao hàm lượng GB giúp tăng khả chống chịu với điều kiện bất lợi môi trường Cấu trúc luận án Luận án có 134 trang (kể phụ lục), chia thành chương, phần: Mở đầu (5 trang); Chương 1: Tổng quan tài liệu (40 trang); Chương 2: Vật liệu phương pháp nghiên cứu (16 trang); Chương 3: Kết thảo luận (39 trang); Kết luận đề nghị (1 trang); Các cơng trình cơng bố liên quan đến luận án (1 trang); Tài liệu tham khảo (23 trang); Phụ lục (10 trang) Luận án có bảng, 26 hình, phụ lục 180 tài liệu tham khảo Chương TỔNG QUAN TÀI LIỆU Luận án tham khảo tổng kết 180 tài liệu, có 11 tài liệu tiếng Việt, 169 tài liệu tiếng Anh ba vấn đề bản, là: (1) Tác động hạn chế chịu hạn thực vật; (2) GB, choline oxidase; (3) Nâng cao khả chịu hạn đậu tương kỹ thuật chuyển gen Stress hạn gây ảnh hưởng đến hình thái, sinh lý sinh trưởng gây hậu nghiêm trọng giai đoạn hoa, kết hạt, tạo quả, dẫn tới giảm 73– 82% hạt/cây đậu tương Stress hạn gây rối loạn chức máy quang hợp, giảm diệp lục, từ giảm hiệu suất trình quang hợp Stress hạn tăng cường máy chống oxy hóa: loại bỏ gốc ROS, giảm rị rỉ điện giải peroxy hóa lipid giúp trì sức sống, tính tồn vẹn bào quan màng tế bào Ngồi ra, Stress hạn cịn giảm khả hấp thụ nguồn khoáng đất rễ, giảm tốc độ vận chuyển chất khoáng thân dẫn đến giảm hàm lượng ion mô thể thực vật Trong điều kiện hạn, thực vật thường chủ động trì cân nước sinh lý cách sau: (i) Tăng cường phát triển rễ đồng thời đóng khí khổng để giảm thất nước (ii) Tăng cường tích lũy chất tan điều chỉnh áp suất thẩm thấu mô (iii) Tăng cường khả chống oxy hóa (iv) Tăng cường điều hoà hormone GB dẫn xuất thay hoàn toàn N-metyl glycine GB có khối lượng phân tử thấp, hợp chất amoni bậc bốn, lưỡng cực trung tính điện pH sinh lý GB hợp chất không độc, khơng màu, khơng vị khơng mùi, tích tụ nhiều lồi thực vật Mức độ tích lũy GB khơng giống loài khác nhau, quan khác thể thực vật GB chất thẩm thấu, chất bảo vệ thẩm thấu chất hòa tan tương thích GB coi chất kích thích sinh học, sử dụng nồng độ thấp để thúc đẩy phát triển trồng, tăng khả chống chịu stress phi sinh học nâng cao sản lượng GB tổng hợp thông qua nhiều đường, phổ biến đường thứ choline Trong đó, thực vật gồm bước oxy hoá: (i) choline chuyển thành betaine aldehyde, nhờ xúc tác choline monooxygenase (CMO), sau (ii) betaine aldehyde chuyển thành GB nhờ xúc tác betaine aldehyde dehydrogenase (BADH) Ở động vật nhiều vi khuẩn, bước thứ lại sử dụng choline dehydrogenase (CHDH) bước oxy hoá thứ hai, enzyme BADH Ở vi khuẩn A globiformis A pascens sử dụng enzyme choline oxidase (CHO) mã hóa gen đơn codA xúc tác trình oxy hóa trực tiếp bốn điện tử choline thành GB Từ đường sinh tổng hợp GB đối tượng sinh vật khác nhận thấy, đường sinh tổng hợp GB A globiformis A panescens đơn giản Từ tiền chất choline chuyển hoá GB cần enzyme nhất, choline oxidase (COD) mã hóa gen codA Chính vậy, gen codA mã hoá choline oxidase trở thành mục tiêu nghiên cứu ứng dụng công nghệ sinh học cải thiện khả chống lại stress thẩm thấu Choline oxidase từ A globiformis lần tinh chế Ikuta năm 1977 Enzyme flavoprotein, xúc tác trình oxy hóa bốn electron choline thành GB với sản phẩm trung gian betaine aldehyde chất nhận điện tử cuối oxy phân tử Cụ thể bước 1, choline bị oxy hóa thành betaine aldehyde, O2 bị khử thành hydro peroxide (H 2O2); bước 2, betaine aldehyde liên kết với enzyme hydrat hóa tạo gem-diol choline, sau oxy hóa thành GB Gen codA mã hoá choline oxidase vi khuẩn A globiformis (GenBank, mã số AY304485) có kích thước 1641 bp mã hóa polypeptit 547 aa, bão hòa hàm lượng G + C, cản trở dẫn truyền phản ứng chuỗi polymerase cấu trúc kẹp tóc có khả chống nóng chảy Vì vậy, cần thiết kế mã di truyền, tổng hợp nhân tạo gen codA phù hợp với biểu gen hệ thống tế bào thực vật (với hàm lượng A + T dư thừa) Ngồi ra, bổ sung vào đầu 5’ trình tự gen nhân tạo codA đoạn nucleotide dài 216 bp transit peptide- TP (mã hóa protein vận chuyển tiểu đơn vị Rubisco thuốc lá) để vận chuyển enzyme vào lục lạp Đầu 3’ gen nhân tạo codA bổ sung đoạn nucleotide dài 30 bp mã hóa kháng nguyên cmyc sử dụng để kiểm tra diện protein codA tái tổ hợp chuyển gen kĩ thuật lai western blot Như vậy, kích thước gen codA tổng hợp nhân tạo 1887 bp (216 bp TP+ 1641 bp codA+ 30 bp cmyc) Chức choline oxidase mã hóa gen codA tổng hợp nhân tạo khơng bị thay đổi so với trình tự gen gốc Đậu tương nguồn cung cấp protein bổ dưỡng với chi phí thấp, sử dụng làm thức ăn cho người gia súc, loại trồng cải tạo đất Đậu tương có thời gian sinh trưởng ngắn, khả thích ứng rộng, bố trí phù hợp với nhiều cấu trồng sản xuất, lại thuộc nhóm trồng chịu hạn Hạn làm giảm khả nảy mầm, sinh trưởng phát triển kém, cịi cọc, giảm quang hợp, giảm khả hút khống… Chính vậy, nâng cao khả chịu hạn đậu tương để giảm thiểu thiệt hại suất điều kiện môi trường thiếu nước nhiệm vụ cấp bách nhà chọn giống trồng nông nghiệp Đậu tương chuyển gen loại trồng biến đổi gen đưa vào sản xuất đại trà sớm, với diện tích trồng nhiều giới Kỹ thuật chuyển gen qua Agrobacterium sử dụng rộng rãi Trên giới Việt Nam, nhiều cơng trình nghiên cứu thành công việc tạo đậu tương chuyển gen cải thiện khả chống chịu stress phi sinh học Nhiều cơng trình nghiên cứu chuyển gen codA mã hóa choline oxidase sinh tổng hợp GB làm tăng khả chống chịu trồng trước điều kiện môi trường bất lợitừ ngoại cảnh Tuy nhiên, chưa có cơng bố nghiên cứu chuyển gen codA đậu tương Chính vậy, việc chuyển gen codA vào đậu tương nhằm nâng cao khả chịu hạn hướng mới, có tính thời cấp thiết Chương VẬT LIỆU VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 VẬT LIỆU NGHIÊN CỨU Các vật liệu thực vật: Giống thuốc K326 cung cấp Viện Nghiên cứu thuốc Giống đậu tương ĐT22 cung cấp Trung tâm Nghiên cứu Phát triển đậu đỗ Các chủng vi khuẩn loại vector: Chủng vi khuẩn E coli DH5α A tumefaciens C58/pGV2206 Vector pIBTII, pCAMBIA thiết kế sử dụng phịng Cơng nghệ tế bào thực vật, Viện Công nghệ sinh học, Viện Hàn lâm Khoa học Cơng nghệ Việt Nam Trình tự gen codA mã hóa cho choline oxidase từ A globiformis khai thác Genbank (Mã số AY304485) tối ưu hóa nhằm tăng tính biểu thực vật cung cấp công ty Epoch Life Science Inc, Mỹ Các cặp mồi sử dụng cho phản ứng PCR: codA-F/R, Bar-F/R, F/TP-XbaI, R/cmyc-SacI 2.2 HĨA CHẤT, THIẾT BỊ Hóa chất: Sử dụng hoá chất hãng Fermentas, Invitrogen, Sigma, Merck, Amersham Pharmacia Biotech… Thiết bị: Sử dụng thiết bị Phòng Cơng nghệ tế bào thực vật Phịng thí nghiệm trọng điểm Công nghệ gen, Viện Công nghệ Sinh học 2.3 PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.3.1 Nhóm phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA chuyển gen thuốc Phương pháp thiết kế vector chuyển gen codA: Các phản ứng cắt enzyme giới hạn, lai tạo vector tái tổ hợp Plasmid tái tổ hợp biến nạp vào tế bào vi khuẩn theo phương pháp xung điện Cohen cộng (1972) Chuyển cấu trúc vector sau thiết kế vào thuốc kiểm tra có mặt gen chuyển: theo phương pháp Topping (1998) Phân tích hàm lượng GB thuốc chuyển gen: theo phương pháp Grieve cộng (1983) 2.3.2 Nhóm phương pháp nghiên cứu điều kiện thích hợp cho chuyển gen giống đậu tương ĐT22 Khử trùng hạt: Hạt đậu tương khử trùng khí chlore (Cl2) 10 Chuẩn bị khuẩn: Các loại mơi trường sử dụng q trình ni cấy tạo dịch huyền phù vi khuẩn gồm: môi trường nuôi khuẩn đặc, môi trường nuôi khuẩn lỏng môi trường tạo dịch huyền phù vi khuẩn Nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen codA: Các yếu tố ảnh hưởng thử nghiệm ngưỡng nồng độ khác để lựa chọn điều kiện tối ưu cho quy trình chuyển gen 2.2.3 Nhóm phương pháp tạo đậu tương chuyển gen codA Biến nạp di truyền tạo đậu tương chuyển gen: Chuyển gen vào giống ĐT22 theo pháp Olhoft cs (2001), có cải tiến Các dịng đậu tương chuyển gen sàng lọc chất diệt cỏ PPT Phân tích đậu tương chuyển gen: DNA tổng số tách chiết theo phương pháp Delllaporta (1983) Xác nhận diện gen chuyển codA kỹ thuật PCR cặp mồi đặc hiệu Kiểm tra hợp gen chuyển codA vào hệ gen chuyển gen kỹ thuật Southern blot Kiểm tra biểu protein tái tổ hợp codA kỹ thuật Western blot Đánh giá khả chịu hạn số dòng chuyển gen điều kiện hạn nhân tạo: Các dòng chuyển gen đánh giá khả chịu hạn điều kiện hạn nhân tạo thiết đặt buồng sinh trưởng Đánh giá số GB theo phương pháp Grieve cộng (1983); số MDA, proline hoạt độ POD theo phương pháp Chen Zhang (2016) 2.3.4 Phân tích xử lý liệu: Số liệu xử lý phần mềm SPSS 2.3 ĐỊA ĐIỂM NGHIÊN CỨU Thí nghiệm thực Viện Công nghệ sinh học thời gian từ 2017- 2020 Luận án hoàn thành Bộ môn Di truyền học Công nghệ sinh học, Khoa Sinh học Trường Đại học Sư phạm, ĐH Thái Nguyên Chương KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU VÀ THẢO LUẬN 3.1 THIẾT KẾ VÀ BIỂU HIỆN VECTOR CHUYỂN GEN MANG GEN codA 3.1.1 Tạo cấu trúc chuyển gen codA Ba vector biểu gen thực vật pBTII mang promoter 35S, rd29A HSP tương ứng để điều khiển biểu gen codA đậu tương thiết kế Sau tiến hành tách chiết tinh sạch, vector pIBTII pCAMBIA-HSP- 15 Để xác định hàm lượng ppt sử dụng chọn lọc chồi chuyển gen thí nghiệm, cụm chồi chuyển sang mơi trường SIM2, bổ sung ppt với nồng độ (0; 1; 3; 5; 7) mg/l Theo dõi sau hai tuần, nhận thấy, sau 14 ngày nuôi cấy môi trường SIM2 có chứa PPT mg/l mg/l, cụm chồi xanh phát triển bình thường, đó, cụm chồi úa vàng rụng ngày thứ mơi trường SIM2 có chứa PPT 3-5 mg/l Trên mơi trường SIM2 có chứa ppt mg/l, cụm chồi chết khơ hồn tồn sau ngày nuôi cấy tỉ lệ chồi kéo dài giảm theo tăng nồng độ ppt Sau khoảng 30 ngày, cụm chồi môi trường bổ sung nồng độ PPT mg/l sinh trưởng phát triển chậm, có tương tạo cụm chồi xanh Ở nồng độ PPT mg/l, chồi chết hoàn toàn Từ kết phân tích trên, chúng tơi định lựa chọn môi trường SIM bổ sung PPT 3,0 mg/l để chọn lọc đậu tương chuyển gen Hình 3.9 Các mảnh mầm môi trường chọn lọc SIM2 với nồng độ PPT khác sau 14 ngày nuôi cấy A: mg/l; B: mg/l; C: mg/l; D: mg/l 3.2.2 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn thời gian ủ khuẩn, đồng nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi đậu tương 3.2.2.1 Ảnh hưởng nồng độ khuẩn đến khả cảm ứng tạo chồi đậu tương Để xác định nồng độ khuẩn Agrobacterium OD650 sử dụng cho chuyển gen vào đậu tương, tiến hành lây nhiễm mảnh mầm hạt đậu tương làm tổn thương nách mầm với dịch khuẩn có giá trị OD 650 khác nhau, 0,4; 0,6; 0,8 1,0 vịng 30 phút, sau tiến hành đồng ni cấy mảnh mầm lây nhiễm môi trường CCM ngày Sau 14 ngày, mảnh mầm tiếp tục chuyển sang mơi trường SEM có chứa PPT 1,5 mg/l Kết bảng 3.3 cho thấy, sau 14 ngày nuôi cấy môi trường SIM1 không chứa PPT, không thấy sai khác nhiều khả tạo 16 chồi mảnh mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD 650 0,4 0,6 Đối với mảnh mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD 650 0,8 1,0, tỷ lệ tái nhiễm khuẩn mảnh mầm cao, mảnh mầm thường chết không tạo đa chồi Các mảnh mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD650 0,4 0,6 tiếp tục chọn lọc mơi trường SIM2 SEM có bổ sung PPT Sau 14 ngày nuôi cấy chọn lọc, mảnh mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD650 0,6 tiếp tục sinh trưởng phát sinh chồi, mảnh mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD650 0,4 gần chết hồn tồn mơi trường chọn lọc Vì vậy, chúng tơi lựa chọn dịch khuẩn có giá trị OD650 đạt 0,6 để sử dụng cho biến nạp 3.2.2.2 Ảnh hưởng thời gian ủ khuẩn A tumefaciens đồng nuôi cấy đến khả cảm ứng tạo chồi đậu tương Nghiên cứu ảnh hưởng thời gian ủ khuẩn Agrobacterium đồng nuôi cấy đến hiệu chuyển gen giống đậu tương ĐT22 thực với khoảng thời gian ủ là: 15 phút; 30 phút; 45 phút; thời gian đồng nuôi cấy ngày, ngày ngày, kết trình bày bảng 3.4 cho thấy, với thời gian lây nhiễm 15 phút, cụm mầm bị chết gần hoàn toàn giai đoạn cuối chọn lọc lần 1; thời gian lây nhiễm 45 phút, tỷ lệ nhiễm lại khuẩn cao loại bỏ nhiều giai đoạn cảm ứng tạo chồi SIM1 Ở thời gian đồng nuôi cấy ngày, mảnh mầm nhỏ nhiều so với đồng nuôi cấy ngày ngày, với thời gian đồng nuôi cấy ngày khuẩn mọc lại cao đến ngày thứ đồng ni cấy khuẩn mọc lan ngồi giấy lọc đến ngày thứ số mảnh bị thối (Hình 3.10) Vì vậy, thời gian lây nhiễm 30 phút đồng nuôi cấy ngày cho kết tốt để sử dụng cho chuyển gen giống đậu tương ĐT22 Hình 3.10 Các mảnh mầm sau thời gian đồng nuôi cấy khác A: ngày; B: ngày; C: ngày 17 3.2.3 Ảnh hưởng nồng độ kháng sinh thời gian diệt khuẩn đến phát sinh sinh trưởng chồi đậu tương Xác định kháng sinh thời gian rửa khuẩn sau ngày đồng nuôi cấy yếu tố quan trọng đến khả diệt khuẩn tạo đa chồi mảnh mầm sau lây nhiễm A tumeffaciens tái tổ hợp Sử dụng kháng sinh diệt khuẩn phổ rộng cefotaxime với nồng độ 200 mg/l, 500 mg/l 1000 mg/l bổ sung vào môi trường rửa khuẩn (SIM lỏng) với thời gian rửa phút, 10 phút, 15 phút Kết qua giai đoạn cho thấy, nồng độ cefotaxime 500 mg/l bổ sung vào môi trường diệt khuẩn rửa thời gian 10 phút cho kết tốt Ở nồng độ cefotaxim 1000 mg/l, mảnh mầm tạo đa chồi kém, vị trí nách mầm sau tạo tổn thương bị đen không tạo cụm đa chồi Ở nồng độ cefotaxime 200 mg/l, mảnh mầm bị tái nhiễm khuẩn cao, sau tuần đầu cảm ứng tạo chồi, hầu hết mảnh bị nhiễm lại khuẩn (Bảng 3.5) 3.2.4 Thảo luận kết nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố đến hiệu chuyển gen codA giống đậu tương ĐT22 Hiện nay, nhiều quy trình chuyển gen áp dụng đậu tương, phổ biến biến nạp gen lây nhiễm A tumefaciens tái tổ hợp qua nách mầm Tuy nhiên, phương pháp số hạn chế cần khắc phục hiệu chuyển gen phụ thuộc vào kiểu gen giống đậu tương Chính nghiên cứu chọn điều kiện chuyển gen thích hợp với kiểu gen giống ý quan tâm nhà nghiên cứu chuyển gen đậu tương Kết nghiên cứu ảnh hưởng số yếu tố ảnh hưởng đến hiệu chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22 Việt Nam khảo sát đánh giá, bao gồm nồng độ phosphinothricin, nồng độ khuẩn, thời gian ủ khuẩn A tumefaciens, đồng nuôi cấy, nồng độ kháng sinh chọn lọc thời gian diệt khuẩn Lựa chọn tác nhân chọn lọc hiệu bước quan trọng quy trình biến nạp gen Kết nghiên cứu cho thấy, sử dụng PPT mg/l giai đoạn cảm ứng tạo chồi môi trường SIM PPT 1,5 mg/l giai đoạn kéo dài chồi môi trường SEM cho hiệu chọn lọc cao Bên cạnh đó, nồng độ khuẩn lây nhiễm, ủ khuẩn Agrobacterium đồng nuôi cấy yếu tố ảnh hưởng 18 lớn đến hiệu chuyển gen thông qua A tumefaciens Trong kết nghiên cứu chúng tôi, mảnh mầm đậu tương làm tổn thương nách mầm lây nhiễm với dịch khuẩn có giá trị OD 650 khác nhau, dịch khuẩn có giá trị OD650 = 0,6 với thời gian ủ khuẩn 30 phút, đồng nuôi cấy ngày tối thích hợp cho cảm ứng tạo chồi kéo dài chồi mơi trường chọn lọc Ngồi ra, việc xác định kháng sinh thời gian rửa khuẩn sau ngày đồng nuôi cấy yếu tố quan trọng đến khả diệt khuẩn tạo đa chồi mảnh mầm sau lây nhiễm A tumeffaciens tái tổ hợp Kết qua giai đoạn cho thấy, nồng độ cefotaxime 500 mg/l bổ sung vào môi trường diệt khuẩn rửa thời gian 10 phút cho kết tốt để sử dụng cho chuyển gen giống đậu tương ĐT22 Như vậy, từ kết đánh giá tác động yếu tố lên khả biến nạp tạo đa chồi giống đậu tương ĐT22, xác định yếu tố thích hợp cho chuyển gen codA tạo đa chồi giống đậu tương ĐT22 Kết tiền đề để chúng tơi hồn thiện quy trình chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22 nhằm phục vụ cho nghiên cứu đề tài 3.3.1 Kết chuyển gen codA vào giống đậu tương ĐT22 Kết biến nạp vector chuyển gen vào mảnh mầm đậu tương bảng 3.6 cho thấy, số lượng mẫu biến nạp cho cấu trúc khoảng 3000 mẫu, số mẫu tạo đa chồi đạt tỉ lệ từ 62,75% đến 73,55% Từ cụm chồi này, sau giai đoạn kéo dài chồi thu 128, 138, 140 chồi kéo dài tương ứng với cấu trúc HSP-codA, 35S-codA, rd29A-codA Các chồi đạt chiều cao 2,5–3,5 cm có cắt sang mơi trường tạo rễ Các chồi rễ tạo hoàn chỉnh trồng giá thể TN1 bổ sung 25% tribat Sau trình thích nghi sinh trưởng buồng sinh trưởng nhiệt độ 28 oC, độ ẩm 80%, quang chu kỳ sáng/tối 16/8, thu tổng số 60 đậu tương ba cấu trúc chuyển gen sinh trưởng phát triển tốt 3.3.2 Phân tích đậu tương chuyển gen 3.3.2.1 Sàng lọc chuyển gen chất diệt cỏ PCR Các dòng đậu tương T0 phết trực tiếp PPT 250mg/l bề mặt Sau ngày phết chất diệt cỏ, phần vị trí phết đối chứng số dòng chuyển gen co lại, dần sắc tố xanh lục chuyển vàng; sau ngày 19 phết, vị trí thử chất diệt cỏ chuyển sang vàng nâu, cháy khô Bên cạnh đó, số dịng chuyển gen khơng xuất dấu hiệu gây hại chất diệt cỏ vị trí thử, khơng bị màu màu sắc Như từ 60 dòng T0 thu sau sàng lọc chất diệt cỏ, thu 29 dòng đậu tương chuyển gen hệ T không mẫn cảm với ppt 250mg/l Các dòng T0 kiểm tra phản ứng PCR với cặp mồi codA F/R Bar F/R Kết PCR thu 27 dòng cho kết dương tính có dịng HSP-codA, 10 dịng 35S-codA dịng rd29AcodA (hình 3.14) Hình 3.14 Kết kiểm tra T0 PCR Hình tái 3.15 M: thang DNA chuẩn 1kb; P: khuẩn A tumefaciens mang vector tổ Kết hợp;quả kiểm tra T1 PCR M: thang DNA chuẩn 1kb; P: khuẩn A tumefaciens mang vector t WT: mẫu đậu tương ĐT22 WT: mẫu đậu tương ĐT22 Từ 27 dòng T0 thu hạt đem gieo sang hệ T 1, tiến hành sàng lọc kiểm tra PPT 250mg/l, thu dịng khơng mẫn cảm ppt gồm có dòng rd29A-codA dòng HSP-codA dòng PCR với cặp mồi đặc hiệu thu dòng rd29A-codA (D2, D3, D4, D7) dòng HSP-codA (H3, H11) nhận băng có kích thước khoảng 750bp 400bp phù hợp với kích thước đoạn gen codA gen bar tương ứng thể hình 3.15 Kết cho thấy, lượng dịng chuyển gen giảm hệ T1 lượng hạt thu từ in vitro T0 ít, chất lượng hạt không đồng ảnh hưởng đến sức nảy mầm hạt hệ Như vậy, thu dòng 27 dòng đậu tương mang gen codA hệ T0 dòng hệ T1, hiệu suất chuyển gen đạt khoảng 0,33% hệ T0 Để kiểm tra dòng đậu tương chuyển gen hệ chúng tơi sử dụng dịng T (D2, D3, D4, D7) mang promoter cảm ứng chịu hạn rd29A biểu hoạt động tích cực promoter này, dòng T1 (H3, H11) mang gen codA hoạt động promoter cảm ứng nhiệt HSP thu hạt bảo quản silica gel 20 3.3.2.2 Kiểm tra sự hợp biểu gen chuyển codA dòng đậu tương chuyển gen kỹ thuật Southern blot Western blot Bốn dòng đậu tương chuyển gen cấu trúc rd29A-codA hệ T1 kiểm tra kỹ thuật Southern blot để chứng minh hợp gen chuyển codA vào hệ gen đậu tương biếp nạp xác định số copy gen chuyển Kết phân tích Southern blot hình 3.16 cho thấy, băng lai DNA xuất bốn dòng đậu tương chuyển gen kiểm tra Các dịng D3, D4 D7 có băng lai xuất hiện; dòng D2 xuất băng lai Điều gen codA có copy dịng D3, D4 D7, có copy dịng D2 Băng lai hai dịng D3 D4 cho thấy hai dòng tạo từ lơ chuyển gen Kết phân tích chứng minh họp gen chuyển codA vào hệ gen đậu tương chuyển gen Hình 3.16 Kết phân tích Southern blot dịng đậu thếtích hệ T1 Hìnhtương 3.17.chuyển Kết quảgen phân Western blot dịng đậu tươn D2-D7: dòng đậu tương chuyển gen cấu trúc rd29A-codA T1đậu ; (-):tương đối chứng âm;gen P: cấu Plassmid pIBTII-35 D2-D7: hệ dòng chuyển trúc rd29A-codA Tiếp tục phân tích biểu gen chuyển codA dòng chuyển gen hệ T1 (D2, D3, D4, D7) thơng qua xác định có mặt protein tái tổ hợp Western blot Protein tái tổ hợp cấu trúc chuyển gen codA có chứa kháng nguyên cmyc đầu C, protein tái tổ hợp phát kỹ thuật Western blot Tiến hành kỹ thuật Western blot với mẫu non dòng đậu tương chuyển gen cấu trúc rd29A-codA hệ T1 để để đánh giá biểu gen chuyển cây, kết thể hình 3.17 Kết phân tích Western blot cho thấy, băng protein có kích thước ~60 kDa tương đương với khối lượng phân tử choline oxidase mã hóa gen codA tra cứu ngân hàng NCBI Trên hình 3.17, chuyển gen cho băng vạch sáng rõ, WT khơng có băng vạch tương đương Kết phân tích biểu 21 protein choline oxidase tái tổ hợp đậu tương chuyển gen codA chứng minh gen chuyển mang cấu trúc rd29A-codA HSP-codA di truyền từ hệ T0 sang hệ T1 biểu thành protein tái tổ hợp choline oxidase 3.3.3 Thử nghiệm đánh giá khả chịu hạn số dòng đậu tương chuyển gen 3.3.3.1 Đánh giá sức nảy mầm hạt điều kiện hạn nhân tạo 22 Giai đoạn hạt nảy mầm thân mầm giai đoạn quan trọng tăng trưởng phát triển thực vật đặc biệt nhạy cảm với điều kiện thiếu nước Vì thế, hạt dòng đậu tương chuyển gen hệ T đánh giá điều kiện khô hạn nhân tạo cách bổ sung 10% 15% PEG 8000 vào môi trường dinh dưỡng Sau ngày nuôi cấy môi trường không bổ sung PEG 8000 (0% PEG 8000), không nhận thấy khác biệt chiều dài thân mầm dòng ĐT22 dòng chuyển gen thể hình 3.18 cho thấy, tất hạt dịng thí nghiệm nảy mầm tốt có chiều dài thân mầm đạt xấp xỉ cm môi trường GM không chứa PEG 8000 Ngược lại, mơi trường có bổ sung 10% PEG8000, hạt dòng chuyển gen ĐT22 nảy mầm, nhiên chiều dài thân mầm dịng đậu tương khác Dịng ĐT22 khơng chuyển gen biểu giảm chiều dài thân mầm cm, ngắn hẳn so với dòng chuyển gen, hạt dòng chuyển gen trì sinh trưởng bình thường Trên mơi trường chứa 15% PEG 8000, khả nảy mầm sinh trưởng dòng ĐT22 dòng chuyển gen giảm đáng kể Khả sinh trưởng hạt môi trường bị ức chế Tuy nhiên, hạt dịng chuyển gen có tỷ lệ sinh trưởng cao có chiều dài thân mầm lớn hẳn so với dịng ĐT22 thể Hình 3.18 Khả nảy mầm đậu tương sau ngày nuôi cấy môi trường hạn nhân tạo D2-D7: dòng đậu tương chuyển gen hệ T1, WT: dòng đậu tương ĐT22 khơng chuyển gen đồ thị hình 3.19 Như vậy, nhờ biểu gen codA, hạt đậu tương có khả nảy mầm sinh trưởng tốt so với dịng khơng chuyển gen (ĐT22) điều kiện hạn nhân tạo in vitro 23 3.3.3.2 Đánh giá khả sinh trưởng chịu hạn đậu tương chuyển gen điều kiện hạn nhân tạo Để đánh giá sinh trưởng phát triển đậu tương môi trường hạn nhân tạo, hạt dòng đậu tương chuyển gen codA đậu tương ĐT22 không chuyển gen trồng riêng lẻ chậu kiểm tra phết chất diệt cỏ Ở giai đoạn thí nghiệm, đậu tương xử lý gây hạn nhân tạo buồng tăng trưởng Trong suốt q trình thí nghiệm, đậu tương chuyển gen ĐT22 đặt điều kiện đối chứng sinh trưởng phát triển bình thường điều kiện tưới đủ nước, không nhận thấy khác biệt hình thái thực vật dịng Hình 3.19 Chiều dài thân mầm dịng hạt đậu tương môi trường hạn nhân tạo D2-D7: dòng đậu tương chuyển gen hệ T1, WT: dòng ĐT22 không chuyển gen Các chữ khác cột biểu thị khác biệt P