Tài liệu Chương 3 Protein docx

47 Chương Protein Protein hợp chất hữu có ý nghĩa quan trọng bậc thể sống, mặt số lượng, protein chiếm không 50% trọng lượng khô tế bào; thành phần cấu trúc, protein tạo thành chủ yếu từ amino acid vốn nối với liên kết peptide Cho đến người ta thu nhiều loại protein dạng tinh thể từ lâu nghiên cứu kỹ thành phần nguyên tố hoá học phát thông thường cấu trúc protein gồm bốn nguyên tố C, H, O, N với tỷ lệ C ≈ 50%, H ≈ 7%, O ≈ 23% N ≈ 16% Đặc biệt tỷ lệ N protein ổn định (lợi dụng tính chất để định lượng protein theo phương pháp Kjeldahl cách tính lượng N nhân với 6,25) Ngồi protein cịn gặp số ngun tố khác S ≈0-3% P, Fe, Zn, Cu Phân tử protein có cấu trúc, hình dạng kích thước đa dạng, khối lượng phân tử (MW) tính Dalton (1Dalton = 1/1000 kDa, đọc kiloDalton) loại protein thay đổi giới hạn rộng, thông thường từ hàng trăm hàng triệu ví dụ: insulin có khối lượng phân tử 5.733; glutamat-dehydrogenase gan bị có khối lượng phân tử 1.000.000, v.v Từ lâu người ta biết protein tham gia hoạt động sống thể sinh vật, từ việc tham gia xây dưng tế bào, mô, tham gia hoạt động xúc tác nhiều chức sinh học khác Ngày nay, hiểu rõ vai trò to lớn protein thể sống, người ta thấy rõ tính chất vật ý nghĩa định nghĩa thiên tài Engels P “Sống phương thức tồn thể protein” Với phát triển khoa học, vai trò ý nghĩa protein sống khẳng định Cùng với nucleic acid, protein sở vật chất sống 3.1 Amino acid 3.1.1 Cấu tạo chung Amino acid chất hữu mà phân tử chứa nhóm carboxyl (COOH) nhóm amine (NH2), trừ proline có nhóm NH (thực chất imino acid) 48 Trong phân tử amino acid có nhóm COOH NH2 gắn với carbon vị trí α Hầu hết amino acid thu nhận thuỷ phân protein dạng L-α amino acid Như protein khác mạch nhánh (thường ký hiệu: R) Hình: 3.1 Cơng thức cấu tạo chung amino acid 3.1.2 Phân loại amino acid Hiện người ta phân loại amino acid theo nhiều kiểu khác nhau, kiểu phân loại có ý nghĩa mục đích riêng Tuy nhiên, họ dựa cấu tạo hố học số tính chất gốc R Ví dụ có người chia amino acid thành nhóm nhóm mạch thẳng nhóm mạch vịng Trong nhóm mạch thẳng lại tuỳ theo có mặt số nhóm carboxyl hay số nhóm amine mà chia thành nhóm nhỏ, nhóm amino acid trung tính (chứa nhóm COOH nhóm NH2); nhóm amino acid kiềm (chứa nhóm COOH hai nhóm NH2); nhóm amino acid acid (chứa hai nhóm COOH nhóm NH2) Trong nhóm mạch vịng lại chia thành nhóm đồng vịng hay dị vịng v.v Có người lại dựa vào tính phân cực gốc R chia amino acid thành nhóm: nhóm khơng phân cực kỵ nước, nhóm phân cực khơng tích điện, nhóm tích điện dương nhóm tích điện âm Tuy nhiên, cách phân loại amino acid nhiều người sử dụng dựa vào gốc R amino acid chia làm nhóm: Nhóm I Gồm amino acid có R khơng phân cực, kỵ nước, là: glycine, alanine, proline, valine, leucine, isoleucine methionine (Hình 3.2) 49 Hình 3.2 Cơng thức cấu tạo amino acid nhóm I Nhóm II Gồm amino acid có gốc R chứa nhân thơm, phenylalanine, tyrosine tryptophan (Hình 3.3.) Hình 3.3 Cơng thức cấu tạo amino acid nhóm II 50 Nhóm III Gồm amino acid có gốc R phân cực, khơng tích điện, serine, theonine, cysteine, aspargine glutamine (Hình 3.4) Hình: 3.4 Cơng thức cấu tạo amino acid nhóm III Nhóm IV Gồm amino acid có R tích điện dương, lysine, histidine arginine, phân tử chứa nhiều nhóm amin (hình 3.5) Hình 3.5 Cơng thức cấu tạo amino acid nhóm IV 51 Nhóm V Gồm amino acid có gốc R tích điện âm, aspartate glutamate, phân tử chứa hai hóm carboxyl (hình 3.6) Hình 3.6 Cơng thức cấu tạo amino acid nhóm V 3.1.3 Các amino acid thường gặp Các amino acid thường gặp amino acid thường có mặt thành phần loại protein Chúng có khoảng 20 loại thu nhận thuỷ phân protein Các loại amino acid có tên gọi, khối lượng phân tử ký hiệu trình bày bảng 3.1 3.1.4 Các amino acid thay Các amino acid hình thành nhiều đường khác Như biết, phân tử protein có khoảng 20 loại amino acid, nhiên thể người động vật không tổng hợp tất loại mà phải đưa từ ngồi vào qua thức ăn Những amino acid phải đưa từ ngồi vào gọi amino acid khơng thể thay Người ta biết có khoảng 8-10 loại amino acid thay bao gồm: Met, Val, Leu, Ile, Thr,Phe, Trp, Lys, Arg His ngày người ta xem Cys amino acid khơng thể thay 3.1.5 Các amino acid gặp Ngoài amino acid thường gặp trên, phân tử protein đơi cịn có số amino acid khác, loại gặp Các amino acid dẫn xuất amino acid thường gặp như: phân tử collagen có chứa 4-hydroxyproline dẫn xuất proline, 5hydroxylysine dẫn xuất lysine v.v Mặt khác, khơng có cấu trúc protein, có hàng trăm loại amino acid khác tồn dạng tự liên kết với hợp chất khác mô tế 52 bào, chúng chất tiền thân sản phẩm trung gian trình chuyển hoá thể Bảng 3.1 Các amino acid thường gặp Tên amino acid Glycine Alanine Tên amino acid gọi theo danh pháp hoá học α-aminoacetic acid α-aminopropionic acid Tên viết tắt Gly Ala Ký hiệu G A Khối lượng (MW) 75 89 Proline α-pyrolydilcarboxylic acid Pro P 115 Valine α-aminoisovaleric acid Val V 117 Leucine α-aminoisocaproic acid Leu L 131 Isoleucine α-amino-β-metylvaleric acid Ile I 131 Methionine α-amino-γ-metylthiobutyric acid Met M 149 Phe F 165 Phenylalanine α-amino-β-phenylpropionic acid Tyr Y 181 Tryptophan α-amino-βhydroxyphenylpropionic acid α-amino-β-indolylpropionic acid Trp W 204 Serine α-amino-β-hydoxypropionic acid Ser S 105 Threonine α-amino-β-hydroxybutiric acid Thr T 119 Cysteine α-amino-β-thiopropionic acid Cys C 121 Aspargine amid aspartate Asn B 132 Glutamine amid glutamate Gln Q 146 Lysine α,ε diaminocaproic acid Lys K 146 Histidine α-amino-β-imidazolpropionic acid His H 155 Arginine α-amino-δ-guanidinvaleric acid Arg R 174 Aspartate α-aminosuccinic acid Asp D 133 Glutamate α-aminoglutarate Glu E 147 Tyrosine 3.1.6 Một số tính chất amino acid 3.1.6.1 Màu sắc mùi vị amino acid Các amino acid thường khơng màu, nhiều loại có vị kiểu đường glycine, alanine, valine, serine, histidine, tryptophan; số loại có vị đắng isoleucine, arginine khơng có vị leucine Bột 53 hay cịn gọi mì muối natri với glutamic acid (monosodium glutamate) 3.1.6.2 Tính tan amino acid Các amino acid thường dễ tan nước, amino acid khó tan alcohol ether (trừ proline hydroxyproline), chúng dễ hoà tan acid kiềm lỗng (trừ tyrosine) 3.1.6.3 Biểu tính quang học amino acid Hình 3.7 Đồng phân lập thể alanine Các amino acid phân tử protein có carbon bất đối (trừ glycine) có biểu hoạt tính quang học, nghĩa làm quay mặt phẳng ánh sáng phân cực sang phải sang trái Quay phải ký hiệu dấu (+), quay trái ký hiệu dấu (-) Góc quay đặc hiệu amino acid phụ thuộc vào pH môi trường Tuỳ theo xếp cấu trúc phân tử nhóm liên kết với carbon bất đối mà amino acid có cấu trúc dạng D hay L (hình 3.7) gọi đồng phân lập thể Số đồng phân lập thể tính theo 2n (n số carbon bất đối) Hầu hết amino acid khác hấp thụ tia cực tím bước sóng (λ) khoảng từ 220 - 280 nm Đặc biệt nồng độ 10-3M, bước sóng khoảng 280 nm, tryptophan hấp thụ ánh sáng cực tím mạnh nhất, gấp lần khả hấp thụ tyrosine (hình 3.8) phenylalanine yếu 54 Phần lớn protein chứa tyrosine nên người ta sử dụng tính chất để định lượng protein Độ hấp phụ λ - Bước sóng(nm) Hình 3.8 Phổ hấp thụ ánh sáng cực tím tryptophan tyrosine 3.1.6.4 Tính lưỡng tính amino acid Trong phân tử amino acid có nhóm carboxyl -COOH nên có khả nhường proton (H+) thể tính acid, mặt khác có nhóm amin- NH2 nên có khả nhận proton nên thể tính base Vì amino acid có tính chất lưỡng tính Trong mơi trường acid, amino acid dạng cation (tích điện dương), tăng dần pH amino acid nhường proton thứ chuyển qua dạng lưỡng cực (trung hoà điện), tiếp tục tăng pH amino acid nhường proton thứ hai chuyển thành dang anion (tích điện âm) Vì đơi người ta coi di-acid cation lưỡng cực anion Hình 3.9 Tính lưỡng tính amino acid 55 Tương ứng với độ phân ly H+ nhóm COOH NH3+ có trị số pK1 pK2 (biểu thị độ phân ly nhóm 1/2) Từ trước tiên chuyển sang dạng lưỡng tính sau chuyển thành dạng anion Độ phân ly H+ Hình 3.10 Đường cong chuẩn độ glycine nồng độ M 25OC Người ta xác định pHi (pI= pH đẳng điện) = pK1 + pK2 / Ví dụ hồ tan glycine vào mơi trường acid mạnh glycine dạng cation Nếu tăng dần lượng kiềm, thu đường cong chuẩn độ Trên đường cong chuẩn độ thấy glycine nhường proton trước Tương đương độ phân ly nhóm COOH nửa có trị số pK1= 2,34 độ phân ly NH3+ nửa có trị số pK2= 9,60 Như ta có 2,34 + 9,60 pHi = = 5,97 56 Bảng: 3.2 Các trị số pK amino acid thường gặp Tên amino acid Glycine Alanine Proline Valine Leucine Isoleucine Methionine Phenylalanine Tyrosine Tryptophan Serine Theonine Cysteine Aspargine Glutamine Lysine Histidine Arginine Aspartate Glutamate pI Các trị số pK pK1(của COOH) pK2(của NH+3) pKR(của R) 2,34 2,34 1,99 2,32 2,36 2,36 2,28 1,83 2,20 2,38 2,21 2,11 1,96 2,02 2,17 2,18 1,83 2,17 1,88 2,19 9,60 9,60 10,96 9,62 9,60 9,68 9,21 9,13 9,11 9,39 9,15 9,62 10,28 8,80 9,13 8,95 9,17 9,04 9,60 9,67 10,07 8,18 10,53 6,00 12,48 3,65 4,25 5,97 6,01 6,48 5,97 5,98 6,02 5,74 5,48 5,66 5,89 5,68 5,87 5,07 5,41 5,65 9,74 7,59 10,76 2,77 3,22 Mặt khác pK1 + phân ly H+ nhóm COO- glycine 99%, 1% dạng COOH pK2 -2 dạng NH3+ 99%, 1% dạng NH2 Như vùng pH từ pK1 + đến pK2 -2, phân tử glycine chủ yếu dạng lưỡng tính kết ta có vùng đẳng điện Ngoài amino acid gốc R có thêm nhóm COOH hay NH2 phân ly chúng có thêm trị số phân ly nữa-pKR (xem bảng 3.2) 3.1.7 Các phản ứng hoá học amino acid Các amino acid có nhóm NH2 COOH liên kết với Cα, chúng có tính chất hố học chung Mặt khác amino acid khác gốc R, chúng có phản ứng riêng biệt Người ta chia phản ứng hố học amino acid thành nhóm: 64 3.2.3.4 Oxytocin, Vasopressin Vasotocin Oxytocin peptide có amino acid Ở động vật có vú, oxytocin khác thay đổi amino acid là: amino acid vị trí thứ ba isoleucine amino acid vị trí thứ tám leucine (bảng 3.3) Vasopressin lồi ếch nhái có cấu trúc trung gian vasopresin oxytocin động vật có vú (amino acid thứ ba isoleucin amino acid thứ tám arginine có tên vasotocin) Vasopressin peptide có cấu trúc gồm amino acid Bảng 3.3 So sánh cấu trúc hoá học oxytocin vasopressin số loài động vật Va- Lysine Vasopressin Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Lys-Gly-NH2 So2 Arginine vasopressin Cys-Tyr-Phe-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 Lợn, Hà mã Phần lớn động vật có vú pres- sin Vasotocin Oxytocin Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Arg-Gly-NH2 Cys-Tyr-Ile-Glu-Asn-Cys-Pro-Leu-Gly-NH2 Động vật có xương sống, khơng có vú Động vật có xương sống có vú, chim Phần lớn động vật có vú amino acid thứ vasopressin arginine (arg-vasopressin), trừ lợn hà mã, amino acid thứ lysine (lysvasopressin) Oxytocin có tác dụng trơn tử cung tuyến vú, gây co tử cung sinh kích thích tiết sữa cho bú Vasopressin có tác dụng chống lợi niệu, tăng cường tái hấp thu nước thận, đồng thời làm co mạch, có tác dụng tăng huyết áp 3.3 Protein 3.3.1 Cấu trúc phân tử bậc 1, 2, 3, Về mặt cấu trúc người ta phân biệt protein gồm bốn bậc: bậc I, bậc II, bậc III bậc IV (Hinh 3.17) 65 Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV Hình 3.17 Sơ đồ bậc cấu trúc protein 3.3.1.1 Cấu trúc bậc I Cấu trúc bậc I biểu thị trình tự gốc amino acid chuỗi polypeptide, cấu trúc giữ vững liên kết peptide (liên kết cộng hóa trị) Cấu trúc bậc I phiên mã di truyền, việc xác định cấu trúc bậc I sở để tổng hợp nhân tạo protein phương pháp hoá học kỹ thuật công nghệ sinh học Hiện nhiều loại protein biết trình tự amino acid chuỗi polypeptide như: ribonuclease protein có 124 amino acid nối với thành chuỗi, có cầu disulfua (hình 3.18); hemoglobin protein có chuỗi polypeptide, chuỗi α ( chuỗi 141 amino acid) chuỗi β (mỗi chuỗi 146 amino acid); trypsinogen bò (229 amino acid); kimotrypsin bò (229 amino acid); alcol dehydrogenase ngựa (374 amino acid); glutamate dehydrogenase bò (500 amino acid) v.v 66 Hình 3.18 Cấu trúc bậc ribonuclesae bò 3.3.1.2 Cấu trúc bậc II Biểu thị xoắn chuỗi polypeptide, tương tác không gian gốc amino acid gần mạch polypeptide Xoắn α Liên kết hydrogen Xoắn β Hình 3.19 Các kiểu xuắn cấu trúc bậc II protein Nói cách khác, cấu trúc bậc II dạng không gian cục phần mạch polypeptide Cấu trúc làm bền nhờ liên kết 67 hydrogen tạo thành liên kết peptide kề gần nhau, cách khoảng xác định Theo Pauling Cori (1951) cấu trúc bậc II protein bao gồm kiểu xoắn α phiến gấp β Ở tóc người ta tìm thấy keratin loại protein có hai dạng cấu trúc: dạng α bình thường dạng β duỗi thẳng.; cấu trúc phiến gấp β tìm thấy fibroin tơ Cấu trúc xuắn α tìm thấy nhiều loại protein khác Mặt khác tỷ lệ % xoắn α protein khác thay đổi nhiều Ví dụ hemoglobin mioglobin 75%; lysosyme 35%; ribonuclease 17% Bảng 3.4 Số lượng xoắn α phiến gấp β chuỗi đơn số protein Số gốc (%) Protein (số gốc) Chymotrypsin (247) Ribonuclease (124) Carboxypeptidase (397) Cytochrom C (104) Lysosyme (129) Myoglobin (153) Xoắn α Phiến gấp β 14 26 38 39 40 78 45 35 17 12 Ngồi cịn có kiểu xoắn collagen tìm thấy phân tử collagen (hình 3.20) Hình 3.20 Cấu trúc kiểu xuắn collagen 68 Đơn vị cấu trúc tropocollagen bao gồm mạch polypeptide bện vào thành dây cáp siêu xoắn (vì mạch đơn có cấu trúc xoắn, chiều cao gốc xoắn trục siêu xoắn 2,9 anstron, vòng xoắn 3,3 gốc amino acid Ba chuỗi polypeptide “dây cáp” nối với liên kết hydrogen 3.3.1.3 Cấu trúc bậc III Biểu thị xoắn cuộn khúc chuỗi polypeptide thành khối, đặc trưng cho potein cầu, tương tác không gian gốc amino acid xa chuỗi polypeptide Trong nhiều protein hình cầu có chứa gốc Cys tạo nên liên kết disulfua gốc Cys xa chuỗi polypeptide làm cho chuỗi bị cuộn lại (xem myoglobin hình 3.21) Ngồi cấu trúc bậc III giữ vững loại liên kết khác Van der Waals, liên kết hydrogen, liên kết tĩnh điện gốc amino acid v.v 3.3.1.4 Cấu trúc bậc IV Biểu thị kết hợp chuỗi có cấu trúc bậc III phân tử protein Hay nói cách khác, phân tử protein có cấu trúc từ hay nhiều chuỗi protein hình cầu, tương tác với khơng gian tạo nên cấu trúc bậc IV Mỗi chuỗi polypeptide gọi tiểu đơn vị (subunit), chúng gắn với nhờ liên kết hydrogen, tương tác Van der Waals nhóm phân bố bề mặt tiểu đợn vị để làm bền cấu trúc bậc IV Myoglobin Hemoglobin Hình 3.21 Cấu trúc bậc III myoglobin bậc IV hemoglobin (hemoglobin protein có chuỗi polypeptide2 chuỗi α chuỗi β; myoglobin gồm chuỗi polypeptide) 69 3.3.2 Một vài tính chất protein 3.3.2.1 Tính chất lý-hố protein - Tính tan protein Các loại protein khác có khả hồ tan dễ dàng số loại dung môi định, chẳng hạn albumin dễ tan nước; globulin dễ tan muối loãng; prolamin tan ethanol, glutelin tan dung dịch kiềm acid lỗng v.v - Tính ngậm nước protein Trong môi trường nước, protein kết hợp với nước trương lên trở thành dạng keo, hay nói cách khác protein trạng thái hydrate hoá, phân tử nước bám vào nhóm ưa nước phân tử protein -NH2, -COOH , lớp áo nước bao quanh phân tử protein yếu tố làm bền vững cấu trúc, ngăn cách phân tử protein khơng cho chúng dính vào để thành tủa - Độ nhớt dung dịch protein Khi protein hoà tan dung dịch, loại dung dịch protein khác có độ nhớt khác (bảng 3.5) Người ta lợi dụng tính chất để xác định khối lượng phân tử protein (độ nhớt cao khối lượng phân tử cao) Bảng 3.5 Độ nhớt số protein Protein Gelatin Albumin trứng Gelatin Albumin trứng Nồng độ % (trong nước) 3,0 3,0 8,0 8,0 Độ nhớt tương đối (của nước =1) 4,54 1,20 14,2 1,57 - Hằng số điện môi dung dịch protein Khi thêm dung môi hữu trung tính ethanol, aceton vào dung dịch protein nước độ tan protein giảm protein kết tủa việc giảm mức độ hydrate hoá nhóm ion hố protein, lớp áo nước, phân tử protein kết hợp với thành tủa Như vậy, số điện môi dung môi làm ngăn cản lực tĩnh điện nhóm tích điện protein nước Mối liên hệ đặc trưng biểu thức: 70 L1 - l2 F= Dr2 Trong đó: D - số điện mơi dung dịch F- lực tĩnh điện ion tích điện L1 , l2 - điện tích ion, r - khoảng cách ion - Tính chất điện li protein Cũng amino acid, protein chất điện li lưỡng tính phân tử protein có nhiều nhóm phân cực mạnh (bên gốc R) amino acid ví dụ: nhóm COOH thứ hai Asp, Glu; nhóm NH2 Lys; nhóm OH Ser, Thr, Tyr v.v Trạng thái tích điện nhóm phụ thuộc vào pH môi trường Ở pH mà tổng điện tích (+) điện tích (-) phân tử protein không, phân tử protein không di chuyển điện trường gọi pHi (isoelectric - điểm đẳng điện) protein Như protein chứa nhiều Asp, Glu (amino acid có tính acid mạnh) pHi vùng acid, ngược lại nhiều amino acid kiềm Lys, Arg, His pHi vùng kiềm Ở mơi trường có pH < pHi , protein đa số cation, số điện tích dương lớn số điện tích âm Ở pH > pHi phân tử protein thể tính acid, cho ion H+, số điện tích âm lớn số điện tích dương, protein đa anion, tích điện âm Bảng 3.5 Giá trị pHi số protein Protein Pepsin Albumin trứng Casein Albumin huyết Gelatin pHi 1,0 4,6 4,7 4,9 4,9 Protein Globulin sữa Hemoglobin Ribonuclease Trypsin Cytochrom C Prolamin pHi 5,2 6,8 7,8 10,5 10,6 12,0 Trong môi trường có pH = pHi protein, protein dễ dàng kết tụ lại với người ta lợi dụng tính chất để xác định pHi protein để kết tủa protein Mặt khác sai khác pHi protein mà điều chỉnh pH môi trường để tách riêng protein khỏi hỗn hợp chúng 71 - Sự kết tủa muối dung dịch protein Muối trung tính có ảnh hưởng rõ tới độ hồ tan protein hình cầu: với nồng độ thấp chúng làm hồ tan nhiều protein Tác dụng khơng phụ thuộc vào chất muối trung tính, mà phụ thuộc vào nồng độ muối số điện tích ion dung dịch, tức phụ thuộc vào lực ion μ dung dịch (μ = 1/2 ∑ C1 Z1, ∑ ký hiệu tổng, C1 nồng độ ion, Z1 điện tích ion) Các muối có ion hố trị (MgCl2, MgSO4 ) làm tăng đáng kể độ tan protein muối có ion hố trị (NaCl, NH4Cl, KCl ) Khi tăng đáng kể nồng độ muối trung tính độ tan protein bắt đầu giảm nồng độ muối cao, protein bị kết tủa hồn tồn Các protein khác bị kết tủa nồng độ muối trung tính khác Người ta sử dụng tính chất để chiết xuất tách riêng protein khỏi hỗn hợp Đó phương pháp diêm tích (kết tủa protein muối) Thí dụ dùng muối amonium sulfate 50% bảo hồ kết tủa globulin dung dịch amonium sulfate bảo hoà để kết tủa albumin từ huyết - Biểu quang học protein Cũng nhiều chất hoá học khác, protein có khả hấp thụ xạ ánh sáng dạng lượng tử hγ Vì đo cường độ hấp thụ protein dung dịch hay gọi mật độ quang thường ký hiệu chữ OD (Optical Density) Dựa tính chất người ta sản xuất loại máy quang phổ hấp thụ để phân tích protein Nhìn chung protein có khả hấp thụ ánh sáng vùng khả kiến (từ 350nm- 800nm) vùng tử ngoại (từ 320nm xuống tới 180nm) Trong vùng ánh sáng khả kiến protein kết hợp với thuốc thử hấp thụ mạnh vùng ánh sáng đỏ 750nm (định lượng protein theo Lowry) Đối với vùng tử ngoại dung dịch protein có khả hấp thụ ánh sáng tử ngoại hai vùng bước sóng khác nhau: 180nm-220nm 250nm - 300nm Ở bước sóng từ 180nm-220nm vùng hấp thụ liên kết peptide protein, cực đại hấp thụ 190nm Do liên kết peptide có nhiều phân tử protein nên độ hấp thụ cao, cho phép định lượng tất loại protein với nồng độ thấp Tuy nhiên vùng hấp thụ liên kết peptide protein bị dịch phía có bước sóng dài có số tạp chất lẫn dung dịch protein Mặt khác tạp chất hấp thụ ánh sáng tử ngoại vùng bước sóng 180nm-220nm Vì thực tế thường đo độ hấp thụ dung dịch protein bước sóng 220nm-240nm Ở bước sóng từ 250nm-300nm vùng hấp thụ amino acid thơm (Phe, Tyr, Trp) có trongphân tử protein hấp thụ cực đại 280nm Có thể sử dụng phương pháp đo độ hấp thụ dung dịch protein bước sóng 280nm 72 để định tính định lượng protein có chứa amino acid thơm Hàm lượng amino acid thơm protein khác thay đổi nhiều, dung dịch protein khác có nồng độ giống khác độ hấp thụ bước sóng 280nm Ngồi có nhiều chất khác dung dịch có ảnh hưởng đến độ hấp thụ protein Vì vậy, phương pháp đo độ hấp thụ vùng ánh sáng tử ngoại thường dung để định lượng protein tinh để xác định protein phân đoạn nhận sắc ký tách protein qua cột - Kết tủa thuận nghịch không thuận nghịch protein Khi protein bị kết tủa đơn dung dịch muối trung tính có nồng độ khác alcohol, acetone nhiệt độ thấp protein giữ nguyên tính chất kể tính chất sinh học hồ tan trở lại gọi kết tủa thuận nghịch Các yếu tố kết tủa thuận nghịch dùng để thu nhận chế phẩm protein Trong trình kết tủa thuận nghịch muối trung tính vừa làm trung hồ điện vừa loại bỏ lớp vỏ hydrate hố protein, cịn dung mơi hữu vốn háo nước phá hủy lớp vỏ hydrate nhanh chóng Trong chế phẩm protein nhận lẫn chất dùng để kết tủa, cần sử dụng phương pháp thích hợp để loại bỏ chất Ví dụ dùng phương pháp thẩm tích để loại bỏ muối Ngược lại kết tủa không thuận nghịch protein sau bị kết tủa phục hồi lại trạng thái ban đầu Sự kết tủa thường sử dụng để loại bỏ protein khỏi dung dịch, làm ngưng phản ứng enzyme Một yếu tố gây kết tủa không thuận nghịch đơn giản đun sơi dung dịch protein (sẽ nói kỹ phần biến tính protein sau) - Các phản ứng hố học protein Cũng amino acid peptide, protein có phản ứng hố học tương tự, là: phản ứng nhóm -COOH, -NH2, gốc R phản ứng tạo màu đặc trưng liên kết peptide phản ứng biure (xem chương Ở xin giới thiệu thêm số phản ứng màu đặc trưng khác, có ý nghĩa quan trọng phát protein gốc amio acid chuỗi polypeptide + Phản ứng với thuốc thử Folin-Ciocateau Thuốc thử Folin-Ciocateau có chứa phosphomolipdic acid phosphovolframic acid chất làm tăng độ nhạy phản ứng biure, mặt khác phản ứng với gốc Tyr Trp phân tử protein Các gốc amino acid tham gia trình tạo phức chất màu xanh da trời + Các phản ứng màu đặc trưng khác protein 73 Những phản ứng có có mặt nhóm định chức hóa học xác định phân tử protein Có thể sử dụng chúng để phát amino acid, protein dung dịch • Phản ứng xanthproteic: gốc amino acid Tyr, Trp, Phe protein tác dụng với HNO3 đặc tạo thành màu vàng sau thêm kiềm chuyển thành da cam • Phản ứng Pauli: gốc Tyr, His protein tác dụng với diazobenzosulfonic acid tạo thành màu đỏ anh đào • Phản ứng Millon: gốc Tyr tác dụng với thuỷ ngân nitrate HNO3 đặc tạo thành kết tủa màu nâu đất • Phản ứng Saccaguichi: gốc Arg tác dụng với dung dịch kiềm α-naphtolvà hypobromitecho màu đỏ anh đào • Phản ứng Adamkievich: gốc Trp tác dụng với glyoxylic acid H2SO4 đặc tạo thành vòng tím đỏ mặt phân cách 3.3.2.2 Tính chất chức sinh học protein Protein hợp chất hữu có ý nghĩa quan trọng bậc thể sống, mặt số lượng, chiếm khơng 50% trọng lượng khô tế bào Từ lâu, biết protein tham gia hoạt động sống thể sinh vật, ngồi vai trị thành phần cấu trúc tế bào mơ, protein cịn có nhiều chức phong phú khác định đặc điểm sống truyền đạt thơng tin di truyền, chuyển hố chất enzyme, kháng thể chống lại bệnh tật, hormon dẫn truyền tín hiệu tế bào v.v có chất protein Trong thể protein có số vai trị sau đây: - Chức tạo hình Ngồi protein làm nhiệm vụ cấu trúc vỏ virus, màng tế bào, cịn gặp protein thường có dạng sợi như: sclerotin có lớp vỏ ngồi sâu bọ; fibroin tơ tằm, nhện; collagen, elastin mô liên kết, mơ xương Collagen đảm bảo cho độ bền tính mềm dẻo mô liên kết - Chức xúc tác Hầu hết phản ứng xẩy thể protein đặc biệt đóng vai trị xúc tác, protein gọi enzyme Mặc dù gần người ta phát loại RNA có khả xúc tác q trình chuyển hố tiền RNA thơng tin (pre-mRNA) thành RNA thơng tin (mRNA), nghĩa enzyme không thiết phải protein Nhưng định nghĩa có tính chất kinh điển: enzyme protein có khả xúc tác 74 đặc hiệu cho phản ứng hoá học, chất xúc tác sinh học có ý nghĩa đặc biệt quan trọng Hiện người ta biết khoảng 3.500 enzyme khác nhau, nhiều enzyme tinh sạch, kết tinh nghiên cứu cấu trúc - Chức bảo vệ Ngồi vai trị thành phần xúc tác, cấu trúc tế bào mơ, protein cịn có chức chống lại bệnh tật để bảo vệ thể Đó protein tham gia vào hệ thống miễn dịch, đặc biệt nhiều loại protein thực chức riêng biệt tạo nên hiệu miễn dịch đặc hiệu không đặc hiệu Các protein miễn dịch nhắc đến nhiều kháng thể, bổ thể cytokine Ngồi protein cịn tham gia vào q trình đơng máu để chống máu cho thể số lồi sản xuất độc tố có chất protein enzyme nọc rắn, lectin v.v ,có khả tiêu diệt kẻ thù để bảo vệ thể - Chức vận chuyển Trong thể có protein làm nhiệm vụ vận chuyển hemoglobin, mioglobin, hemocyanin vận chuyển O2, CO2 H+ khắp mô, quan thể Ngồi cịn có nhiều protein khác lipoprotein vận chuyển lipid, ceruloplasmin vận chuyển đồng (Cu) máu v.v Một protein làm nhiệm vụ vận chuyển nhắc đến nhiều hemoglobin - Chức vận động Nhiều protein làm nhiệm vụ vận động co rút myosin, actin sợi cơ, chuyển vị trí nhiễm sắc thể trình phân bào v.v -Chức dự trữ dinh dưỡng Các protein làm nhiệm vụ dự trử casein sữa, ovalbumin trứng, feritin lách (dữ trữ sắt) v.v Protein trữ nguồn cung cấp dinh dưỡng quan trọng cho tổ chức mơ, phơi phát triển - Chức dẫn truyền tín hiệu thần kinh Nhiều loại protein tham gia vào việc dẫn truyền tín hiệu thần kinh kích thích đặc hiệu như: sắc tố thị giác rodopsin màng lưới mắt - Chức điều hoà Các protein làm nhiệm vụ điều hồ q trình trao đổi chất thông qua tác động lên máy thông tin di truyền hormon, protein ức chế đặc hiệu enzyme có chức điều hồ nhiều q trình trao đổi chất, chẳng hạn protein repressor vi khuẩn làm ngừng q trình sinh tổng hợp enzyme từ gen tương ứng 75 - Chức cung cấp lượng Protein nguồn cung cấp lượng quan trọng cho hoạt động sống thể Trong thể protein bị phân giải thành amino acid, từ tiếp tục tạo thành hàng loạt sản phẩm, có ceto acid, aldehyde carboxylic acid Các chất bị oxy hoá tạo thành CO2 H2O đồng thời giải phóng lượng 3.3.3 Phân loại protein Protein hợp chất đa dạng thành phần cấu trúc, chức năng; khối lượng phân tử chúng khác (bảng 3.6) Do phân loại protein dựa vào mục đích khác Có hai cách phân loại thơng thường nhất: 3.3.3.1 Phân loại theo hình dạng - Protein dạng sợi Có hình dạng dài, thường hình sợi, chiều dài phân tử protein sợi lớn đường kính hàng trăm lần Protein sợi tương đối bền vững, không tan nước dung dịch muối loãng, chuỗi polypeptide protein sợi nằm dọc theo trục thành sợi dài Protein sợi yếu tố cấu trúc mô liên kết động vật cao cấp, thí dụ collagen gân mơ xương,elastin mơ liên kết đàn hồi, α-keratin tóc da v.v - Protein dạng cầu Có dạng gần hình cầu hinh bầu dục, chiều dài phân tử protein cầu lớn đuờng kính từ đến 10 lần Protein cầu không bền vững băng protein sợi, đa số tan dung dịch nước dễ khuyếch tán, thường có chức hoạt động sống tế bào enzyme, hormon, protein vận chuyển albumin huyết thanh, hemoglobin v.v - Protein dạng trung gian Một số protein dạng trung gian, vừa có đặc điểm protein sợi, vừa có đặc điểm protein cầu Thí dụ myosin (yếu tố cấu trúc chức quan cơ) có cấu trúc hình que dài đặc điểm protein sợi, lại tan dung dịch muối đặc điểm protein cầu Ngồi ra, nhóm trung gian cịn có chất tiền thân fibrin fibrinogen 3.3.3.2 Phân loại theo thành phần hoá học Protein gồm hàng trăm, hàng ngàn, chí hàng vạn amino acid nối với liên kết peptide tạo nên hay nhiều chuỗi polypeptide có cấu trúc phức tạp 76 Căn có hay vắng mặt số thành phần có chất khơng phải protein mà người ta chia protein thành hai nhóm: Bảng: 3.6 Khối lượng (MW) cấu trúc phân tử số protein Protein Khối lượng (Dalton) Số gốc amino acid Số chuỗi polypeptide Glucagon Insulin Ribonuclease (tụy bò) Lysozyme (lòng trắng trứng) Myoglobin (tim ngựa) Chymotripsin (tụy bò) Hemoglobin (người) Albumin (huyết người) Hexokinase (men bia) Tryptophan-synthetase (E.coli) γ-globulin (ngựa) Glycogen-phosphorylase (cơ thỏ) Glutamate-dehydrogenase (gan bò) Synthetase acid béo (men bia) Virus khảm thuốc 3482 5733 12.640 13.930 16.890 22.600 64.500 68.500 96.000 117.000 149.000 495.000 1.000.000 2.300.000 40.000.000 29 51 124 129 153 241 574 550 800 975 1.250 4.100 8.300 20.000 336.500 1 4 4 40 21 2.130 - Protein đơn giản Protein đơn giản protein mà phân tử chúng gồm toàn amino acid Thí dụ số enzyme tuỵ bị ribonuclease gồm toàn amino acid nối với thành chuỗi polypeptide (có 124 gốc amino acid, khối lượng phân tử 12.640), chymotrypsin gồm toàn amino acid nối với thành ba chuỗi polypeptide (có 241 gốc amino acid, khối lượng phân tử 22.600) v.v Dựa theo khả hoà tan nước dung dịch người ta chia protein đơn giản số nhóm nhỏ như: - Albumin: tan nước, bị kết tủa nồng độ muối (NH4)2SO4 cao (70-100%) - Globulin: khơng tan tan nước, tan dung dịch lỗng số muối trung tính NaCl, KCl, Na2SO4 , bị kết tủa nồng độ muối (NH4)2SO4 bán bão hồ - Prolamin: khơng tan nước dung dịch muối loãng, tan ethanol, isopropanol 70-80% 77 - Glutein: tan dung dịch kiềm acid loãng - Histon: protein có tính kiềm dễ tan nước, khơng tan dung dịch amoniac loãng - Protein phức tạp Protein phức tạp protein mà phân tử chúng amino acid protein đơn giản cịn có thêm thành phần khác có chất khơng phải protein cịn gọi nhóm thêm (nhóm ngoại) Tuỳ thuộc vào chất nhóm ngoại mà người ta chia protein phức tạp nhóm nhỏ thường gọi tên protein bắt đầu tiếp đầu ngữ chất nhóm ngoại: - Lipoprotein: nhóm ngoại lipid - Nucleoprotein: nhóm ngoại nucleic acid - Glucoprotein: nhóm ngoại carbohydrate dẫn xuất - Phosphoprotein: nhóm ngoại phosphoric acid - Chromoprotein: nhóm ngoại hợp chất có màu Tuỳ theo tính chất nhóm ngoại mà có màu sắc khác đỏ (ở hemoglobin), vàng (ở flavoprotein) 78 TÀI LIỆU THAM KHẢO Tài liệu tiếng Việt Trần Thị Ân, Đái Duy Ban, Nguyễn Hữu Chấn, Đỗ Đình Hồ, Lê Đức Trình 1980 Hố sinh học NXB Y học, Hà Nội 2.Phạm Thị Trân Châu, Trần Thị Áng 1999 Hoá sinh học NXB Giáo dục, Hà Nội Nguyễn Lân Dũng, Phạm Văn Ty, Nguyễn Đình Quyến 1999 Vi sinh vật học NXB Giáo dục,Hà Nội Lê Đức Trình 1998 Hormon NXB Y học Hà nội Tài liệu tiếng Anh Dennison C 2002 A Guide To Protein Isolation Kluwer Academic Publishers New York, Boston, Dordrecht, Lodon, Moscow Fersht A., 1998, Structure and Mechanism in Protein Science, W H Freeman, 3rd Rev Edit Lehninger A L 2004 Principle of Biochemistry, 4th Edition W.H Freeman, 2004 Liebler D C 2002 Introduction to proteomics Humana Press Inc Totuwa, New Jersey Lodish H, 2003 Molecular Cell Biology 5th ed, W.H Freeman, 2003 Walker J M 1996 The Protein Protocols Hand book 2nd ed Humana Press Inc Totuwa, New Jersey ... NH +3) pKR(của R) 2 ,34 2 ,34 1,99 2 ,32 2 ,36 2 ,36 2,28 1, 83 2,20 2 ,38 2,21 2,11 1,96 2,02 2,17 2,18 1, 83 2,17 1,88 2,19 9,60 9,60 10,96 9,62 9,60 9,68 9,21 9, 13 9,11 9 ,39 9,15 9,62 10,28 8,80 9, 13. .. thuốc 34 82 5 733 12.640 13. 930 16.890 22.600 64.500 68.500 96.000 117.000 149.000 495.000 1.000.000 2 .30 0.000 40.000.000 29 51 124 129 1 53 241 574 550 800 975 1.250 4.100 8 .30 0 20.000 33 6.500... huyết áp 3. 3 Protein 3. 3.1 Cấu trúc phân tử bậc 1, 2, 3, Về mặt cấu trúc người ta phân biệt protein gồm bốn bậc: bậc I, bậc II, bậc III bậc IV (Hinh 3. 17) 65 Bậc I Bậc II Bậc III Bậc IV Hình 3. 17