Tài liệu Kỹ thuật điện di ADN - DNA electrophoresis pptx

Kỹ thuật điện di ADN DNA electrophoresis Khái niệm DNA electrophoresis là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử DNA nhờ một chất nền cố định (gel) trong một điện trường.  ADN tich điện âm vì gốc phosphat hình thành khung đường-phosphate của phân tử AND tích điện âm.  Trong điện trường di chuyển về cực dương Điện di ADN Điện di ADN  Bản gel hoạt động như một giá thể để phân tách các đoạn ADN.  ADN th­êng ®­îc ®iÖn di trªn hai lo¹i gel: agarose vµ acrylamid  Các lỗ được tạo ra trong bản gel. Chúng được xem như là các giêngs để chứa dung dịch AND Agarose và Polyacrylamide Agarose: có khả năng phân tách các phân tử AND có kích thước lớn khác nhau từ hàng chục thậm chí hàng trăm Kilobase. Không độc Polyacrylamide: Có độ phân giả cao hơn song chỉ phân tách được các đoạn AND có kích thước sai khác ít. Rất độc Điện di ADN  Dung dịch AND chứa hỗn hợp các đoạn AND có kích thước khác nhau được đổ vào các giêngs trong bản gel. Điện di ADN  Chất nền gel hoạt động như một tấm sàng (sieve). Các phân tử AND lớn đi qua các lỗ trong bản gel khó khăn hơn các phân tử AND nhỏ.  Vì vậy, các đoạn phân tử lớn hơn sẽ bị chậm lại so với các phân tử nhỏ khi AND di chuyển trong bản gel. Điện di ADN  Quá trình phân tách cứ tiếp tục tạo ra sự phân tách giữa các đoạn AND càng rõ hơn. Điện di ADN  Thang phân tử chuẩn thương được đienj di cùng với AND.  Thang chuẩn thường là hỗn hợp các đoạn AND đã biết trước kich thước.  Được dùng để ước lượng kích thước của các đoạn AND trong mẫu nghiên cứu. Fig 20-1: DNA separation by gel electrophoresis http://a32.lehman.cuny.edu/molbio_course/agarose.htm [...]... qua iờn di AND trờn gel co nụng ụ khac nhau Faster migration in a less concentrated gel Tng quan gia N agarose v ln ca ADN Stt % agarose Kích thước mnh ADN (kb) 1 2 3 4 5 6 7 0,3 5 - 60 0,6 1 - 20 0,7 0,8 - 10 0,9 0,5 - 7 1,2 0,4 - 6 1,5 0,2 - 4 2,0 0,1 - 3 Các đoạn DNA c ct bng RE có thể tách khỏi nhau tương ứng với kích thước của chúng khi chạy điện di trên gel agarose Sau khi điện di các... được nhuộm ethidium bromide và có thể quan sát trực tiếp các đoạn cắt dưới ánh sáng tử ngoại hoặc chụp nh .vntime K thut lai phõn t C s khoa hc S bt cp lai (Hybridization) theo c ch b sung (Complementarity) Cỏc dng phc hp lai b sung 1) DNA- DNA 2) DNA- RNA 3) Protein-Protein (thng dng phc hp khỏng nguyờn-khỏng th ) Lai DNA- DNA hoc DNA- RNA Lai phõn t l quỏ trỡnh kt hp li ca hai mch n DNA C s ca vic... mui trong dung dch m Phn ng lai cú th khụng c hiu Mt s trng hp xy ra khi lai ADN 42 C is more stringent condition that 35 C (hybridization is more specific) http://amiga1.med.miami.edu/Medical/PDF-Files/Lecture10.pdf Lai Southern Là kỹ thuật dùng để nhận dạng một đoạn DNA đặc thù dựa trên trỡnh tự thể hiện của nó sau khi điện di trên gel agarose Phương pháp này được phát triển bởi Edwin Southern (1975)... đoạn ADN của cùng gen sẽ bắt cặp (lai) theo cơ chế bổ sung (complementation) và nhận biết qua phóng xạ tự ghi Các bước tin hnh 1 Chuẩn bị mẫu: Chiết tách ADN nghiên cứu, cắt ADN nghiên cứu bằng enzym giới hạn, kết qu cho một hỗn hợp các đoạn cắt có kích thước khác nhau Tiến hành điện di hỗn hợp sn phẩm cắt trên gel để tách các đoạn DNA Làm biến tính (tạo thành các sợi đơn) các bng ADN trên gel điện. .. ca on ADN (gen) S lng on ADN cú mt (tng ng vi s gen) ln ca on ADN Trỡnh t tng t gi on ADN mc tiờu v mu dũ Edwin Southern University of Oxford Nguyờn tc Southern Blot dựa trên kh nng gi lại các đoạn ADN đã qua xử lý enzyme giới hạn, trên một màng mỏng đặc biệt (Hybond - N) Màng mỏng này sau đó được ngâm trong dung dịch chứa mu dũ đã cho ở dạng có đánh dấu 32P Nếu có mặt gen đã cho trong ADN trên... thuõt iờn di Hiện hinh các bng ADN trên bn gel điện di Phương pháp nhuộm Ethydium bromid, thuốc thử này tạo các liên kết nhuộm với các bazơ nitơ Khi chiếu ánh sáng tử ngoại (cực tím) vào bn gel các liên kết nhuộm sẽ hấp phụ các bước sóng 300 360nm và phát huỳnh quang ở bước sóng 590 nm (màu da cam), kết qu có thể ghi nhận bằng mắt thường và chụp nh được Phương pháp nhuộm bạc Bn gel sau điện di được... đơn) các bng ADN trên gel điện di bằng cách xử lý gel vi nhit cao hoc điện di 20 phút trong dung dịch NaOH 0,5M hoặc NaCl1,5 M Các bước tin hnh (tip) 2 Thấm truyền (blotting): ặt gel lên hệ thống giá chuyển (máy Blotting) để chuyển nguyên vẹn các ADN đã biến tính trên gel lên màng lai (màng nitrocellulose, màng nylon (gi chặt các đoạn ADN được chuyển lên từ gel điện di) Phía trên để một lớp giấy thấm... kt DNA cú th bin tớnh hoc tỏi hi khi un núng hoc lm lnh tin hnh phn ng lai phõn t trc ht DNA mch kộp phi c bin tớnh ú l mt quỏ trỡnh trong ú cỏc liờn kt hydro ca mch DNA kộp ban u b phỏ v gii phúng hai mch n vi ton b cỏc base sn sng tip nhn cỏc liờn kt hydro mi Tớnh c hiu ca phn ng lai 1) lai c hiu: probe gn vi DNA mc tiờu ch khi cú trỡnh t b sung 2) Lai khụng c hiu: phn ng lai xy ra khi DNA mc... gel sau điện di được ngâm vào dung dịch AgNO3, ADN sẽ tương tác với AgNO3, khi bổ sung formaldehyt ở pH kiềm, ion bạc chuyển thành bạc nguyên tử tạo các hạt bạc kết tụ có màu xám, có thể phát hiện dễ dàng Kờt qua iờn di AND trờn gel This photograph is of various types of DNA that have been electrophoresed on the same gel Note that high molecular weight DNAs do not separate well on this gel This can... cú trỡnh t tng t (khụng b sung hon ton) S tng hp gia mu dũ v DNA trờn thc t khụng nht thit phi hon ton chớnh xỏc Cỏc trỡnh t mu dũ nhng sai khỏc nht nh vn cú th bỏm vo DNA cho dự s tng hp khụng cao L d nhiờn, tng hp cng thp thỡ cng cú ớt mi liờn kt hydro gia mu dũ v DNA mch n Ngi ta cú th tớnh toỏn c kh nng cỏc mu dũ cú tng hp thp bỏm vo DNA bng cỏch thay i nhit ca phn ng lai hay thay i lng mui . Kỹ thuật điện di ADN DNA electrophoresis Khái niệm DNA electrophoresis là quá trình phân tách một hỗn hợp các phân tử DNA nhờ một chất. chuyển về cực dương Điện di ADN Điện di ADN  Bản gel hoạt động như một giá thể để phân tách các đoạn ADN.  ADN th­êng ®­îc ®iÖn di trªn hai lo¹i gel: