Công nghệ sản xuất cellulase tái tổ hợp

Công nghệ sản xuất Endo- (1,4) -β-Dglucanase tái tổ hợp từ E.coli GVHD: TS.Lê Quang Hịa HVTH: Nguyễn Văn Khơi MSHV: 20211166M Tổng quan Cellulase có nhiều ứng dụng khác công nghiệp Chúng sản xuất tự nhiên loài vi khuẩn nấm khác Quá trình lên men sản xuất cellulase có hạn chế chi phí chất cần thiết để cảm ứng cellulase cao thách thức để trì điều kiện thích hợp cho việc sản xuất cellulase Sản xuất cellulase tái tổ hợp giải pháp tiềm cho vấn đề Tổng quan Cellulase sản xuất cách sử dụng nấm, vi khuẩn xạ khuẩn. Chi phí cao Cellulase chủ yếu mơi trường chất cảm ứng sử dụng sản xuất tốc độ phát triển chậm nấm [Bhat MK, 2000]. Có số báo cáo việc sản xuất cellulase từ vi khuẩn như  Bacillus [Rawat R, Tewari L, 2012 ], Clostridium và Ruminococcus [Bayer EA et al, 2006] và Streptomyces spp., [Nascimento RP et al, 2009]. Cellulase vi sinh vật bao gồm ba loại hoạt động enzym (1) Endo- (1,4) -β-D-glucanase, (2) Exo- (1,4) -β-D-glucanase (3) β- glucosidase. Các enzym dạng tiểu đơn vị đơn lẻ đặc biệt vi sinh vật hiếu khí, nhóm lại phức hợp enzym đa thành phần gọi 'cellulosomes' vi khuẩn phân giải cellulose kỵ khí Bacillus subtilis IARI SP1 (Endo- (1,4) -β-D-glucanase) Bacillus Bacillus subtilis Phân lập từ hệ thống nước thải nhà máy sản xuất giấy Tổng quan Escherichia coli, đóng vai trị nhà máy sản xuất lưu trữ, không yêu cầu môi trường cụ thể phát triển nhanh mạnh mẽ.  An tồn Ưu điểm cellulase tái tổ hợp tăng quy mô cấp độ công nghiệp mà không cần sử dụng môi trường đắt tiền BL21 (DE3) chủng vi khuẩn E coli B không chứa lon protease. Nó bị thiếu hụt OmpT protease màng ngoài. Việc thiếu hai protease quan trọng làm giảm thối hóa protein dị hợp thể tế bào • • • Hiệu suất biến nạp cao:> 1x10   cfu / µg pUC19 DNA Được ứng dụng đặc biệt để biểu mức độ cao protein tái tổ hợp Các chọn lọc di truyền giúp giảm thiểu phân hủy RNA protein Vật liệu phương pháp     Bacillus subtilis IARI SP1 (2.5 IU/ml) Endo- (1,4) -β-D-glucanase Vector pET28a, pGEM-T mang gen mục tiêu (Promega) Chủng E coli BL21 (DE3) E coli DH5α mua từ Novagen (Mỹ) Chất axit niken-nitrilotriacetic (Ni-NTA) cho sắc ký lực mua từ Qiagen (Đức).a kiểm tra hoạt tính Nhân đoạn gen Tạo plasmid Biến nạp vào E coli DH5α Thu hồi, tinh Đánh giá hoạt tính sản Tạo plasmid chuyển gen phẩm Nuôi cấy LB Biến nạp vào E coli BL21 Nuôi thu plasmid Các bước tiến hành Đánh giá biểu gen mã hóa (Endo- (1,4) -β-glucanase) Bacillus subtilis Cặp mồi thối hóa endo-F (5′-ATGAARMGIWSIATH-3 ′) endo-R (5′-RTTIGGYTCIGTNCCC-3 ′) Giải trình tự gen Hoạt động cellulase đảm bảo trước nhân biểu tái tổ hợp hệ thống vi khuẩn Các bước tiến hành Thiết kế mồi xác định enzyme cắt giới hạn cho phản ứng PCR tạo plasmid BamHI His tag 5′ ATTCGGATCCCATCATCATCATCATCATATGAAACGGTCAATCTC 3′ 5′ CGAAGCTTTAATTTGGTTCTGTTCCC3′ HindIII Primers were synthesised by Sigma (USA) Các bước tiến hành Tiến hành PCR kiểm tra gen mục tiêu đoạn mồi thiết kế checked on 1% agarose gel Cắt enzyme giới hạn BamHI HindIII PCR 25 μL 94 °C for 7 min followed by 5 cycles of denaturation at 94 °C for 45 s, annealing at 47 °C for 45 s, elongation at 72 °C for 90 s Later, 30  cycles were denaturation at 94 °C for 45 s, annealing at 61 °C for 45 s and elongation at 72 °C for 90 s Lane 1: Marker chuẩn Lane 2: gen mục tiêu Lane 3: Mẫu đối chứng Các bước tiến hành E coli DH5α Ni đĩa thạch LB có sử dụng kháng sinh chọn lọc ủ đá 15-30 phút Sau pGEM-T mang gen mục tiêu tạo sốc nhiệt ngắn (42°C khoảng 30-45 giây) Cấy khuẩn lạc vào 5ml LB có sử dụng kháng sinh chọn lọc Được đặt hàng Promega Nuôi qua đêm 37độ lắc 150 rpm Tinh thu đoạn DNA đích Thu plasmid mang đoạn gen mục tiêu BamHI HindIII 37 độ C 12h Các bước tiến hành Cắt giới hạn plasmid Sử dụng enzyme cắt giới hạn BamHI HindIII ( điều kiện 37 độ C) 1-2h Tinh plasmid cắt mở vòng Các bước tiến hành Tách plasmid mang gen chuyển tái tổ hợp vào E coli BL21 (DE3) tiến hành ni cấy DNA đích sau tinh t4 ligase Biến nạp sốc nhiệt E coli BL21 (DE3) Plasmid tinh sau cắt mở vịng Ni LB có bổ sung kháng sinh chọn lọc Các bước tiến hành Chọn dòng tái tổ hợp chứa plasmid có gen mục tiêu khuẩn lạc colony PCR 94 ° C, phút; tiếp theo 30 chu kỳ [98 ° C, giây; 55 ° C, giây; và 72 ° C, 40 giây]. Sau PCR hồn tất, µl phản ứng điện di 1% agarose gel Các bước tiến hành E coli BL21 (DE3) sau biến nạp chọn dịng tiến hành ni cấy cảm ứng IPTG LB + Kanamycin 30 μg / ml OD đạt 0.4 đo 600nm Lắc 150 rpm IPTG mM 3h Các bước tiến hành Tinh Cellulase Thu dịch Ly tâm Bảo quản ° C 10.000 rpm 15p ° C Buffer + 20 mM imidazole Thu sinh khối phá tế bào Buffer + 250 mM and 500 mM  5 ml(300 mM NaCl, 10 mM Tris HCl pH 8) Ly tâm Các bước tiến hành Kiểm tra khả cảm ứng Phân tích SDS-PAGE β-1, 4-endoglucanase từ dòng tái tổ hợp E coli BL21 (DE3) Các dịng khơng cảm ứng 1, 3, 5, 7, Các dòng cảm ứng 2, 4, 6, M marker Các bước tiến hành Sự biểu gen β-1, 4-endoglucanase ở E coli BL21 (DE3) Các cellulose đạt tối đa sau h cảm ứng (10 IU / mL) mà cao lần so với chủng dã IARI-SP1 Hoạt độ enzyme kiểm tra cặn tế bào, dịch cặn tế bào dịch riêng biệt Hoạt tính cao xác định cặn tế bào + phần (10 IU / ml), phần phía (8,2 IU / ml) cặn (2,8 IU / ml) Marker Phần xác tế bào Dịch Dịch + xác tế bào Mũi tên hiển thị dải cellulase Các bước tiến hành Kiểm tra khả tinh cột sắc ký Dải hiển thị protein cellulase tái tổ hợp Tinh (Sắc ký lực) SDSPAGE Marker Phần ezyme thơ Dịng chảy qua bề mặt Rửa phân đoạn Phân đoạn rửa giải (250 mM imidazole) Mũi tên hiển thị dải cellulase Các bước tiến hành Kiểm tra hoạt tính cellulase Enzyme thô Enzyme tinh  0,05 ml  0,05 ml Nước cất  0,05 ml Giữ nồi cách thủy sôi phút ủ 55 ° C 30 phút 0,5 ml thuốc thử DNS 0,45 ml CMC 1% dung dịch đệm natri citrat 0,1 M (pH 5) Mẫu trắng Enzyme thô Enzyme tinh A Ảnh hưởng pH Các bước tiến hành B Ảnh hưởng nhiệt độ C Tính ổn định nhiệt của enzym Đánh giá đặc điểm sản phẩm Tính ổn định nhiệt của enzyme đánh giá cách ủ enzyme thô trong  dung dịch đệm Tris – HCl 10 mM (pH 8) 1  giờ nhiệt độ khác từ 40 đến 100  ° C với gia số 10  ° C Độ pH nhiệt độ tối ưu enzym β-1, 4-endoglucanase biểu giống hệt với chủng hoang dã pH 50–60 ° C Khi ủ enzyme 1  giờ 100  ° C, hoạt tính bị hồn tồn Các yếu tố tác động khác enzyme đánh giá theo bước phương pháp của  Ghose (1987)  % Các bước tiến hành So sánh khả tạo vòng phân giải  Cấy tế bào tái tổ hợp trên thạch Luria – Bertani (LB) có chứa 1,5% carboxymethyl cellulose (CMC)  , 30  μg / ml kanamycin 1  mM IPTG, có bổ sung đỏ Congo để đánh gaias khả sinh cellulase A) B) Tế bào biến nạp BL21 Dòng dại Bacillus subtilis IARI-SP-1 Các bước tiến hành Bảo quản sản phẩm Sản phẩm sấy đơng cô thành dạng bột Hoặc sử dụng phương pháp lọc để cô đặc Bảo quản 0-4 độ Tùy mục đích sử dụng đóng gói chế phẩm enzyme dạng thô, tinh sạch, phụ thuộc vào yêu cầu khách hàng hiệu kinh tế đặt Kết luận quy trình cơng nghệ Sơ đồ cơng nghệ tổng quát Việc thu Cellulase cộng thêm từ xác bào không kinh tế so với công bỏ để thu hồi ! => Loại phần xác tế bào Chủng dại Tạo dòng TTH Enzyme tinh Nhân giống Lên men Ly tâm Tinh Thu dịch Xử lý đóng gói Enzyme thơ Xử lý Đóng gói Cảm ơn thầy anh chị lắng nghe ... điều kiện thích hợp cho việc sản xuất cellulase Sản xuất cellulase tái tổ hợp giải pháp tiềm cho vấn đề Tổng quan Cellulase sản xuất cách sử dụng nấm, vi khuẩn xạ khuẩn. Chi phí cao Cellulase chủ...Tổng quan Cellulase có nhiều ứng dụng khác công nghiệp Chúng sản xuất tự nhiên lồi vi khuẩn nấm khác Q trình lên men sản xuất cellulase có hạn chế chi phí chất cần thiết để cảm ứng cellulase. .. thải nhà máy sản xuất giấy Tổng quan Escherichia coli, đóng vai trị nhà máy sản xuất lưu trữ, không yêu cầu môi trường cụ thể phát triển nhanh mạnh mẽ.  An tồn Ưu điểm cellulase tái tổ hợp tăng quy