Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.Nghiên cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) để lên men tạo ethanol.

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆVI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨNGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

2020

TRƯỜNG ĐẠI HỌC CẦN THƠKHOA NÔNG NGHIỆP

ĐỖ VIẾT PHƯƠNG

MSNCS: P1114004

NGHIÊN CỨU QUÁ TRÌNH TIỀN XỬ LÝ VÀ HỆVI SINH VẬT PHÂN GIẢI VỎ QUẢ CÀ PHÊ VỐI

(Coffea robusta) ĐỂ LÊN MEN TẠO ETHANOL

LUẬN ÁN TỐT NGHIỆP TIẾN SĨNGÀNH CÔNG NGHỆ THỰC PHẨM

Mã ngành: 62.54.01.01

CÁN BỘ HƯỚNG DẪN

PGS TS LÊ NGUYỄN ĐOAN DUYTS PHẠM VĂN TẤN

LỜI CẢM ƠN

Để có được kết quả như ngày hôm nay, ngoài sự phấn đấu và nổ lực củachính bản thân còn có sự hỗ trợ rất lớn từ quý Thầy, Cô, gia đình, người thâncùng bạn bè Xin được ghi nhớ và gửi lời cảm ơn chân thành đến tất cả quý vị.

Xin được gửi lời cảm ơn sâu sắc đến PGS TS Lê Nguyễn Đoan Duy,người hướng dẫn chính và TS Phạm Văn Tấn, người hướng dẫn phụ Hai thầyđã truyền cho tôi rất nhiều kiến thức, thật nhiều kinh nghiệm và đặc biệt cónhững ý kiến đóng góp, trao đổi thật sự bổ ích, thiết thực về luận án tiến sĩ củatôi Nó như là nguồn động lực giúp tôi luôn luôn cố gắng và phấn đấu hếtmình Một lần nữa tôi muốn nói, tôi rất biết ơn hai thầy.

Cũng xin gửi lời cảm ơn chân thành đến PGS TS Hồ Quảng Đồ, PGS.TS Nguyễn Văn Mười, PGS TS Lý Nguyễn Bình, PGS TS Nguyễn CôngHà, PGS TS Trần Thanh Trúc đã luôn hỗ trợ và tạo mọi điều kiện thuận lợicho tôi trong suốt tiến trình học tập.

Xin chân thành cảm ơn Ban Giám hiệu trường Đại học Cần Thơ, KhoaSau Đại học, Ban chủ nhiệm Khoa Nông nghiệp, Bộ môn Công nghệ Thựcphẩm, Phòng thí nghiệm; các Phòng ban, Khoa liên quan đã tạo điều kiệnthuận lợi cho tôi học tập và nghiên cứu tại trường.

Đặc biệt, xin được gửi đến Ban Giám hiệu, Ban Lãnh đạo Viện Côngnghệ Sinh học và Thực phẩm, Trường đại học Công nghiệp thành phố Hồ ChíMinh lời cảm ơn chân thành và sâu sắc nhất Nhà trường và Viện đã hỗ trợkinh phí, điều kiện và thời gian cho tôi trong bốn năm học tập và nghiên cứutại trường Đại học Cần Thơ Bên cạnh đó, tôi thật sự cảm động trước tình cảmvà sự quan tâm giúp đỡ của các bạn đồng nghiệp trong và ngoài trường, xincảm ơn các bạn rất nhiều.

Cuối cùng, xin gửi lòng biết ơn sâu sắc đến gia đình, người thân đã luônluôn ủng hộ, sát cánh bên tôi Công ơn này tôi xin khắc sâu trong lòng.

NCSĐỗ Viết Phương

TÓM TẮT

Nghiên cứu được thực hiện nhằm xác định phương pháp tiền xử lý thích

hợp nhất trên đối tượng vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta) Đồng thời, nghiên

cứu cũng tập trung thu nhận chế phẩm enzyme cellulase từ nấm mốc phân lậpđược từ quả cà phê Sau đó là quá trình ứng dụng enzyme này vào quá trìnhthủy phân vỏ quả cà phê và so sánh hiệu quả thủy phân với enzyme thươngmại Bên cạnh đó, việc đưa ra chế độ khử độc dịch thủy phân, thiết lập cácthông số cho quá trình lên men tạo ethanol cũng được quan tâm nghiên cứu.

Nội dung nghiên cứu đầu tiên là quá trình khử bớt caffeine và polyphenoltrong vỏ quả cà phê bằng ba phương pháp trích ly khác nhau bao gồm: Trích lythông thường, trích ly có sự hỗ trợ của vi sóng và trích ly có sự hỗ trợ của siêuâm Tiếp sau đó là các thí nghiệm khảo sát sự ảnh hưởng của các tác nhân tiềnxử lý acid, kiềm, vi sóng và vi sinh vật hay sự kết hợp của các tác nhân đếnmức độ suy giảm hemicellulose và lignin Trong nội dung thứ hai, tiến hànhphân lập nấm mốc có khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase từ các nguồn:đất trồng, quả cà phê, thân cành lá Sau đó là quá trình thu nhận enzymecellulase từ nấm mốc đã phân lập được bằng các tác nhân gây kết tủa khácnhau bao gồm: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol và acetone Enzyme thu nhận đượccùng với enzyme thương mại được sử dụng để thủy phân vỏ quả cà phê và sosánh hiệu quả kinh tế là những vấn đề cơ bản trong nội dung 3 Bên cạnh đó,để đảm bảo cho quá trình lên men được thuận lợi thì dịch thủy phân cần phảiđược kiểm tra và loại bỏ một số chất có độc tính đối với nấm men Nội dungcuối cùng là khảo sát một số yếu tố chính ảnh hưởng đến quá trình lên mencũng như là khảo sát một số phương pháp lên men khác nhau.

Kết quả nghiên cứu cho thấy, hiệu suất khử caffeine và polyphenol bằngphương pháp trích ly có sự hỗ trợ vi sóng đạt 92,3% (đối với caffeine) và87,7% (đối với polyphenol) cao hơn so với hai phương pháp còn lại Tuynhiên, vì lý do kinh tế và tính khả thi nên phương pháp trích ly thông thườngbằng nước nóng được lựa chọn cho việc khử caffeine và polyphenol Khi sosánh các phương pháp tiền xử lý khác nhau cho thấy, tiền xử lý bằng phươngpháp kết hợp acid-kiềm-vi sóng đạt hiệu quả cao nhất khi loại bỏ được 71,4%hemicellulose và 79,2% lignin nhưng vẫn giữ lại được 69,5% cellulose ở điềukiện xử lý: H2SO4 2% ở 140oC trong thời gian 45 phút, NaOH (0,2 g/g) ở120oC trong thời gian 20 phút và vi sóng ở mức công suất 327 W trong vòng

20 phút Trong số 5 dòng nấm mốc phân lập được thì chủng Trichoderma

asperellum QT5 (phân lập từ quả) có khả năng sinh tổng hợp cellulase hoạt

tính cao nhất và đạt 1,17 U/mL (CMCase) sau 48 giờ nuôi cấy trên môi trường

enzyme:ethanol là 1:3,5) thì hoạt tính CMCase tăng lên đáng kể (21,72 U/mL).Ngoài ra, khi ứng dụng enzyme cellulase thu nhận được vào quá trình thủyphân và lên men kết quả cho thấy, đường khử tạo ra trong dịch thủy phân bởienzyme cellulase thu nhận được là 26,02 g/L thấp hơn so với thủy phân bằngenzyme thương mại Viscozyme (43,26 g/L) nhưng hàm lượng ethanol tạothành chỉ thấp hơn 13,8% Đồng thời, nghiên cứu cũng chỉ ra rằng, phươngpháp lên men SHF cho hiệu quả thủy phân cao hơn SSF và SHF+SSF nếukhông xem xét đến mặt thời gian nhưng ngược lại phương pháp lên men SSFcho hiệu quả thủy phân cao hơn nếu xét trong cùng một khoảng thời gian nhưnhau.

Từ khóa: Ethanol, sinh khối lignocellulose, Trichoderma asperellum,

thu nhận cellulase, tiền xử lý, thủy phân cellulose, vỏ quả cà phê.

The aim of the study was to determine the most suitable pretreatment

method for coffee pulp (Coffea robusta) In addition, the study also focused on

recovery of mold cellulase enzyme from coffee berries After that, this enzymewas used in hydrolysis of the coffee pulp Hydrolysis efficiency of the enzymewas compared with that of commercial enzymes Besides, the condition ofhydrolysate detoxification and parameters of the ethanol fermentation processwere also studied.

The first research content was to eliminate caffeine and polyphenolsfrom coffee pulp using three different extraction methods includingmaceration, microwave-assisted extraction and ultrasound-assisted extraction.Then, experiments were to investigate the effects of pretreatment agents suchas acid, alkali, microwave and microbiological or a combination of the agentson removing of hemicellulose and lignin In the second research, the isolationof mold which has high biosynthesis capacity to cellulase collected fromvarious sources such as soil, branches, trunks, coffee pods The third researchwas the recovering process of cellulase enzyme from the mold isolated usingvarious precipitating agents: (NH4)2SO4, NaCl, ethanol and acetone Thecellulase enzyme (crude) and commercial enzyme were used to hydrolyze thecoffee pulp Then, the economic efficiency in coffee pulp hydrolysis werecompared between the two enzymes Besides, to ensure that the fermentationwas perfect, the hydrolyzate needs to be tested to remove some substances thatwere toxic to yeast The final content was to study some main factors affectingthe fermentation process as well as to investigate some different fermentationmethods.

The result showed that the eliminating efficiency of caffeine andpolyphenols using the microwave-assisted extraction method reached 92.3%and 87.7% for caffeine and polyphenols, respectively These were higher thanthose of the other methods However, due to economic aspects and feasibility,the maceration was also selected for decaffeine and depolyphenols process.When comparing different pretreatment methods, it revealed that thepretreatment in combination of dilute acid, dilute alkali and microwave wasthe most effective method, By the combination method, 69.5% of cellulosewas retained; while 71.4% of hemicellulose and 79.2% of lignin were removedunder treatment conditions as follows: H2SO4 2% at 140oC for 45 minutes,alkali pretreated with NaOH 0.2 g/g biomass at 120oC for 20 minutes, andmicrowave at 327 W for 20 minutes Among five strains of molds isolated,

biosynthesis and reached

to 1.17 U/mL (CMCase) after 48 hours of culture in a basic liquid medium.Then, the crude enzyme was purified using ethanol (enzyme:ethanol ratio was1:3.5), the CMCase activity increased significantly (21.72 U/mL) In addition,when using the recovery cellulase enzyme for the hydrolysis and fermentationprocesses, the results indicated that the reduction sugar in the hydrolyzateusing the recovery cellulase was 26.02 g/L lower than that of the commercialViscozyme (43.26 g/L) but ethanol content was only 13.8% lower.Furthermore, result of the study also showed that the SHF fermentationmethod was more effective hydrolysis than SSF and SHF + SSF if ignoring thefermentation time By contrast the SSF fermentation method was moreeffective hydrolysis than the others in the same fermentation time.

Keywords: Biomass lignocellulose, cellulose hydrolysis, coffee pulp,

enzyme recovery, ethanol, pretreatment, Trichoderma asperellum.

LỜI CAM ĐOAN

Tôi xin cam đoan luận án này được hoàn thành dựa trên các kết quảnghiên cứu của tôi và các kết quả của nghiên cứu này chưa được dùng cho bấtcứ luận án cùng cấp nào khác.

Cần Thơ, ngày tháng năm

Chương 1: GIỚI THIỆU 1

1.1 Tính cấp thiết của đề tài 1

1.2 Mục tiêu nghiên cứu 3

1.2.1 Mục tiêu tổng quát 3

1.2.2 Mục tiêu cụ thể 3

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu 3

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu: 3

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu: 3

1.4 Ý nghĩa của luận án 4

1.4.1 Ý nghĩa khoa học 4

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn 4

1.5 Điểm mới của luận án 4

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU 5

2.1 Nguyên liệu cà phê 5

2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối 5

2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê 8

2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol 10

2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học) 11

2.2.1 Cấu tạo và tính chất của cellulose 13

2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose 15

2.2.3 Cấu tạo và tính chất của lignin 18

2.3 Quá trình thủy phân vỏ quả cà phê 19

2.3.1 Cơ chế phân hủy sinh học cellulose 20

2.3.2 Cơ chế thủy phân hemicellulose 22

2.3.3 Cơ chế phân hủy lignin 26

2.4 Một số phương pháp tiền xử lý sinh khối lignocellulose 27

2.4.1 Tiền xử lý bằng acid 28

2.4.2 Tiền xử lý bằng kiềm 31

2.4.3 Tiền xử lý bằng vi sinh vật 33

2.5 Giới thiệu về nấm mốc Aspergillus và Trichoderma 36

2.5.1 Giới thiệu về Aspergillus niger 36

2.5.2 Giới thiệu về Trichoderma 37

2.5.3 Ảnh hưởng của thành phần môi trường đến quá trình sinh tổng hợp enzyme cellulase 38

2.6 Thực trạng sản xuất ethanol trên thế giới và ở Việt Nam 42

2.6.1 Tình hình sản xuất ethanol trên thế giới 42

2.6.2 Tình hình sản xuất ethanol ở Việt Nam 44

2.7 Các nghiên cứu trong và ngoài nước 46

2.7.1 Một số nghiên cứu về tiền xử lý sinh khối lignocellulose 46

2.7.2 Một số nghiên cứu về sản xuất ethanol từ sinh khối lignocellulose 48

Chương 3: PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 52

3.1 Phương tiện nghiên cứu 52

3.1.1 Địa điểm và thời gian nghiên cứu 52

3.1.2 Nguyên liệu và hóa chất 52

3.1.3 Dụng cụ và thiết bị 53

3.2 Phương pháp nghiên cứu 54

3.2.1 Phương pháp chuẩn bị mẫu 54

3.2.2 Các phương pháp phân tích và đo đạc 55

3.2.3 Phương pháp thu thập và xử lý kết quả 56

3.3 Phương pháp bố trí thí nghiệm 57

3.3.1 Xác định thành phần hóa học cơ bản của vỏ quả cà phê vối 58

3.3.2 Nội dung 1: Khảo sát quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê 58

3.3.3 Nội dung 2: Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 66

3.3.4 Nội dung 3: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phân 70

3.3.5 Nội dung 4: Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng quá trình lên men 74

Chương 4: KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 78

4.1 Xác định thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối 78

4.2 Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 79

4.2.1 Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol 79

4.2.2 Tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine và polyphenol 82

4.2.3 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 84

4.2.4 Ảnh hưởng của quá trình tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin 90

4.2.5 Tiền xử lý vỏ quả cà phê bằng chủng nấm P chrysosporium 93

4.2.6 Hiệu quả của việc kết hợp nhiều phương pháp tiền xử lý trên đối tượng vỏ quả cà phê 96

4.3 Thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc 103

4.3.1 Kết quả phân lập một số dòng nấm mốc có đặc tính hình thái giống nhóm nấmAspergillus và Trichoderma 103

4.3.2 Khả năng sinh tổng hợp enzyme cellulase của các chủng nấm mốc phân lập được 105

Định danh năm dòng nấm mốc phân lập được 108

4.3.3 Xác định các điều kiện môi trường nuôi cấy nấm T asperellum QT5 109

4.3.4 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng muối (NH4)2SO4 115

4.3.5 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng muối NaCl 116

4.3.6 Thu nhận enzyme cellulase từ T asperellum QT5 bằng dung môi ethanol và acetone 117

4.4 Nghiên cứu quá trình thủy phân cellulose có trong vỏ quả cà phê bởi hệ enzyme cellulase 120

4.4.1 Ảnh hưởng của loại enzyme đến hiệu quả quá trình thủy phân 120

4.4.2 Ảnh hưởng của nồng độ enzyme đến quá trình thủy phân 123

4.4.3 Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian đến quá trình thủy phân 125

4.4.4 Tối ưu hóa các thông số quá trình thủy phân bởi enzyme cellulase thu nhận từ nấm mốc T asperellum QT5 127

4.4.5 Nghiên cứu quá trình khử độc dịch thủy phân 131

4.5 Nghiên cứu quá trình lên men dịch thủy phân vỏ quả cà phê 135

4.5.1 Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men ban đầu bổ sung vào quá trình lên men 135

4.5.2 Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được 136

4.5.3 Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được 137

4.5.4 Ảnh hưởng của phương pháp lên men đến hàm lượng ethanol thu được 139

Chương 5: KẾT LUẬN VÀ ĐỀ XUẤT 142

5.1 Kết luận 1425.2 Đề xuất 142TÀI LIỆU THAM KHẢO 143

PHỤ LỤC A: CÁC PHƯƠNG PHÁP KIỂM TRA PHÂN TÍCH 160

PHỤ LỤC B: BẢNG KẾT QUẢ VÀ PHÂN TÍCH THỐNG KÊ 172

PHỤ LỤC C: KẾT QUẢ GỬI MẪU PHÂN TÍCH 200

PHỤ LỤC D: MỘT SỐ HÌNH ẢNH THÍ NGHIỆM 209

DANH SÁCH BẢNG

Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của quả cà phê vối 5

Bảng 2.2: Thành phần hóa học lớp vỏ quả cà phê vối 6

Bảng 2.3: Thành phần hóa học của lớp vỏ nhớt và vỏ trấu của quả cà phê vối 7

Bảng 2.4: Thành phần chất xơ có trong sinh khối lignocellulose 13

Bảng 2.5: Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose 32

Bảng 2.6 Loại kiềm thường được sử dụng để tiền xử lý sinh khối lignocellulose 39

Bảng 2.7: Dự tính sản lượng ethanol toàn cầu 43

Bảng 3.1: Các chỉ tiêu, phương pháp phân tích và đo đạc 56

Bảng 4.1: Thành phần hóa học của vỏ quả cà phê vối 78

Bảng 4.2: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu 82

Bảng 4.3: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF 82

Bảng 4.4: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy 83

Bảng 4.5: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm 84

Bảng 4.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ H2SO4 85

Bảng 4.7: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin trong vỏ quả cà phê theo tỷ lệ NaOH 90

Bảng 4.8: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose và lignin theo thời gian và độ ẩm nguyên liệu 94

Bảng 4.9: Số dòng nấm mốc được phân lập từ một số nguồn 104

Bảng 4.10: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase 106

Bảng 4.11: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase từ các dòng nấm mốc 107

Bảng 4.12: Kết quả định danh các chủng nấm mốc phân lập được 109

Bảng 4.13: Ảnh hưởng của nồng độ (NH4)2SO4 đến khả năng thu nhận enzyme cellulase 115

Bảng 4.14: Ảnh hưởng của nồng độ NaCl đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase 117

Bảng 4.15: Ảnh hưởng của nồng độ ethanol đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase 118

Bảng 4.16: Ảnh hưởng của nồng độ acetone đến hiệu quả thu nhận enzyme cellulase 118

Bảng 4.17: So sánh hiệu quả tinh sạch cellulase bằng các tác nhân kết tủa khác nhau 119

Bảng 4.18: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose giải phóng sau quá trình thủy phân 121

Bảng 4.19: Chi phí thủy phân của các loại enzyme khác nhau 122

Bảng 4.20: Mức thay đổi của các nhân tố tối ưu 128

Bảng 4.21: Bố trí thí nghiệm và kết quả dự đoán theo mô hình CCF 128

Bảng 4.22: Kết quả phân tích phương sai và các hệ số phương trình hồi quy 129

Bảng 4.23: Các thông số tối ưu của mô hình quy hoạch thực nghiệm 131

Bảng 4.24: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol thu được 138

Bảng 4.25: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF 140

Bảng PL B.1: Ảnh hưởng của các phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine vàpolyphenol 172Bảng PL B.2: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ

Bảng PL B.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự

thay đổi hàm lượng cellulose 173

Bảng PL B.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose 174

Bảng PL B.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng lignin 176

Bảng PL B.6: Sự thay đổi hàm lượng cellulose, hemicellulose, lignin theo nồng độ NaOH 178

Bảng PL B.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng cellulose 178

Bảng PL B.8: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng hemicellulose 180

Bảng PL B.9: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng lignin 182

Bảng PL B.10: Tiền xử lý bằng chủng nấm P chrysosporium 183

Bảng PL B.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổihàm lượng đường khử có trong dịch tiền xử lý 185

Bảng PL B.12: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau 185

Bảng PL B.13: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân vỏ quả cà phê 186

Bảng PL B.14: Phân nhóm nấm mốc có tính đặc hiệu với enzyme cellulase 187

Bảng PL B.15: Đường kính vòng phân giải và hoạt tính CMCase 189

Bảng PL B.16: Hoạt tính CMCase theo các điều kiện nuôi cấy 189

Bảng PL B.17: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối (NH4)2SO4 191

Bảng PL B.18: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với muối NaCl 191

Bảng PL B.19: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với ethanol 192

Bảng PL B.20: Hiệu quả tinh sạch cellulase bằng phương pháp kết tủa với acetone 193

Bảng PL B.21: Ảnh hưởng của loại enzyme đến hàm lượng đường khử và glucose được giải phóng sau quá trình thủy phân 194

Bảng PL B.22: Chi phí khi sử dụng các loại enzyme khác nhau 194

Bảng PL B.23: Ảnh hưởng của tỷ lệ enzyme cellulase bổ sung vào quá trình thủy phân 195

Bảng PL B.24: Ảnh hưởng của nhiệt độ thủy phân đến hàm lượng đường khử 195

Bảng PL B.25: Ảnh hưởng của thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử 196

Bảng PL B.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân 196

Bảng PL B.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 197Bảng PL B.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến quá trình lên men 197

Bảng PL B.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol 198

Bảng PL B.30: Ảnh hưởng của thời gian lên men đến hàm lượng ethanol 198

Bảng PL B.31: So sánh hiệu quả lên men SHF, SSF và SHF+SSF 199

DANH SÁCH HÌNH

Hình 2.1: Cấu tạo quả cà phê vối 5

Hình 2.2: Các thành phần của vỏ qủa cà phê 6

Hình 2.3: Quy trình chế biến cà phê nhân ở Việt Nam 7

Hình 2.4: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ vỏ quả cà phê 8

Hình 2.5: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn cellulose trong vỏ quả cà phê 9

Hình 2.6: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn hemicellulose trong vỏ quả cà phê 9

Hình 2.7: Cấu trúc của lignocellulose 12

Hình 2.8: Mô phỏng cấu trúc của sinh khối lignocellulose 12

Hình 2.14: Các đơn vị cơ bản của lignin 19

Hình 2.15: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases 20

Hình 2.16: Cơ chế hoạt động của Endo-β-1,4-glucanases 21

Hình 2.17: Cơ chế hoạt động của Exo-β-1,4-glucanases 21

Hình 2.18: Cơ chế thủy phân cellulose của hệ cellulase 22

Hình 2.19: Quá trình thủy phân hemicellulose bởi acid/kiềm 23

Hình 2.20: Sơ đồ chung quá trình thủy phân hemicellulose 24

Hình 2.21: Sơ đồ hình thành furfural từ đường 5C 24

Hình 2.22: Sơ đồ hình thành HMF từ đường 6C 25

Hình 2.23: Hydrate hóa HMF 25

Hình 2.24: Tóm tắt sơ đồ hình thành một số chất gây độc 26

Hình 2.25: Quá trình phân hủy lignin bởi kiềm 27

Hình 2.26: Quá trình phân hủy lignin bởi acid 27

Hình 2.27: Cấu trúc nguyên liệu trước và sau khi tiền xử lý 28

Hình 2.28: Phanerochaete chrysosporium trên môi truờng nuôi PGA 35

Hình 3.1: Quả và vỏ cà phê vối tươi 52

Hình 3.2: Các kích thước vỏ quả cà phê sau khi nghiền và sàng 55

Hình 3.3: Sơ đồ bố trí thí nghiệm tổng quát 57

Hình 3.4: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nồng độ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 61

Hình 3.5: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của tỷ lệ, nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 63

Hình 3.6: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng nấm mục trắng P chrysosporium đến sự thay đổi hàm lượng chất xơ 64

Hình 3.7: Sơ đồ bố trí thí nghiệm xác định ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 cho vào để khử độc dịch thủy phân 73

Hình 4.1: Ảnh hưởng của phương pháp trích ly đến hiệu suất khử caffeine và polyphenol 80

Hình 4.2: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổihàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê 87

Hình 4.3: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổihàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê 87Hình 4.4: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng H2SO4 đến sự thay đổi

Hình 4.5: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổi

hàm lượng cellulose có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.6: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổihàm lượng hemicellulose có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.7: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian tiền xử lý bằng NaOH đến sự thay đổihàm lượng lignin có trong vỏ quả cà phê 91

Hình 4.8: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự thay đổi hàmlượng đường khử có trong dịch tiền xử lý 98

Hình 4.9: Sự thay đổi thành phần chất xơ trong vỏ quả cà phê theo các phương pháp tiền xử lý khác nhau 98

Hình 4.10: Bề mặt của vỏ quả cà phê sau khi được tiền xử lý bằng các phương pháp khác nhau dưới kính hiển vi điện tử (SEM) 100

Hình 4.11: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành đường glucose và đường khử sau quá trình thủy phân 101

Hình 4.12: Sự thay đổi tỷ lệ các thành phần có trong vỏ quả cà phê qua các bước tiền xử lý khác nhau 103

Hình 4.13: Sự thay đổi màu sắc, hình dạng của nguyên liệu qua các bước tiền xử lý khác nhau 103

Hình 4.14: Khuẩn lạc của Aspergillus phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và từđất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) 105

Hình 4.15: Khuẩn lạc của Trichoderma phân lập được từ cành lá mục, quả cà phê và từ đất trồng (Các hình tương ứng từ trái sang phải) 105

Hình 4.16: Đường kính vòng phân giải CMC của các chủng nấm mốc 108

Hình 4.17: Ảnh hưởng của thời gian và nhiệt độ nuôi cấy đến hoạt lực CMCase 110

Hình 4.18: Ảnh hưởng của pH và nồng độ dịch chiết khoai tây đến hoạt lực CMCase 112

Hình 4.19: Ảnh hưởng của cơ chất cảm ứng đến hoạt lực CMCase 113

Hình 4.20: Ảnh hưởng của cơ nguồn nitơ và khoáng chất đến hoạt lực CMCase 114

Hình 4.21: Ảnh hưởng của nồng độ enzyme bổ sung vào quá trình thủy 124

Hình 4.22: Ảnh hưởng của nhiệt độ và thời gian thủy phân đến hàm lượng đường khử 125

Hình 4.23: Đường khử tạo thành ở 50oC giữa enzyme thu nhận được với enzyme thương mại 125

Hình 4.24: Mối tương quan giữa các nhân tố ảnh hưởng đến hàm lượng đường khử ở các mức tối ưu 130

Hình 4.25: Mối tương quan giữa giá trị thực nghiệm và giá trị dự đoán của hàm lượng đường khử 131

Hình 4.26: Ảnh hưởng của các phương pháp tiền xử lý khác nhau đến sự hình thành HMF và furfural có trong dịch thủy phân 132

Hình 4.27: Ảnh hưởng của thể tích Ca(OH)2 đến sự tạo thành kết tủa CaSO4 134

Hình 4.28: Ảnh hưởng của mật độ tế bào nấm men đến hàm lượng ethanol và đường glucose 135

Hình 4.29: Ảnh hưởng của nhiệt độ lên men đến hàm lượng ethanol thu được 136

Hình 4.30: Ethanol thu được theo thời gian lên men 138

Hình PL D.1: P chrysosporium nuôi cấy 7 ngày 209

Hình PL D.2: Nhân giống chủng P chrysosporium 209

Hình PL D.3: Quả cà phê mốc 210

Hình PL D.4: Đất trồng cà phê 210

Hình PL D.5: Thân cành cà phê 210

Hình PL D.7: A niger và T asperellum phân lập được từ cà phê 211

Hình PL D.8: T longibrachiatum và P Chrysosporium phân lập được từ cà phê 211

Hình PL D.9: Nguyên liệu ban đầu 212

Hình PL D.10: Nguyên liệu sau tiền xử lý 212

Hình PL D.11: Xác định hàm lượng chất xơ 212

Hình PL D.12: Chuẩn bị mẫu tiền xử lý 213

Hình PL D.13: Tiền xử lý bằng chủng P chrysosporium sau 10, 15 và 20 ngày 213

Hình PL D.14: Kết tủa enzyme thô 213

Hình PL D.15: Xây dựng đường chuẩn 214

Hình PL D.16: Nhân giống nấm men 214

Hình PL D.17: Dịch thủy phân 214

Hình PL D.18: Lên men dịch thủy phân 214

DANH MỤC TỪ VIẾT TẮT

AAO : Aryl alcohol oxidases

ABTS : 3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid AOAC : Association of Official Analytical ChemistsCBH : Cellobiohydrolase

CBU : Cellobiose unit

CMC : Carboxymethyl cellulose CMCase : Carboxymethyl cellulase assayCTAB : Cetyl-trimethylammonium bromide

NLSH : Năng lượng sinh họcPGA : Potato glucose agarPPNN : Phụ phẩm nông nghiệpPTN : Phòng thí nghiệm

SEM : Scanning electron microscopy

SHF : Separate hydrolysis and fermentation

SSF : Simultaneous saccharification and fermentation

TP.HCM : Thành phố Hồ Chí Minh

VSV : Vi sinh vật

Chương 1: GIỚI THIỆU

1.1 Tính cấp thiết của đề tài

Việt Nam hiện nay là nước xuất khẩu cà phê vối đứng thứ nhất trên thếgiới, cũng như có tổng sản lượng cà phê nhân xuất khẩu đứng thứ hai trên thếgiới chỉ sau Brazil Tổng sản lượng trong năm 2018 là 1.758.000 tấn cà phênhân (USDA, 2018) và hàng năm thải ra môi trường khoảng 460.000 tấn vỏ càphê khô Lượng phế thải này chủ yếu là làm chất đốt để sấy quả và hạt cà phê.Tuy nhiên việc dùng vỏ cà phê để làm chất đốt hiện nay gây ô nhiễm môitrường một cách trầm trọng Ngoài ra, một phần vỏ cà phê người dân ủ đốngvà bón lại cho các gốc cây cà phê nhưng cũng không có hiệu quả cao vì vỏ càphê chưa qua xử lý để chuyển thành phân bón Cho đến thời điểm hiện tại,cũng chỉ một phần nhỏ được sản xuất làm phân bón và làm thức ăn gia súc.

Trên thế giới cũng có các công trình nghiên cứu tận dụng phế thải từ càphê như: Sử dụng vỏ cà phê, lá cà phê làm giá thể để trồng nấm (Leifa et al.,

2001), sử dụng vỏ quả cà phê, vỏ trấu cà phê làm nguồn carbon để lên men tạoacid gibberellic từ đó sản xuất acid citric (Shankaran and Lonsane, 1994) Vỏcà phê còn được sử dụng để sản xuất than hoạt tính trong công nghiệp xử lýnước thải (Franca et al., 2009) Đáng quan tâm nhất, vỏ quả cà phê cũng đượcnghiên cứu sản xuất ra ethanol bằng phương pháp hóa học (Shenoy et al.,2011) Tuy nhiên nghiên cứu này có hạn chế lớn khi dùng acid và kiềm mạnhđể thủy phân vỏ quả sẽ gây ô nhiễm môi trường ở mức nghiêm trọng cũng nhưtrang thiết bị cơ giới hóa tốn kém, khó chế tạo.

Trong vài thập niên gần đây, đứng trước nhu cầu năng lượng ngày càngtăng và vấn đề ô nhiễm môi trường do sử dụng nhiên liệu hóa thạch đã thúcđẩy các nước phải quan tâm nhiều hơn trong việc theo đuổi và thay thế bằngcác nguồn năng lượng tái tạo và đặc biệt là sản xuất ethanol Một trong nhữngnguồn nguyên liệu dồi dào nhất đến thời điểm hiện tại để sản xuất ethanol đólà sinh khối lignocellulose Các nhà khoa học ước tính rằng sản xuất ethanol từsinh khối lignocellulose có thể tăng gấp 16 lần sản lượng hiện tại (Saha andCotta, 2008) Nghiên cứu gần đây chỉ ra tiềm năng tuyệt vời của phế thải vỏ càphê trong việc sản xuất ethanol (Kwon et al., 2013) Nếu đốt ethanol thay vìxăng sẽ giảm hơn 80% lượng khí thải carbon ra môi trường (Mussatto et al.,

Tuy nhiên rào cản lớn nhất trong việc sản xuất ethanol từ nguồn nguyênliệu này đó chính là trong nguyên liệu có chứa nhiều hemicellulose và lignin.Các chất này liên kết chặt chẽ với cellulose và tạo rào chắn bảo vệ sự tấn côngcủa các loại hóa chất cũng như các loại enzyme tới phân tử cellulose

(Ragauskas et al., 2006; Hahn-Hägerdal et al., 2006) Hàm lượng lignin trong

vỏ quả cà phê

chiếm khoảng 17,5÷20,07% là tương đối cao Điều này như là một cản trở lớncho quá trình tiền xử lý vỏ quả cà phê trước khi thủy phân và lên men tạoethanol Do đó, cần thiết phải có những khảo sát về các phương pháp tiền xửlý để loại bỏ thành phần lignin này đồng thời phải giữ lại lượng cellulose cótrong nguyên liệu trước khi tiến hành quá trình thủy phân và lên men tạoethanol.

Để có thể sản xuất ethanol, các polymer sinh học mà chủ yếu là cellulosephải được phân giải thành các đường đơn Có hai hướng tiếp cận vấn đề này,đó là thông qua thủy phân bằng acid và thủy phân bằng enzyme Công nghệthủy phân bằng acid cho đến hiện nay không còn nghiên cứu nhiều mà cácnghiên cứu tập trung vào thủy phân bằng enzyme hứa hẹn sẽ mang lại nhiềuđột phá về mặt công nghệ Tuy nhiên, thủy phân bằng enzyme gặp phải vấn đềlớn đó là giá thành enzyme còn khá cao Các chế phẩm enzyme cellulasethương mại đến từ các nhà sản xuất lớn trên thế giới như Mỹ, Đan Mạch, Ấn

Độ giá thành dao động tùy thuộc vào hoạt lực chẳng hạn như: Cellulase từ A.

niger giá 4,5 triệu đồng cho 25g (hoạt tính 0,8 U/mg), hay cellulase từ T.reesei giá 3,5 triệu đồng cho 50 mL (hoạt tính 700 U/g).

Cho đến hiện nay, các nghiên cứu trong và ngoài nước về enzymecellulase chủ yếu tập trung vào việc tách dòng gen mã hoá cellulase, tinh sạchvà nghiên cứu đặc điểm hoá sinh của cellulase, tối ưu những điều kiện nuôicấy thu nhận chế phẩm enzyme từ các loài nấm mốc, vi khuẩn và xạ khuẩn.Trái lại, việc khai thác ứng dụng cellulase từ nguồn tự nhiên gặp nhiều hạn chếdo năng lực sinh tổng hợp của chủng giống, không chủ động nguồn enzyme,khó can thiệp thay đổi tính chất về động học enzyme, độ bền nhiệt độ và pH,khả năng hoạt động trong những điều kiện nồng độ cao chất tẩy rửa và dungmôi hữu cơ Do đó, rất cần có những nghiên cứu về việc ứng dụng cellulase cónguồn gốc tự nhiên mà đặc biệt là từ các chủng nấm mốc hiện diện ngay trêncơ chất thủy phân của enzyme cellulase.

Trên thực tế, việc sản xuất cà phê ở Việt Nam lại tập trung chủ yếu ở cáctỉnh Tây Nguyên cho nên sẽ giảm thiểu được chi phí thu gom nguyên liệu.Ngoài ra, có thể nhận thấy được tiềm năng về trữ lượng vỏ cà phê ở Việt Namrất lớn, cùng với vấn đề mang tính thời sự đó là bài toán giải quyết ô nhiễmtrường, tìm và thay thế nguồn năng lượng hóa thạch đang dần cạn kiệt Chínhvì vậy, vỏ cà phê vối được chọn lựa làm nguyên liệu cho nghiên cứu: “Nghiên

cứu quá trình tiền xử lý và hệ vi sinh vật phân giải vỏ quả cà phê vối (Coffea

robusta) để lên men tạo ethanol”.

1.2 Mục tiêu nghiên cứu

1.2.1 Mục tiêu tổng quát

Sử dụng các tác nhân acid, kiềm, vi sóng hay nấm mục trắng để tiền xửlý vỏ quả cà phê vối nhằm loại bỏ nhiều nhất hemicellulose và lignin ra khỏinguyên liệu Đồng thời là quá trình thu nhận enzyme cellulase từ nấm mốc vàứng dụng vào thủy phân vỏ quả cà phê Dịch thủy phân được đem đi lên menđể so sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được với enzyme thươngmại.

1.2.2 Mục tiêu cụ thể

(1) Khảo sát quá trình khử caffeine, polyphenol và quá trình tiền xử lý vỏquả cà phê đồng thời tối ưu hóa các thông số quá trình khử caffeine, khửpolyphenol.

(2) Thu nhận chế phẩm enzyme cellulase thô từ nấm mốc và tinh sạch sơbộ bằng phương pháp kết tủa với dung môi hữu cơ và muối vô cơ.

(3) So sánh hiệu quả thủy phân giữa enzyme thu nhận được và enzymethương mại Đồng thời khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình thủy phânvà tối ưu hóa điều kiện thủy phân nhằm thu được hàm lượng đường khử là caonhất.

(4) Kiểm tra thành phần dịch thủy phân và đưa ra phương pháp khử độc dịch thủy phân.

(5) Khảo sát các yếu tố ảnh hưởng đến quá trình lên men và các phương pháp lên men dịch thủy phân để tạo ethanol.

1.3 Đối tượng và phạm vi nghiên cứu

1.3.1 Đối tượng nghiên cứu:

Vỏ quả cà phê vối (Coffea robusta): Quả cà phê vối tươi được thu nhận

tại xã Pơng Drang – huyện Krông Buk – tỉnh Đăk Lăk Sau đó tách lấy vỏ quảrồi sấy khô ở 60oC trong 12 giờ.

Nguồn phân lập nấm mốc: Quả cà phê mốc, cành, thân, lá cây cà phê, đấttrồng được thu nhận tại vườn trồng cà phê (xã Pơng Drang – huyện Krông Buk– tỉnh Đăk Lăk).

1.3.2 Phạm vi nghiên cứu:

Phạm vi không gian: Đề tài chi tập trung các khâu chính như: tiền xử lý,nuôi cấy nấm mốc, thu nhận enzyme thô, thủy phân và lên men Một số nội

Phạm vi thời gian: Khó khăn của đề tài là ở công đoạn tiền xử lý bằng visinh vật có thể kéo dài vài tháng, cho nên đề tài chỉ tập trung nghiên cứu, khảosát thời gian tối đa là 60 ngày.

1.4 Ý nghĩa của luận án

1.4.1 Ý nghĩa khoa học

Nghiên cứu và đưa ra các giải pháp hữu ích nhằm giải quyết vấn đề phụphẩm trong công nghiệp chế biến là khuynh hướng nghiên cứu đang đượcquan tâm ở trong và ngoài nước Việc sử dụng vỏ quả cà phê vối là lựa chọncó ý nghĩa thực tiễn khi Việt Nam là nước xuất khẩu cà phê nhân lớn thứ 2 thếgiới (đặc biệt, xuất khẩu cà phê Robusta lớn nhất thế giới).

Kết quả nghiên cứu từ luận án đã cung cấp số liệu về thành phần hóa họccủa vỏ quả cà phê vối, cho thấy tính khả thi của việc sử dụng nguồn phụ phẩmnày như nguồn sinh khối lignocellulose tiềm năng để sản xuất ethanol.

Nghiên cứu đã chú trọng sử dụng các giải pháp hạn chế sử dụng hóa chấtđộc hại nồng độ cao bằng việc kết hợp các phương thức tiền xử lý.

1.4.2 Ý nghĩa thực tiễn

Đặt cơ sở cho việc xây dựng quy trình sản xuất ethanol từ vỏ quả cà phêquy mô công nghiệp Đồng thời, góp phần khai thác triệt để và có hiệu quảnguồn phụ phẩm từ ngành công nghiệp cà phê ở Việt Nam.

1.5 Điểm mới của luận án

Đề xuất được giải pháp tiền xử lý có sự hỗ trợ của vi sóng để giảm đángkể lượng hóa chất sử dụng (chỉ sử dụng kiềm loãng, acid loãng), giúp giảmảnh hưởng đến môi trường và tăng hiệu suất; sự cần thiết của việc điều chỉnhthứ tự của các bước tiền xử lý theo thành phần nguyên liệu.

Đánh giá được sự hình thành và tác động của một số chất hóa học nguyhại cho quá trình lên men và đề xuất được giải pháp loại trừ.

Thu nhận được enzyme cellulase từ dòng nấm mốc Trichoderma

asperellum (QT5) được phân lập từ bề mặt vỏ quả cà phê hỏng, ứng dụng có

hiệu quả trong thủy phân vỏ quả cà phê vối.

Thông tin từ kết quả nghiên cứu là tư liệu khoa học cho việc nghiên cứuvề ethanol sinh học từ các nguồn phụ phẩm có hàm lượng lignin cao, sử dụngtrong giảng dạy về quản lý và tận dụng phụ phẩm trong sản xuất thực phẩm.

Chương 2: TỔNG QUAN TÀI LIỆU

2.1 Nguyên liệu cà phê

2.1.1 Giới thiệu về vỏ quả cà phê vối

Vỏ cà phê là phụ phẩm đầu tiên thu được trong quá trình chế biến cà phênhân ướt (Hình 2.3) Vỏ quả chiếm khoảng 43,2% trọng lượng tươi hoặc28,7% trọng lượng chất khô của toàn bộ quả cà phê (Bảng 2.1) Ước tính hàngnăm trên thế giới thải ra môi trường khoảng 22 triệu tấn vỏ quả tươi, 2,4 triệutấn vỏ nhớt và khoảng 8,6 triệu tấn vỏ thóc Còn ở Việt Nam hàng năm thải ramôi trường khoảng 500 nghìn tấn vỏ quả khô Để xử lý nguồn phế phụ phẩmnày đòi hỏi rất nhiều yếu tố như công nghệ, kinh tế và vấn đề môi trường.Bảng 2.1: Thành phần khối lượng của quả cà phê vối

Hình 2.1: Cấu tạo quả cà phê vối

Vỏ lụa khôVỏ trấu khô

Hình 2.2: Các thành phần của vỏ qủa cà phê

Hình 2.1 cho thấy, thứ tự các lớp vỏ đi từ ngoài vào trong sẽ là: vỏ quả ->vỏ nhớt -> vỏ trấu -> vỏ lụa -> nhân cà phê Trong đó:

Vỏ quả (coffee pulp): Là lớp vỏ ngoài, mềm có màu đỏ (lúc chín) Lớpvỏ quả có chiều dày 0,3÷0,5 mm (Hình 2.2) và chiếm 43,2% so với trọnglượng quả tươi (Bảng 2.1) Trong 100g vỏ quả cà phê có chứa khoảng: 8 gprotein; 2,9 g chất béo; 28,6 g cellulose và 8,9 g tro Vỏ cà phê được xem nhưlà nguồn thức ăn rất tốt cho động vật vì nguồn dinh dưỡng khá cao Tuy nhiêntrong vỏ cà phê có chứa một số thành phần phi dinh dưỡng không tốt chochuyển hóa thức ăn đối với động vật như: tannin (2 g/100 g) và caffeine (1,8g/100 g) (Bảng 2.2).

Bảng 2.2: Thành phần hóa học lớp vỏ quả cà phê vối

Tro 5,7 8,9

(a Murillo et al., 1977; bRojas et al., 2003)

Vỏ nhớt (mucilage): Nằm giữa lớp vỏ trấu và vỏ quả, rất khó tách ra.Chiều dày lớp nhớt 0,2÷0,3 mm Thành phần chính là pectin và đường (Bảng2.3) Lớp nhớt này không hòa tan, hút nước mạnh Lớp nhớt thường đượcdùng chế biến ra nước uống lên men hoặc ethanol.

Vỏ trấu (parchment): Là lớp vỏ mỏng và cứng bao bọc xung quanh nhân.Vỏ trấu chứa nhiều chất xơ, caffeine (khoảng 0,4%) (Bảng 2.3) được khuếchtán ra từ nhân cà phê lúc lên men hoặc lúc phơi khô Vỏ trấu dùng thườngdùng làm chất đốt hoặc than hoạt tính.

Vỏ lụa: Rất mỏng, nằm sát nhân, bám chặt vào nhân Có thể tách hoặckhông tách lớp vỏ này trong quá trình chế biến cà phê nhân.

Bảng 2.3: Thành phần hóa học của lớp vỏ nhớt và vỏ trấu của quả cà phê vối

Hình 2.3: Quy trình chế biến cà phê nhân ở Việt Nam

2.1.2 Một số ứng dụng từ vỏ quả cà phê

Với thành phần dinh dưỡng đầy đủ như vỏ quả cà phê thì đây là điềukiện thuận lợi cho vi sinh vật phát triển, là nguyên nhân gây thối rữa Khôngphải nhà máy nào, người dân nào cũng có điều kiện để sấy khô vỏ quả cà phêvì tốn kém chi phí mà không mang lại lợi nhuận nào Chính vì lẽ đó, việc thảira môi trường khối lượng lớn vỏ cà phê là điều không tránh khỏi Điều này đãlàm lãng phí nguồn nguyên liệu có sẵn và gây ô nhiễm môi trường xungquanh.

Cho nên nhiều nước trên thế giới như Brazil, Mexico, Costarica, đãnghiên cứu các giải pháp tận dụng nguồn phế phụ phẩm này để chế biến ra cácsản phẩm có giá trị gia tăng (Hình 2.4).

Thủy Lên menXay, nghiền

phân-Ủ thành đống

Tiền xử lýỦ đống

Làm giàu protein

Trích lyLọc

Ethanol (nghiên

cứu này)

Giấy

Levulinic acidFormic acid

Acid: lactic, acetic, citric, …Ethanol, Buthanol, GlycerolNấm men, Protein

Hình 2.5: Khả năng sản xuất một số sản phẩm từ nguồn cellulose trong vỏ quảcà phê

(Mussatto et al., 2011)

EnzymeXylo-oligosaccharide

Arabino-oligosaccharide Mannano-oligosaccharideGalacto-oligosaccharide

Furfural Formic acid

Đường xylose,arabinose, mannose,

Acid: lactic, aceticEthanol, GlycerolNấm men, ProteinNhũ tươngXylitol, Arabitol,

Dehydro hóaXử lý acid

Thủy phân

Phân hủysinh họcThủy phân

2.1.3 Khả năng kháng vi sinh vật của caffeine và polyphenol2.1.3.1 Khả năng kháng khuẩn của caffeine

Caffeine gây độc cho hạt giống nảy mầm, vi sinh vật và các sinh vậtbiển, là chất độc đối với vi khuẩn Caffeine ở nồng độ trên 0,0025 g/mL ức chếsự phát triển của nhiều loài vi khuẩn trong môi trường phát triển Một vàinghiên cứu đã cho thấy tác dụng gây đột biến của caffeine qua sự ức chế sửachữa ADN ở vi khuẩn Caffeine ở nồng độ 0,1% có khả năng làm ức chế tổnghợp protein ở vi khuẩn và nấm men và các phản ứng này hoàn toàn bị ức chế ởnồng độ 1% caffeine (Ramanavičienė et al., 2003).

Ở nồng độ thấp khoảng 10-2 M caffeine ức chế phosphodiesterase gây sựức chế hoặc trì hoãn trong phân chia tế bào Đối với nấm men, lượng caffeine> 10 mM có thể gây đột biến Ở nồng độ thấp, có khả năng kháng khuẩn nên

vẫn có thể sinh trưởng và phát triển như E coli và các chủng vi khuẩn khác.

Caffeine cũng ảnh hưởng đến quá trình lên men lactose và sự tổng hợp của

indol do E coli (Ibrahim et al., 2014) Trong nghiên cứu về tác động củacaffeine trên nấm sợi, cả loài Trichoderma và các mầm bệnh, cho thấy rằng

caffeine thể hiện chức năng kép: ức chế quá trình nấm mọc và phát triển(Sugiyama et al., 2016).

Trong cà phê, caffeine là thành phần có khả năng kháng khuẩn Một báocáo cho thấy rằng caffeine tinh khiết có tác dụng kháng khuẩn trực tiếp Hơnnữa, caffeine là chất chống dính và có khả năng phòng chống sâu răng vì nó có

thể làm giảm độ bám dính của vi khuẩn Streptococcus bám vào bề mặt răng

(Rahman et al., 2014).

Aspergillus niger và Aspergillus carbonarius bị ức chế bởi caffeine với

nồng độ <1% caffeine Đối với các chủng Aspergillus westerdijkiae,

Aspergillus ochraceus và Aspergillus steynii, mặc dù bị ức chế tăng trưởng

nhưng một số vẫn có thể phát triển ở 4% caffeine (Akbar et al., 2016).

2.1.3.2 Khả năng kháng khuẩn của polyphenol

Một số phenolic như furanocoumarins không gây ngộ độc nhưng khi tiếpxúc với nhiệt độ cao, dưới ánh sáng có bước sóng gần với tia tử ngoại thì nótrở nên rất độc hại Ngoài ra, nó có thể gắn với DNA ở vị trí gốc kiềmpirimidine làm ức chế khả năng tự sao chép và cuối cùng tế bào chết dần hoặcbị biến đổi gen Phenolic còn có tác dụng ức chế sự phát triển của vi sinh vậtthông qua tác dụng bịt kín các trung tâm hoạt động của enzyme (Dương ThanhLiêm, 2012).

Flavonoid và các acid phenolic là các đại diện có trong các hợp chất

các loại vi khuẩn Gram dương và vi khuẩn Gram âm, bao gồm cả vi khuẩn

probiotic và các tác nhân gây bệnh đường ruột như Salmonela Ngoài ra, các

hợp chất phenolic còn có khả năng ức chế sự phát triển của nấm sợi có thể cómặt trong các loại rau trái không bị hư hỏng hoặc các mô quả bị nhiễm mầmbệnh (Latté and Kolodziej, 2000).

Các phenolic là chất thứ sinh được nghiên cứu sâu rộng và phổ biến nhấtvì chúng có tiềm năng kháng khuẩn rất lớn Đại diện điển hình là quinon Khảnăng kháng vi sinh vật của hợp chất tự nhiên này đã được nghiên cứu vàchứng minh Nó tác động lên vi sinh vật dựa cơ chế tác động lên bề mặt tếbào, phá hủy lớp vỏ peptidoglycan hoặc phá hủy hệ thống enzyme màng vàlàm vi sinh vật chết Các hydrophenolic và các phenolic loại hydroxylcianicnhư caffeic acid, ferulic acid, coumaric acid,…có khả năng ức chế sự sinh

trưởng của các chủng vi khuẩn Staphylococcus aureus, Salmonela typhi,

Bacillus subtilis, E coli,… Các phenolic như tannin có thể ức chế một số liên

cầu khuẩn như Streptococcus, Listeria monocytogenes,… Các

hydroxylatephenol không ức chế mà gây độc cho nấm sợi, nấm men và vikhuẩn.

Phenolic có khả năng ức chế các loại nấm như Aspergillus parasiticus.Trong thí nghiệm nuôi cấy Aspergillus parasiticus cho thấy khi nồng độ tannin

được tăng lên đến 7,5%, ức chế sự phát triển của nấm đến 88%, và khi tăng

nồng độ tannin lên 20% ức chế 96% sự phát triển của Aspergillus parasiticus

(Sanders and Mixon, 1979).

Tannin là một hợp chất của phenolic và tannin có khả năng kháng nấm

sợi như: Epidermophyton floccosum; Microsporum canis; Microsporum

gypseum; Trichophyton mentagrophytes, Trichophyton rubrum; Trichophytontonsurans; Trichophyton Terrestre; Penicillium italicum; Aspergillusfumigatus; Mucor racemosus; Rhizopus nigricans và kháng nấm men như:Candida albicans, Candida glabrata; Candidata krusei; Cryptococcusneoformans Tannin có thể gây độc cho nấm sợi, nấm men và vi khuẩn Tannin

có thể tạo ra chất nền không thể sử dụng được cho các vi sinh vật Có khả

năng kìm hãm vi khuẩn Bacillus anthracis, Corynebacterium pseudomalliae

(Scalbert, 1991).

2.2 Sinh khối lignocellulose (nguyên liệu sản xuất ethanol sinh học)

Sinh khối lignocellulose là hợp chất hữu cơ phong phú nhất trên trái đất.Thế giới tạo ra khoảng 150 tỉ tấn sinh khối hàng năm (Balat and Ayar, 2005).Trong đó, một số cây nông nghiệp có thể tạo ra 24 tấn sinh khối/hecta/năm,các loại tảo và cỏ tạo ra 50 tấn sinh khối/năm.

Sinh khối lignocellulose là nguyên liệu đầy hứa hẹn cho nhiên liệu tái tạo

trong tương lai, là nguồn tài nguyên bền vững trong việc sản xuất các sảnphẩm hữu cơ Hơn nữa sinh khối lignocellulose có thể được sản xuất ở nhiềukhu vực

trên thế giới không có nhiều dầu mỏ, mở ra một lộ trình mới để sản xuất nhiênliệu và hóa chất hữu cơ Vật liệu lignocellulose chủ yếu chứa hỗn hợp cácpolymer carbohydrate như cellulose, hemicellulose và lignin Cellulose là mộtpolymer tuyến tính không phân nhánh của glucose Hemicellulose thuộc vềmột nhóm dị thể polysaccharide chứa cả đường 6 carbon và 5 carbon Cấu trúcphân tử lignin rất phức tạp với các đơn vị phenylpropane liên kết trong mộtcấu trúc ba chiều Ngoài ra chúng cũng chứa một ít protein và chất chiết xuấtkhác với tỷ lệ nhỏ (5÷15%) (Wyman et al., 2005).

Lignocellulose là thành phần cấu trúc chính của thực vật thân gỗ và cácthực vật khác như cỏ, lúa, ngô… Thành phần chủ yếu của lignocellulose làcellulose, hemicellulose, lignin (Palonen and Hetti, 2004).

Hình 2.7: Cấu trúc của lignocellulose

(Palonen and Hetti, 2004)

Hình 2.8: Mô phỏng cấu trúc của sinh khối lignocellulose

(Ramos and Pereira, 2003)

Ba thành phần này liên kết chặt chẽ với nhau chủ yếu qua liên kết cộnghóa trị (Pérez et al., 2002) Trong đó cellulose là một polymer đơn giản nhất,nó chứa nhiều phân tử glucose Còn hemicellulose là một polysaccharide phứctạp chúng có vai trò liên kết các sợi cellulose lại với nhau và có liên kết chéovới lignin Lignin là một polymer ba chiều của các đơn vị phenylpropanoid,được coi là chất keo tế bào tạo nên sự vững chắc cho thành tế bào Khi bathành phần trên liên kết chặc chẽ với nhau và chúng tạo thành một mạng lướiphức tạp và có cấu trúc vững chắc (Rubin, 2008).

Bảng 2.4: Thành phần chất xơ có trong sinh khối lignocellulose

Nguyên liệu hoặc chất thải Cellulose (%) Hemicellulose (%) Lignin (%)Cây trồng:

Phổ biến Bạch đànCây thôngGỗ cứng

Switch grass Bermuda grass Rye grasses

Giấy văn phòngGiấy báoBột giấy

0÷1518÷305÷10Phê thải nông nghiệp:

Bắp ngôThân cây ngô Rơm lúa mì Vỏ trấuBã míaVỏ hạtLá câyPhân chuồng

1518÷2315÷23132030÷4002,7÷5,7Chất thải khác

Rác đã phân loại Rác thô

Nước thải rắnChất thải rắn đô thị

(Sun and Cheng, 2002; Mosier et al., 2005; Goyal et al., 2008; Sassner et al.,2008; Zhang et al., 2009)

2.2.1 Cấu tạo và tính chất của cellulose

Cấu tạo:

Là hợp chất hữu cơ có công thức (C6 H10O5)n, là một polysaccharidephức tạp, gồm một chuỗi tuyến tính từ vài trăm đến hơn 10.000 đơn phân D –glucose nối với nhau bởi liên kết 1,4 β – glucoside (Crawford, 1981; Sjostrom,2013).

Hình 2.9: Cấu trúc cellulose

(Wyman and Charles, 1996)

Cellulose là thành phần cấu trúc chính của thành tế bào ở thực vật, nhiềuloại tảo và lớp nấm trứng (Oomycetes) Một số loài vi khuẩn sản sinh celluloseđể tạo thành màng sinh học Cellulose là một hợp chất hữu cơ phổ biến nhấttrên trái đất Khoảng 33% khối lượng khô của thực vật là cellulose, sợi bông là90%, gỗ là 40÷50% và cây gai dầu khô là khoảng 75% (Buschle-Diller et al.,

Khác với các carbohydrate phức tạp khác như tinh bột, glycogel có cấutrúc cuộn lại hoặc phân nhánh, phân tử chính mở rộng và cấu tạo giống hìnhque khá cứng, cellulose là một polymer có cấu trúc mạch thẳng không cuộnhoặc phân nhánh Sự khác biệt này là do các đơn phân trong cellulose nối vớinhau bằng cầu nối 1,4 β – glycoside; trong khi các carbohydrate khác lại làliên kết 1,4 α – glycoside Nhờ đặc tính này mà các phân tử cellulose dai hơn,bền hơn, rất khó phân hủy ở điều kiện thường (Nguyễn Huy Phiêu và Phùng

Ngọc Bộ, 2002).

Cellulose bao gồm các vùng kết tinh và vùng vô định hình Các chuỗiđược cấu tạo từ ít nhất 500 phân tử glucose và chúng được xếp đối song songtạo thành các vi sợi cellulose có đường kính khoảng 3,5 nm Mỗi chuỗi cónhiều nhóm -OH tự do, vì vậy các sợi ở cạnh nhau liên kết với nhau bằng liênkết hydro Các vi sợi lại liên kết với nhau tạo thành vi sợi lớn hay còn gọi là

trống lớn Khi tế bào còn non, những khoảng này chứa đầy nước, ở tế bào giàthì chứa đầy lignin và hemicellulose Cellulose có nguồn gốc từ thực vậtthường được

tìm thấy trong hỗn hợp với hemicellulose, lignin, pectin và các chất khác,trong khi cellulose từ vi khuẩn là khá tinh khiết, có hàm lượng nước cao hơnnhiều (Klemm et al., 2005).

Các mạch cellulose được liên kết với nhau nhờ liên kết hydro và lực Vander Waals, hình thành hai vùng cấu trúc chính là kết tinh và vô định hình Trongvùng kết kinh, các phân tử cellulose liên kết chặt chẽ với nhau, vùng này khó bịtấn công bởi enzyme cũng như hóa chất Ngược lại, trong vùng vô định hình,cellulose liên kết lỏng lẻo nên dễ bị tấn công Có hai kiểu cấu trúc của celluloseđã được đưa ra nhằm mô tả vùng kết tinh và vô định hình (Miettinen-Oinonen,2004).

Tính chất:

Cellulose là một polymer rắn bán tinh thể, không bị nóng chảy và khá bềnvới nhiệt Ở nhiệt độ gần đến 180oC, các vùng vô định hình của cellulose chưabị phá hủy, không có chuyển động phân tử quy mô lớn và các đặc tính cơ họcvẫn được duy trì Có nghĩa là chúng trở nên cứng khi khô và dẻo khi ướt.Cellulose không hòa tan trong nước và hầu hết các dung môi hữu cơ Celluloselà chất nền hút ẩm, hấp thụ 8÷14% nước ở 20oC và độ ẩm tương đối 60% (RH)(Bohnet, 2003).

Cellulose có thể phân hủy sinh học và không có độc đối với cơ thể sống.Sự phân hủy sinh học của cellulose là một bước thiết yếu trong chu trình carbon.Nếu có thể đạt được sự phân hủy nhanh chóng bằng enzyme sẽ mang lại tiềmnăng to lớn Đặc biệt, mối quan tâm lớn nằm ở việc sử dụng sinh khối cellulosenhư một nguồn năng lượng thông qua phân hủy thành đường sau đó có thể đượcchuyển đổi thành nhiên liệu lỏng (Demain et al., 2005).

2.2.2 Cấu tạo và tính chất của hemicellulose

Cấu tạo:

Hemicellulose là một polymer carbohydrate phức tạp và chiếm 25÷30%tổng trọng lượng khô gỗ Nó là một polysaccharide với trọng lượng phân tửthấp hơn cellulose (Pérez et al., 2002) Nó thường được tìm thấy trong liên kếtvới cellulose, protein, lignin và các hợp chất phenolic trong thành tế bào thứcấp và sơ cấp của thực vật thông qua liên kết cộng hóa trị, liên kết hydro, liênkết ion và tương tác kỵ nước (Slavin et al., 1981).

Hemicellulose là thuật ngữ chỉ một nhóm các homo - và heteropolymerbao gồm các đơn phân chính: D – xylose, D – mannose, D – galactose, D –glucose, và các nhóm thế: L – arabinose, acid 4 – O – methyl – glucuronic, D– galacturonic và D – glucuronic Các phân tử đường liên kết với nhau bằng

liên kết 1,4 β và đôi khi là 1,3 β – glycoside Sự khác biệt chính vớicellulose là