(Luận án tiến sĩ) nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat

BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI NGUYỄN THỊ NGỌC NGHIÊN CỨU QUY TRÌNH TỔNG HỢP AFATINIB DIMALEAT LUẬN ÁN TIẾN SĨ DƯỢC HỌC CHUYÊN NGÀNH: CÔNG NGHỆ DƯỢC PHẨM & BÀO CHẾ THUỐC MÃ SỐ: 9720202 Người hướng dẫn khoa học: GS.TS Nguyễn Đình Luyện TS Nguyễn Văn Hải HÀ NỘI, NĂM 2021 LỜI CẢM ƠN Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc GS.TS Nguyễn Đình Luyện TS Nguyễn Văn Hải, hai Thầy tận tình dìu dắt, bảo, hướng dẫn, giúp đỡ có động viên sâu sắc để tơi có động lực hồn thành luận án Tôi xin trân trọng gửi lời cảm ơn đến PGS.TS Đinh Thị Thanh Hải, TS Nguyễn Văn Giang, TS Đào Nguyệt Sương Huyền toàn thể thầy cô giáo Bộ môn Công nghiệp dược - Trường đại học Dược Hà Nội ủng hộ động viên tơi suốt q trình nghiên cứu Tôi xin gửi lời cảm ơn đến gúp đỡ, cộng tác Thầy cô, anh chị công tác Quý quan: Viện Hóa học - Viện Hàn lâm khoa học Công nghệ Việt Nam, Khoa Hóa học - Trường đại học Khoa học tự nhiên - Đại học Quốc gia Hà Nội, Viện Kiểm nghiệm thuốc Trung ương, Viện Công nghệ dược phẩm quốc gia Tôi xin chân thành cảm ơn Đảng ủy, Ban giám hiệu, Phòng sau đại học, Phòng chức năng, Bộ môn chuyên ngành công nghệ dược phẩm bào chế thuốc – Trường đại học Dược Hà Nội tạo điều kiện thuận lợi, giúp đỡ tơi q trình học tập hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn thầy cô lãnh đạo Khoa Dược, Bộ môn Bào chế Công nghiệp dược – Trường đại học Y Dược Thái Nguyên, quý đồng nghiệp tạo điều kiện tốt cho trình học tập hồn thành luận án Tơi xin chân thành cảm ơn đến hệ sinh viên, dược sĩ K69, K70, K71 Trường Đại học Dược Hà Nội tơi làm việc để hồn thành kết luận án Cuối cùng, xin gửi lời cảm ơn sâu sắc đến bố mẹ, người thân, bạn bè động viên tạo động lực giúp tơi phấn đấu để hồn thành luận án NCS Nguyễn Thị Ngọc ĐẶT VẤN ĐỀ Ung thư gánh nặng cho ngành Y tế toàn cầu, tác động lên quốc gia phát triển phát triển Trong đó, ung thư phổi loại ung thư nguy hiểm nhất, với Tỷ lệ mắc Tỷ lệ tử vong cao hàng đầu Theo thống kê hệ thống báo cáo ung thư tồn cầu, giới năm có khoảng triệu bệnh nhân ung thư phổi mắc, khoảng 1,6 triệu bệnh nhân tử vong Tại Việt Nam, năm có khoảng 22 000 bệnh nhân ung thư phổi phát hiện, chiếm 17 % tổng số ca ung thư có khoảng 19 500 bệnh nhân tử vong Ung thư phổi xếp thứ số lượng bệnh nhân số lượng tử vong, sau ung thư gan Việt Nam Đông Nam Á Trong đó, ung thư phổi khơng tế bào nhỏ chiếm 85 % [145] Afatinib (biệt dược: Gilotrip, Giotrif - hãng Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals Inc.) thuốc chống ung thư tác dụng đích, ứng dụng lâm sàng lần đầu Mỹ châu Âu vào năm 2013, sau Nhật nước khác từ năm 2014 Afatinib dimaleat định liệu pháp để điều trị bệnh ung thư phổi dạng khơng tế bào nhỏ di (NSCLC) Thuốc ức chế không thuận nghịch họ thụ thể ErbB tyrosin-kinase (TKI), bao gồm: EGFR (ErbB1), HER (ErbB2), ErbB3 ErbB4 Gilotrif có dạng viên nén bao phim dùng đường uống, hàm lượng tương đương 20, 30, 40 50 mg afatinib [148] Liều dùng 40 mg lần ngày Đây loại thuốc mới, có tác động lớn đến chất lượng sống bệnh nhân ung thư Tuy nhiên giá thuốc lại đắt bệnh nhân (giá khoảng 1000 USD / hộp 30 viên 40 mg), nguyên nhân thuốc thời kỳ bảo hộ quyền quy trình tổng hợp phức tạp, ngun liệu có giá thành cao [146] Nhằm mục đích chuẩn bị nguyên liệu để nghiên cứu sau thuốc hết hạn quyền, mà nước nghiên cứu phân tử thuốc afatinib dimaleat Bên cạnh nhằm bổ sung hiểu biết, kết nghiên cứu afatinib nói riêng thuốc tác dụng đích nói trung điều trị ung thư phổi Viêt Nam Từ nghiên cứu sản xuất thuốc nước, phục vụ nhu cầu sử dụng giảm giá sản phẩn cho bệnh nhân ung thư phổi Vì việc nghiên cứu quy trình cơng nghệ tổng hợp hoạt chất cần thiết Từ chúng tơi thực luận án: “Nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat” với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình tổng hợp afatinib dimaleat quy mô 20 g/mẻ đạt tiêu chuẩn sở - Đánh giá độ ổn định đánh giá độc tính cấp afatinib dimaleat tổng hợp CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan afatinib dimaleat Afatinib dimaleat dược chất phát triển tập đồn BoehringerIngelheim (Đức), thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng đích, ức chế khơng thuận nghịch thụ thể tyrosin-kinase họ ErbB (EGFR) hệ II [80], [122] 1.1.1 Cấu trúc tính chất hóa lý • Cơng thức cấu tạo (Hình 1.1): Hình 1.1 Cơng thức cấu tạo afatinib dimaleat • Cơng thức phân tử: C32H33ClFN5O11 (C24H25ClFN5O3 C4H4O4) [148] • Tên khoa học: - (E)-N-[4-(3-cloro-4-fluoroanilino)-7-[(3S)-oxolan-3-yl] oxyquinazolin-6yl]-4-(dimethylamino)but-2-enamid, (2Z)-2-butendioat - (2E)-N-{4-[(3-cloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[(3S)-tetrahydrofuran-3yloxy]quinazolin-6-yl}-4-(dimethylamino)but-2-enamid di[(2Z)-but-2endioat]; - (S,E)-N-{4-[(3-cloro-4-fluorophenyl)amino]-7-[(tetrahydrofuran-3yl)oxy]quinazolin-6-yl}-4-(dimethylamino)but-2-enamid dimaleat • Tên chung quốc tế: Afatinib dimaleat [31] • Công thức phân tử: C32H33ClFN5O11 (C24H25ClFN5O3 C4H4O4) [148] • Khối lượng phân tử: 718,09 đvC [148] • Thơng số phân tử afatinib base : HD 2, HA 8, FRB 7, PSA 88,6, cLogP 1,569 [147] • Biệt dược: Gilotrip, Giotrip (Boehringer Ingelheim Pharmaceuticals, Inc.) [146] 1.1.2 Tác dụng dược lý ứng dụng điều trị Dựa tài liệu tham khảo [31], [107], [148], afatinib dimaleat có đặc điểm dược động học, dược lý sau: • Phân loại nhóm điều trị: Afatinib thuộc nhóm thuốc chống ung thư tác dụng đích, với chế ức chế tyrosin-kinase (TKI), chọn lọc EGFR [31], [148] • Cơ chế tác dụng: Afatinib dimaleat - hấp thu tốt đường uống, thuộc hệ số thuốc EGFR TKIs - có tác dụng ức chế tyrosin-kinase, họ thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR hay gọi ErbB), bao gồm: ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER4) [31] Các thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì protein xuyên màng chia làm phần: vùng ngoại bào chứa miền tương tác với yếu tố tăng trưởng biểu mô; vùng xuyên màng vùng nội bào chứa miền kinase phosphoryl hóa tyrosine protein (là thụ thể tyrosin-kinase ), đóng vai trị quan trọng q trình sinh sản tế bào tạo mạch nhiều loại ung thư Khi vùng ngoại bào liên kết với yếu tố tăng trưởng biểu mô, hai phân tử EGFR kết hợp với tạo dạng dimer hóa tự phosphoryl hóa tyrosin miền kinase vùng nội bào, Từ khởi động đường tín hiệu vào nhân: Ras/Raf/MEK/ERK PI3K/AKT/mTOR để điều khiển tế bào tăng trưởng, biệt hóa, phân chia, tăng sinh mạch máu, tránh tự chết theo chương trình (apoptosis)… Afatinib hoạt động cách gắn vào miền tyrosine kinase ErbB1 (EGFR), ErbB2 (HER2), ErbB4 (HER4), từ ức chế khơng thuận nghịch hoạt động autophosphoryl hóa, gây ức chế đường dẫn truyền tín hiệu vào nhân, ức chế tế bào tăng sinh, sinh trưởng khối u, sinh mạch tế bào ung thư [31] Ngoài afatinib dimaleat cịn có tác dụng dạng đột biến EGFR như: EGFR exon 19 (del19), EGFR thay exon 21 (L858R), EGFR T790M (đột biến thứ phát exon 20 gen EGFR – đột biến kháng với thuốc hệ 1) [148], [146] Hình 1.2 Cơ chế tác dụng afatinib dimaleat • Dược động học Sau uống, thời gian đạt nồng độ đỉnh huyết tương (Tmax) 2-5 Sinh khả dụng đường uống mức trung bình thử chuột (44,5 %) thấp thử lợn (11,2 %) Sinh khả dụng viên nén 20 mg đạt 92 % so với dung dịch uống Thức ăn làm giảm Cmax AUC Thuốc liên kết 95 % với protein huyết tương (chủ yếu hemoglobin) Thể tích phân bố thử người 2800-4700 lít sau uống Thuốc bị chuyển hóa chủ yếu đường phi enzym thông qua phản ứng cộng Michael, lượng nhỏ chuyển hóa nhờ xúc tác enzym CYP450 Dạng liên kết cộng hóa trị afatinib-protein chất lưu thông máu Afatinib thải trừ chủ yếu qua phân (85 %), có % tái hấp thu từ đường tiết niệu (sau dùng dung dịch uống đơn liều) Thời gian bán thải: 29,6 giờ, số Cl/F sau uống 1210 mL/phút • Chỉ định: Điều trị ung thư phổi không tế bào nhỏ giai đoạn tiến xa chỗ di có đột biến thụ thể yếu tố tăng trưởng biểu bì (EGFR) cho bệnh nhân trưởng thành chưa điều trị trước thuốc ức chế EGFR tyrosine kinase Được định để điều trị cho bệnh nhân ung thư phổi không tế bào nhỏ (NSCLC), thuộc loại ung thư phổi tế bào vảy, tiến triển chỗ di căn, hóa trị liệu dẫn chất platin [31], [107] • Dạng bào chế liều lượng, cách sử dụng: Dạng thuốc hàm lượng: Afatinib dimaleat bào chế dạng viên nén bao phim với hàm lượng: 20 mg, 30 mg, 40 mg, 50 mg tính theo afatinib base [31], [107] Liều dùng: Thông thường người lớn mắc bệnh ung thư phổi tế bào nhỏ 40 mg, lần/ngày cho điều trị bước cho bệnh nhân chưa điều trị trước EGFR tyrosin-kinase Điều trị liên tục đến bệnh tiến triển khơng cịn dung nạp Có thể cân nhắc tăng đến liều tối đa 50 mg/ngày bệnh nhân chưa dùng EGFR tyrosin-kinase mà dung nạp liều 40 mg/ngày (không bị tiêu chảy, ban, viêm miệng biến cố khác liên quan đến thuốc với mức độ >1 theo CTCAE) tuần Không nên tăng liều bệnh nhân giảm liều trước Liều tối đa 50 mg/ngày Nếu chẩn đốn bệnh phổi mơ kẽ xuất suy gan nghiêm trọng: ngừng dùng Bệnh nhân suy thận nặng (eGFR 15-29 mL/phút/1,73m2): chỉnh liều khơng dung nạp • Tác dụng không mong muốn: Rất phổ biến: viêm quanh móng; giảm ngon miệng; chảy máu cam; tiêu chảy, viêm miệng, buồn nôn, nôn; phát ban, viêm da dạng trứng cá, ngứa, khô da [159] Phổ biến: viêm bàng quang; nước, giảm kali máu; loạn vị giác; viêm kết mạc, khơ mắt; chảy nước mũi; khó tiêu, viêm mơi; tăng alanin-aminotransferase, tăng aspartat-aminotransferase; sưng bàn tay, cánh tay chân; suy giảm chức thận/suy thận; sốt; giảm cân [31], [107], [148], [150] • Một số lưu ý sử dụng: Cần thận trọng trường hợp: Bệnh nhân có tiền sử viêm giác mạc, viêm loét giác mạc, khơ mắt nặng Bệnh nhân có eGFR < 15 mL/phút/ 1,73 m2, lọc máu; suy gan nặng; trẻ em, thiếu niên; thiếu Lapp-lactase, hấp thu glucose-galactose: không khuyến cáo/khơng nên dùng Nếu biểu da bóng nước, phồng rộp, tróc vảy nặng; chẩn đốn viêm lt giác mạc; có phân suất tống máu thấp giới hạn mức bình thường: tạm ngừng ngừng vĩnh viễn điều trị Tăng nguy xuất biến cố ngoại ý qua trung gian EGFR bệnh nhân nữ, nhẹ cân có sẵn suy thận Dùng kết hợp vinorelbin gây tăng tỷ lệ tác dụng bất lợi biến cố gây tử vong liên quan nhiễm khuẩn ung thư tiến triển Không dùng kết hợp vinorelbin cho bệnh nhân ung thư vú di với HER2 dương tính Thai kỳ Khơng cho bú điều trị Thường xuất tiêu chảy tuần điều trị đầu tiên, tiêu chảy mức độ tuần điều trị đầu tiên, nên chủ động xử trí: gồm bù đủ nước kết hợp thuốc chống tiêu chảy có dấu hiệu tiêu chảy Vẫn chưa có đầy đủ nghiên cứu để xác định rủi ro dùng thuốc thời kỳ mang thai cho bú Thuốc thuộc phân loại thai kỳ mức độ D - có chứng liên quan đến nguy thai nhi người, lợi ích mang lại, việc sử dụng thuốc thai kỳ chấp thuận, bất chấp nguy Thuốc hấp thu qua da phổi, gây hại cho trẻ em bụng mẹ, nên phụ nữ mang thai có thai khơng nên cầm nắm hít phải bụi từ thuốc Các triệu chứng liều bao gồm: Buồn nơn; nơn mửa; suy nhược; chống váng; đau đầu; đau bụng • Tương tác thuốc Khơng ức chế cảm ứng isoenzym CYP 1A2, 2B6, 2C8, 2C9, 2C19 3A4 Các thuốc ức chế mạnh glycoprotein P (P-gp) ritonavir, cyclosporine A, ketoconazol, itraconazol, erythromycin, verapamil, quinidin, nelfinavir, amiodaron nên dùng cách 12 Các thuốc cảm ứng mạnh P-gp rifampicin, carbamazepin, phenytoin, phenobarbital, thảo dược St John’s (Hypericum perforatum) làm giảm nồng độ afatinib Uống bữa ăn giàu chất béo làm giảm đáng kể nồng độ theo thời gian afatinib Các nghiên cứu in vitro afatinib chất chất ức chế protein kháng ung thư vú (BCRP) vận chuyển Afatinib làm tăng sinh khả dụng chất BCRP dùng đường uống (gồm rosuvastatin sulfasalazin), nên thận trọng dùng chung [122] 1.2 Các phương pháp tổng hợp afatinib dimaleat 1.2.1 Tổng hợp afatinib base Afatinib có cấu tạo khung quinazolin nhóm thế: nhóm amin thơm chứa nguyên tử clor vị trí số fluor vị trí số 4, nhóm ether bất đối vị trí số 7, nhóm amid chứa trans anken vị trí số Các phương pháp tổng hợp xoay quanh việc xây dựng nhân quinazolin tạo nhóm khung Các phương pháp tổng hợp công bố qua đường gắn nhóm (1), (2), (4) vào khung quinazolin (3) Tuy nhiên thứ tự gắn nhóm khác ảnh hưởng đến hiệu suất trình Dưới phương pháp tổng hợp afatinib dựa theo phản ứng tổng hợp cuối cùng: Ether bất đối Amin thơm Khung quinazolin trans-alken Sơ đồ 1.1 Sơ đồ phân tích ngược cấu trúc phân tử afatinib base Phương pháp tạo liên kết amid từ: N-4-[(3-cloro-4-fluoro‐phenyl)]-7{[(3S)-tetrahydrofuran-3-yl]oxy}-4,6-quinazolindiamin (5) Trong phương pháp này, trung gian acyl hóa số tác nhân acid dẫn chất sau: Sơ đồ 1.2 Tổng hợp afatinib phản ứng tạo liên kết amid Do chứa nhóm amin thơm – NH2 phản ứng cần có xúc tác khác tùy thuộc vào tác nhân acyl: a Tổng hợp afatinib từ acid (E)-but-2-enoic Quy trình nhà hóa học Liu công bố năm 2019 [76]: Sơ đồ 1.3 Quy trình tổng hợp afatinib Liu cộng từ acid (E)-but-2-enoic Trong quy trình gồm giai đoạn, 5/6 phản ứng cho hiệu suất cao 80 % Tuy nhiên giai đoạn acyl hóa trung gian acid (E)-but-2-enoic lại có hiệu suất thấp, đồng thời cần sử dụng số tác nhân có giá thành cao formamidin acetat, POCl3 hay AIBN Các dung mơi sử dụng có độc tính cao dioxan, THF, b Tổng hợp afatinib từ (E)-dimethylaminobut-2-enoic clorid acid (18) Trong quy trình này, trung gian số tổng hợp từ số đường công bố sáng chế WO0250043A1 [36] WO03094921A2 [108] hãng Boehringer Ingelheim với nguyên liệu khởi đầu acid 2-amino-4-fluoro-5nitrobenzoic (15) theo sơ đồ 1.4 Sau trung gian ngưng tụ với clorid acid 18 để từ thu sản phẩm afatinib base Phụ lục 104 Kết thử độc tính cấp sản phẩm afatinib dimaleat BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC DƯỢC HÀ NỘI BÁO CÁO KẾT QUẢ ĐÁNH GIÁ ĐỘC TÍNH CẤP AFATINIB DIMALEAT HÀ NỘI, 12.2020 NGUYÊN VẬT LIỆU, ĐỐI TƯỢNG, PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 1.1 Mẫu thử Afatinib dimaleat, NSX: 3/2020; ngày nhận mẫu 03/11/2020 Mẫu chất rắn màu trắng, đựng lọ thủy tinh màu nâu, nút kín 1.1.2 Chuẩn bị mẫu nghiên cứu Mẫu thử pha thành hỗn dịch dung môi dung dịch natri carboxy methyl cellulose 0,5% với nồng độ 15mg/ ml 100 mg/ ml động vật uống 1.2 Phương tiện nghiên cứu 1.2.1 Động vật nghiên cứu - Chuột nhắt trắng trưởng thành, giống cái, Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp - Động vật ni ổn định với điều kiện phịng thí nghiệm Bộ môn Dược lực, Trường ĐH Dược Hà Nội ngày trước thực nghiên cứu, nuôi dưỡng thức ăn tiêu chuẩn Viện Vệ sinh dịch tễ trung ương cung cấp, uống nước tự 1.2.2 Thiết bị dụng cụ nghiên cứu - Cân phân tích 10-4 A&D, GR200 (Nhật Bản) - Cân kĩ thuật 10-2A&D, EK410i (Hàn Quốc) - Các dụng cụ bắt giữ động vật, bơm kim đầu tù động vật uống - Bộ dụng cụ mổ 1.3 Phương pháp nghiên cứu Phương pháp thử độc tính cấp theo phương pháp phân loại độc OECD (No 423) [1], [3] 1.3.1 Thiết kế thí nghiệm - Chuột nhắt trắng, giống cái, nhịn ăn trước thí nghiệm Kiểm tra cân nặng trước thử nghiệm - Cách dùng mẫu thử: Chuột nghiên cứu cho uống mẫu thử mức liều tương ứng theo hướng dẫn OECD, với thể tích 0,2 mL/10 g chuột Sau uống mẫu thử giờ, chuột cho ăn trở lại, uống nước bình thường - Tiến hành thử nghiệm: chuột thí nghiệm chia thành nhóm, nhóm Mỗi nhóm chuột dùng mức liều khởi đầu số mức: 5, 50, 300 2000 mg/ kg Tùy thuộc kết quan sát biểu độc tính số động vật tử vong nhóm sau dùng mức liều khởi đầu để tiếp tục lựa chọn mức liều dùng cho nhóm tiếp theo, thử thêm nhóm với liều dùng chuyển sang dùng mức liều thấp cao có xác định phân loại độc mẫu thử theo mức độ độc GHS - Theo dõi động vật vòng 14 ngày sau dùng mẫu thử (theo dõi chặt chẽ động vật 30 phút sau cho uống, theo dõi liên tục vòng theo dõi thường xuyên vòng 24 sau dùng mẫu thử) 1.3.2 Theo dõi, đánh giá - Tình trạng chung chuột: hoạt động tự nhiên, tư thế, màu sắc (mũi, tai, đuôi), lông, tiết dịch, phản xạ với kích thích, phân, nước tiểu… - Sự tiêu thụ thức ăn, nước uống, thay đổi cân nặng - Khi có động vật chết, mổ để quan sát đại thể quan phủ tạng Nếu có dấu hiệu đáng nghi mà không xác định rõ nguyên nhân, cần, làm thêm vi thể để xác định nguyên nhân - Tiếp tục theo dõi động vật 14 ngày sau uống chế phẩm thử - Căn vào kết số lượng chuột chết thu nhóm để phân loại mẫu thử theo mức độ độc GSH theo hướng dẫn với mức liều khởi đầu cụ thể (phụ lục [3]) KẾT QUẢ 2.1 Kết thử nghiệm với mức liều khởi đầu lần Dựa số tài liệu tham khảo độc tính afatinib [2], [4], tiến hành thử nghiệm với mức liều khởi đầu 300 mg/ kg cân nặng chuột dùng theo đường uống cho nhóm chuột Kết quả: vòng sau uống mẫu thử, chuột khơng có biểu bất thường, sau chuột giảm hoạt động, xù lơng, niêm mạc nhợt nhạt, ăn uống Sau ngày, chuột cịn xù lơng, 2/3 chuột giảm hoạt động, ăn 1/3 chuột giảm cân nặng, 2/3 chuột tăng cân nhẹ Sau 7-8 ngày, chuột dần hồi phục, bớt xù lông, tăng dần vận động ăn uống, niêm mạc hồng hào trở lại Sau ngày, 3/ chuột ăn uống, vận động bình thường, phản xạ tốt với kích thích, lơng mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khô, nước tiểu bình thường; khơng có chuột chết sau 14 ngày Sự thay đổi cân nặng chuột thời gian thử nghiệm thể hình Hình1: Sự thay đổi cân nặng chuột, thử nghiệm liều 300 mg/ kg lần 2.2 Kết thử nghiệm với mức liều khởi đầu lần hai Từ kết thử nghiệm với mức liều thứ nhất, tiến hành thử nghiệm nhóm chuột khác với mức liều 300 mg/ kg cân nặng chuột dùng theo đường uống Kết quả: vòng sau uống mẫu thử, chuột khơng có biểu bất thường, sau 3- giờ, chuột giảm hoạt động, xù lông, niêm mạc nhợt nhạt, ăn uống Sau ngày, chuột cịn xù lơng, 3/3 chuột giảm hoạt động, ăn 3/3 chuột giảm cân nặng Sau 6- ngày, chuột dần hồi phục, bớt xù lông, tăng dần vận động ăn uống, niêm mạc hồng hào trở lại Sau ngày, chuột ăn uống, vận động bình thường, phản xạ tốt với kích thích, lơng mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khơ, nước tiểu bình thường; khơng có chuột chết sau 14 ngày Sự thay đổi cân nặng chuột thời gian thử nghiệm thể hình Hình 2: Sự thay đổi cân nặng chuột, thử nghiệm liều 300 mg/ kg lần 2.3 Kết thử nghiệm với mức liều thứ hai Từ kết thử nghiệm với mức liều 300 mg/ kg lần thứ hai, tiến hành thử nghiệm với mức liều cao 2000 mg/ kg cân nặng chuột dùng theo đường uống cho nhóm chuột Kết quả: vòng sau uống mẫu thử, chuột khơng có biểu bất thường, sau chuột giảm hoạt động, xù lơng, niêm mạc nhợt nhạt, ăn uống Trong vịng 72 giờ, có chuột chết, mổ chuột quan sát đại thể thấy tim, phổi bình thường, niêm mạc dày mỏng Trong vòng 96 giờ, chuột lại chết, mổ chuột quan sát đại thể thấy tim, phổi bình thường, niêm mạc dày mỏng Như vậy, sau ngày, chuột uống mức liều 2000mg/ kg chết 2.4 Kết phân loại độc dựa mức liều thử Từ kết thử nghiệm nhóm chuột với mức liều 300 mg/ kg 2000 mg/ kg Sử dụng phụ lục 2c hướng dẫn 423 OECD [3], xác định phân loại độc giá trị LD50 cut-off mẫu afatinib dimaleat thử Kết thể hình 3: Hình 3: Kết mức liều thử phân loại độc mẫu afatinib dimaleat KẾT LUẬN Mẫu thử afatinib dimaleat thử độc tính cấp theo phương pháp phân loại độc, hướng dẫn số 423 OECD, dùng theo đường uống chuột nhắt trắng, thể độc tính cấp mức độ (LD50 < 300 - 2000) theo phân loại GHS, giá trị LD50 cut-off 500 mg/ kg Biểu độc tính quan sát mức liều thử (300 mg/ kg 2000 mg/ kg) xù lông, giảm hoạt động, niêm mạc nhợt nhạt, giảm ăn uống, giảm cân nặng, chết Những chuột sống, thường phục hồi dần sau 6-7 ngày trở bình thường sau 9- 10 ngày Sau 14 ngày, chuột ăn uống, vận động bình thường, phản xạ tốt với kích thích, lơng mượt, niêm mạc hồng hào, mắt sáng, phân khơ, nước tiểu bình thường TÀI LIỆU THAM KHẢO Tiếng Việt Đỗ Trung Đàm (2015), Phương pháp xác định độc tính cấp thuốc, Nhà xuất Y học, Hà Nội Tiếng Anh EMA (2013), Committee for Medicinal Products for Human Use (CHMP) report:Giotrif, https://www.ema.europa.eu/en/documents/assessment-report/giotrif-epar-public-assessment-report_en.pdf OECD (2002), Test No 423: Acute Oral Toxicity – Acute Toxic Method, OECD Guidelines for the Testing of Chemicals, Section 4, OECD Publishing, Paris DOI: https://doi.org/10.1787/9789264071001-en TGA (2014), Australian Public Assessment Report for Afatinib (as dimaleat), https://www.tga.gov.au/auspar/auspar-afatinib-dimaleate ... việc nghiên cứu quy trình cơng nghệ tổng hợp hoạt chất cần thiết Từ chúng tơi thực luận án: ? ?Nghiên cứu quy trình tổng hợp afatinib dimaleat? ?? với mục tiêu sau: - Xây dựng quy trình tổng hợp afatinib. .. dung nghiên cứu Luận án gồm nội dung nghiên cứu: ❖ Nội dung 1: Khảo sát tổng hợp afatinib dimaleat tinh chế quy mơ phịng thí nghiệm Quy trình tổng hợp phân tử afatinib dimaleat nhóm nghiên cứu. .. Nghiên cứu độ ổn định sản phẩm afatinib dimaleat tổng hợp ❖ Nội dung 5: Thử độc tính afatinib dimaleat tổng hợp 2.3 Phương pháp nghiên cứu 2.3.1 Phương pháp tổng hợp hóa học + Sử dụng trình tổng