Chuong 5 enzyme

Chương Các enzyme sử dụng kỹ thuật di truyền Khái niệm enzyme • Enzyme protein có khả tham gia xúc tác phản ứng hóa học ngồi thể “Enzyme chất xúc tác sinh học” Cấu trúc Enzyme • Enzyme đơn giản-enzyme thành phần nghĩa thủy phân cho thành phần amino acid Hoạt tính enzyme phụ thuộc vào cấu trúc protein • Enzyme phức tạp: Ngồi thành phần protein gọi apoezyme, enzyme cịn chứa thêm nhóm khơng phải protein gọi cofactors Nhóm ngoại đa dạng Có thể phân biệt ba nhóm ngoại bản: (1) Nếu nhóm ngoại phân tử hữu có trọng lượng phân tử thấp gọi coenzyme, thường bắt nguồn từ vitamin không từ amino acid Coenzyme liên kết thuận nghịch với enzyme, tham gia trực tiếp phản ứng mà enzyme xúc tác Ví dụ: NAD FAD hai coenzyme chất mang điện tử H cho nhiều phản ứng oxi hóa khử có enzyme xúc tác tế bào Cấu trúc Enzyme (2) Nhóm phụ gia (prosthetic group) tương tự coezyme gắn chặt với protein enzyme liên kết hóa trị chẳng hạn enzyme catalase Giống coenzyme nhóm prosthetic thường thành phần chế xúc tác enzyme (3) Nhóm ngoại ion kim loại Fe, Mn, Cu, Ca, Zn, Mg Các ion có vai trị ổn định cấu trúc enzyme chất tham gia trực tiếp phản ứng chẳng hạn cytochrome chứa Fe tham gia vào chuỗi chuyền điện tử • Một số enzyme đòi hỏi hai thành phần để có hoạt tính xúc tác Nhóm ngoại thường ổn định nhiệt protein enzyme bị biến tính bị đun nóng Phức hệ enzyme-cofactor có hoạt tính xúc tác gọi holoenzyme Khi cofactor bị loại bỏ phần protein (apoenzyme) cịn lại hoạt tính xúc tác • Trên bề mặt enzyme có khe, túi- chỗ lõm gọi vị trí hoạt động (active site) nơi xảy hoạt động xúc tác enzyme Các enzyme chủ yếu sử dụng cơng nghệ gen • • • • • Các enzym dùng để ghép nối ADN: ADN ligase Các enzym dùng để nhân ADN: Các polymerase Enzym tổng hợp ADN từ ARN: reverse transcriptase Các enzym sửa đổi ADN Các enzym dùng để cắt ADN: Các nuclease, enzym giới hạn Các ligase • Các ADN ligase có vai trị xúc tác tạo thành liên kết phosphodieste hai chuỗi ADN T4 DNA Ligase T4 DNA Ligase: Enzym tách chiết từ tế bào E coli bị nhiễm thực khuẩn thể (phage T4) Có khả sửa chữa khoảng trống nicks chuỗi ADN (Hình thành liên kết phosphodiester nhóm OH 3' nhóm phosphat 5' khung hai vùng bị bẻ gẫy) ADN ligase T4 gắn đoạn ADN có đầu so le đầu Quá trình nối đầu cắt RE Hai sợi ADN bắt cặp nhờ liên kết hydro cặp bazơ Các khoảng trống (Nicks) chuỗi cần gắn lại ligase Cơ chế hoạt động T4 DNA Ligase Các polymerase ADN polymerase I (pol I): • Xúc tác tổng hợp mạch đơn ADN mới, xúc tác cho gắn nucleotit vào khoảng trống mạch polynucleotit sợi ADN Ngồi hoạt tính tổng hợp, enzym cịn có chức nuclease (3'->5' proof-reading exonuclease), có khả phân giải liên kết nucleotit đầu mạch theo chiều 5’ đến 3’ 3’ đến 5’ • Klenow fragment (cải tiến từ DNA pol I (loại bỏ 323 a.a): Mất hoạt tính nuclease nhiên trì hoạt tính polymerase DNA pol I Được sử dụng để đánh dấu mẫu dò Một số enzym giới hạn Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết EcoRI Escherichia coli GA-A-T-T - C C - T-T-A-AG EcoRV Escherichia coli G-A-TA-T-C C-T-AT-A-G TagI Thermus aquaticus TC-G-A A-G-CT HbaI Haemophilus baemoliticus GC-G-C C-G-CG DdeI Desulfovibrio desulfuricans CT-N-A-G G-A-N-TC MboII Moraxella bovis GA-A-G-A-(N)8  C-T-T- C-T-(N)7  Pst I Providencia stuarti C -T -G-C-AG GA-C- G-T- C Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết MstII Microcoleus stuarti c-c  t-n-a-g-g g-g-a-n-t c-c NotI Nocardia otitidiscaviarum G-C  G-G-C-C-G-C C-G-C-C-G  G-C-G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens GG-A-T-C - C C - C-T-A-GG Hae III Haemophilus aegyptius G-GC-C C-CG-G HhaI Haemophilus haemolyticus G-G-CC CC -G-G Một số RE đặc biệt • Heteroschizomers (isochizomers) RE nhận biết trình tự DNA có nguồn gốc từ tổ chức khác SphI BbuI SphI từ Streptomyces phaeochromogenes BbuI từ Bacillus sp Bu 17091 Neoschizomers • Các RE nhận biết trình tự lại cắt vị trí khác gọi neoschizomers Một số RE đặc biệt isocaudomers: Các RE nhận biết trình tự DNA khác cắt DNA tạo trình tự đầu dính giống Tần xuất cắt RE • Nếu giả thiết trình tự xếp loại base ngẫu nhiên xác suất để đoạn trình tự nhận biết 1/4n (n chiều dài (bp) chuỗi nhận biết) Số nucleotit cần thiết cho RE nhận biết (n) xác suất xảy kiện phân cắt RE 1/ 44= 1/256 1/ 45= 1/1024 1/ 46= 1/4069 1/ 48= 1/65.536 n 1/4n Tần suất cắt RE 1) Trình tự biết: scan vị trí nhận biết computer (eg at www.rebase.neb.com) 2) Ảnh hưởng thân trình tự nhận biết: 3) Trình tự chưa biết: Ứng dụng RE • Tạo DNA tái tổ hợp • Lập đồ giới hạn Tạo phân tử DNA tái tổ hợp BẢN ĐỒ GIỚI HẠN • Là đồ thể loại enzym giới hạn, số lượng kích thước đoạn DNA bị cắt enzym giới hạn • Một phân tử sử dụng loại enzym khác cho nhiều đoạn cắt khác hình thành nên đồ giới hạn khác • Được sử dụng xác định nguồn gốc khác cá thể loài PHƯƠNG PHÁP LẬP BẢN ĐỒ GIỚI HẠN • Tách chiết DNA mẫu nghiên cứu thực PCR tạo lượng DNA cần thiết • Lựa chọn enzym giới hạn thích hợp, xử lý enzym giới hạn mẫu điều kiện thích hợp • Điện di kết gel agarose với thang DNA chuẩn, tính tốn kết lập đồ Sử dụng enzym để cắt đoạn ADN nghiên cứu (kích thước 17kb) Kết cho đoạn ADN (6kb, 3kb, 8kb) Điều chứng tỏ enzym có vị trí cắt đoạn ADN chưa rõ đoạn 3kb nằm hay cuối sợi Khi cắt sợi ADN nghiên cứu enzym 2, kết cho đoạn cắt (7kb, 10kb) chứng tỏ enzym có điểm cắt sợi 17kb Khi cắt tổ hợp hai enzym cho thấy có xuất lại đoạn 6kb 8kb, hai đoạn sản phẩm hoạt động enzym Như đoạn 3kb bị cắt enzym (vì kết cắt phối hợp cho đoạn (6kb, 8kb, 2kb, kb) Từ suy đoạn 3kb phải nằm sợi Bài tập Nhân dịng đoạn ADN có chiều dài 900 bp sau phân cắt với enzyme, chạy điện di cho kết sau đây: Ezyme Đé lớn đoạn phân cắt (bp) EcoRI Hind III BamHI EcoRI + Hind III EcoRI + BamHI HindIII + BamHI 200, 700 300, 600 50, 350, 500 100, 200, 600 50, 150, 200, 500 50, 100, 250, 500 Hãy vẽ đồ giới hạn từ số liệu trên? A.Nếu cắt plasmid với SalI, đoạn DNA tạp ra? Kích thước chúng? B.A Nếu cắt plasmid với EcoRI, đoạn DNA tạp ra? Kích thước chúng? C.A Nếu cắt plasmid với EcoRI + Hind III + SalI, đoạn DNA tạp ra? Kích thước chúng? Vẽ kiểu băng DNA sau cắt plasmid slide trước với RE khác (xem box) Tham khảo • www.neb.com www.stratagene.com www.promega.com www.invitrogen.com www.roche.com ... otitidiscaviarum G-C  G-G-C-C-G-C C-G-C-C-G  G-C-G Bam HI Bacillus amyloliquefaciens GG-A-T-C - C C - C-T-A-GG Hae III Haemophilus aegyptius G-GC-C C-CG-G HhaI Haemophilus haemolyticus G-G-CC CC -G-G... G-A-TA-T-C C-T-AT-A-G TagI Thermus aquaticus TC-G-A A-G-CT HbaI Haemophilus baemoliticus GC-G-C C-G-CG DdeI Desulfovibrio desulfuricans CT-N-A-G G-A-N-TC MboII Moraxella bovis GA-A-G-A-(N)8... bovis GA-A-G-A-(N)8  C-T-T- C-T-(N)7  Pst I Providencia stuarti C -T -G-C-AG GA-C- G-T- C Enzym Vi khuẩn có enzym Vùng nhận biết MstII Microcoleus stuarti c-c  t-n-a-g-g g-g-a-n-t c-c NotI Nocardia