Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐỖ VIẾT PHƯƠNG NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM 2020 TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠ KHOA NÔNG NGHIỆP ĐỖ VIẾT PHƯƠNG MSNCS: P1114004 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM Mã ngành: 62.54.01.01 CÁN BỘ HƯỚNG DẪN PGS TS LÊ NGUYỄN ĐOAN DUY TS PHẠM VĂN TẤN 2020 LỜI CẢM ƠN Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực của chính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thân cùng bạn bè Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy, người hướng dẫn chính và TS Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ Hai thầy đã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt có những ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ của tôi Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hết mình Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Hồ Quảng Đồ, PGS TS Nguyễn Văn Mười, PGS TS Lý Nguyễn Bình, PGS TS Nguyễn Công Hà, PGS TS Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợi cho tôi trong suốt tiến trình học tập Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, Khoa Sau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thực phẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiện thuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Công nghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ Chí Minh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất Nhà trường và Viện đã hỗ trợ kinh phí, điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứu tại trường Đại học Cần Thơ Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảm và sự quan tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xin cảm ơn các bạn rất nhiều Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luôn luôn ủng hộ, sát cánh bên tôi Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng NCS Đỗ Viết Phương 3 TÓM TẮT Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) Đồng thời, nghiên cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lập được từ quả cà phê Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trình thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thương mại Bên cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập các thông số cho quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenol trong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích ly thông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêu âm Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiền xử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đến mức độ suy giảm hemicellulose và lignin Trong nội dung thứ hai, tiến hành phân lập nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn: đất trồng, quả cà phê, thân cành lá Sau đó là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khác nhau bao gồm: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone Enzyme thu nhận được cùng với enzyme thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả kinh tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3 Bên cạnh đó, để đảm bảo cho quá trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phải được kiểm tra và loại bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men Nội dung cuối cùng là khảo sát một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên men cũng như là khảo sát một số phương pháp lên men khác nhau Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằng phương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và 87,7% (đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại Tuy nhiên, vì lý do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thường bằng nước nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol Khi so sánh các phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phương pháp kết hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4% hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điều kiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở 120oC trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng 20 phút Trong số 5 dòng nấm mốc phân lập được thì chủng Trichoderma asperellum QT5 (phân lập từ quả) có khả năng sinh tổng hợp cellulase hoạt tính cao nhất và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường lỏng cơ bản Sau đó enzyme cellulase thô được tinh sạch sơ bộ bằng ethanol (tỷ lệ enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL) Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủy phân và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằng enzyme thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạo thành chỉ thấp hơn 13,8% Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phương pháp lên men SHF cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếu không xem xét đến mặt thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSF cho hiệu quả thủy phân cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian như nhau Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum, thu nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê ABSTRACT The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment method for coffee pulp (Coffea robusta) In addition, the study also focused on recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries After that, this enzyme was used in hydrolysis of the coffee pulp Hydrolysis efficiency of the enzyme was compared with that of commercial enzymes Besides, the condition of hydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation process were also studied The first research content was to eliminate caffeine and polyphenols from coffee pulp using three different extraction methods including maceration, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction Then, experiments were to investigate the effects of pretreatment agents such as acid, alkali, microwave and microbiological or a combination of the agents on removing of hemicellulose and lignin In the second research, the isolation of mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected from various sources such as soil, branches, trunks, coffee pods The third research was the recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated using various precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone The cellulase enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze the coffee pulp Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis were compared between the two enzymes Besides, to ensure that the fermentation was perfect, the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances that were toxic to yeast The final content was to study some main factors affecting the fermentation process as well as to investigate some different fermentation methods The result showed that the eliminating efficiency of caffeine and polyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3% and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively These were higher than those of the other methods However, due to economic aspects and feasibility, the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process When comparing different pretreatment methods, it revealed that the pretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave was the most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulose was retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removed under treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes, alkali pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, and microwave at 327 W for 20 minutes Among five strains of molds isolated, Trichoderma asperellum QT5 had the highest activity of cellulase biosynthesis and reached to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was 1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL) In addition, when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentation processes, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzate using the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercial Viscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower Furthermore, result of the study also showed that the SHF fermentation method was more effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring the fermentation time By contrast the SSF fermentation method was more effective hydrolysis than the others in the same fermentation time Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp, enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum LỜI CAM ĐOAN Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quả nghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bất cứ luận án cùng cấp nào khác Cần Thơ, ngày Người hướng dẫn Lê Nguyễn Đoan Duy tháng Người thực hiện Đỗ Viết Phương năm 2 Kết quả phân tích caffeine, ethanol, glucose bằng HPLC PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM Hình PL D.1: P chrysosporium nuôi cấy 7 ngày Hình PL D.2: Nhân giống chủng P chrysosporium Hình PL D.3: Quả cà phê mốc Hình PL D.4: Đất trồng cà phê Hình PL D.5: Thân cành cà phê Hình PL D.6: Vi sinh vật phát triển trên đất, cành lá và quả cà phê Hình PL D.7: A niger và T asperellum phân lập được từ cà phê Hình PL D.8: T longibrachiatum và P Chrysosporium phân lập được từ cà phê Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý Hình PL D.13: Tiền xử lý bằng chủng P chrysosporium sau 10, 15 và 20 ngày Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thô Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn Hình PL D.16: Nhân giống nấm men Hình PL D.17: Dịch thủy phân Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân ... ĐỖ VI? ??T PHƯƠNG MSNCS: P1114004 NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆ VI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI (Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨ NGÀNH CÔNG NGHỆ... ? ?Nghiên cứu trình tiền xử lý hệ vi sinh vật phân giải vỏ cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol” 1.2 Mục tiêu nghiên cứu 1.2.1 Mục tiêu tổng quát Sử dụng tác nhân acid, kiềm, vi sóng... ảnh hưởng đến trình lên men phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol 1.3 Đối tượng phạm vi nghiên cứu 1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: Vỏ cà phê vối (Coffea robusta): Quả cà phê vối tươi thu