Tổng hợp nano nhũ tương từ tinh dầu vỏ cam sành ứng dụng làm vật liệu kháng khuẩn

Tạp chí Khoa học Cơng nghệ, Số 39B, 2019 TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN ĐOÀN VĂN ĐẠT1*, PHẠM HOÀNG ÁI LỆ1, NGUYỄN PHÁT HẢI1, NGUYỄN THỊ HUYỀN ÂN1, NGUYỄN THỊ THANH HẢI , NGUYỄN VĂN CƢỜNG1, PHẠM TẤN VIỆT2, NGUYỄN THỊ LAN HƢƠNG2 Khoa Cơng nghệ Hóa học, Trường Đại học Cơng nghiệp TP HCM Viện Công nghệ Sinh học & Thực phẩm, Trường Đại học Cơng nghiệp TP HCM doanvandat@iuh.edu.vn Tóm tắt Nano nhũ tƣơng (nanoemulsion) tinh dầu trích ly từ vỏ cam sành đƣợc tổng hợp thành công phƣơng pháp rung siêu âm kết hợp khuấy học Thành phần hóa học mẫu tinh dầu cam đƣợc xác định phƣơng pháp sắc ký khí ghép khối phổ (GC-MS) Phân bố kích thƣớc hạt nano nhũ tƣơng đƣợc khảo sát phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động học (DLS) Các yếu tố kỹ thuật tổng hợp ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt nano nhũ tƣơng đƣợc khảo sát cách chi tiết, nhƣ tỷ lệ hỗn hợp chất hoạt động bề mặt gồm Tween 80 Span 80, thể tích tinh dầu cam ảnh hƣởng thể tích nƣớc Các mẫu nano nhũ tƣơng đƣợc khảo sát khả kháng khuẩn E coli phƣơng pháp phƣơng pháp khuếch tán đĩa thạch Kết nghiên cứu rằng, đƣợc mẫu nano nhũ tƣơng tổng hợp đƣợc có kích thƣớc nano khoảng từ 60 - 120 nm kết hợp với nano bạc mẫu nano nhũ tƣơng có khả kháng khuẩn E coli vƣợt trội so với nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam tinh khiết Từ khóa: tinh dầu cam, sắc ký khí ghép khối phổ, phƣơng pháp tán xạ ánh sáng động học, nano nhũ tƣơng, chất nhũ hóa, ứng dụng kháng khuẩn SYNTHESIS OF KING ORANGE PEEL ESSENTIAL OIL-IN-WATER NANOEMULSIONS FOR ANTIBACTERIAL APPLICATION Abstract Nanoemulsion based on orange essential oil extracted from King orange peels was successfully synthesized by ultrasonic vibration combined with mechanical stirring The chemical composition of the orange essential oil sample was determined by Gas Chromatography - Mass Spectometry (GC-MS) method Particle size distribution of nanoemulsion was investigated by Dynamic Light Scattering (DLS) method The most important technical factors affecting the size of nanoemulsion such as ratio of two types of emulsifiers including Tween 80 and Span 80, the volume of orange essential oil and the effect of water volume were also investigated in detail Nanoemulsion samples were also tested for the resistance to E coli by disc diffusion method The study results showed that the obtained emulsion particles were nanosized in the range from 60 to 120 nm and after combining with nanosilver, the resulted nanoemulsion was capable of resisting E coli superior to nanoemulsion based on pure orange essential oils Keywords: orange peel essential oil, GC-MS, DLS, nanoemulsion, antibacterial application GIỚI THIỆU Tinh dầu hỗn hợp chất thơm đƣợc sử dụng rộng rãi ngành công nghiệp nƣớc hoa, dƣợc phẩm, thực phẩm, dẫn truyền thuốc, kháng khuẩn [1-4] Tinh dầu hỗn hợp 200 hợp chất khác nhau, hợp chất chủ yếu đƣợc hình thành từ hydrocacbon monoterpene, sesquiterpene dẫn xuất oxy hoá chúng nhƣ este, rƣợu, aldehyde aliphat xeton [5] Cam sành (King Orange) có tên khoa học Citrus reticulata × sinensis, thuộc họ Rutaceae, loại cao cấp, có giá trị dinh dƣỡng giá trị sử dụng cao, chứa nhiều chất chống oxy hóa tốt cho sức khỏe, đặc biệt chứa nhiều thành phần vitamin C, giúp tăng đề kháng cho ngƣời đƣợc nhiều ngƣời ƣa chuộng Bên cạnh sản phẩm phụ mang lại nhiều cơng dụng nhƣ làm hƣơng © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 101 liệu thực phẩm, mỹ phẩm dƣợc liệu y học, đặc biệt tinh dầu Tinh dầu cam đƣợc chiết xuất từ hoa vỏ quả, vỏ chiếm lƣợng lớn tinh dầu Thành phần tạo mùi thơm đặc trƣng tinh dầu cam D- Limonene (90%) [6] Tinh dầu cam có hƣơng thơm dịu ngọt, mang lại cảm giác sảng khoái, dễ chịu làm cho tâm trạng ngƣời phấn chấn vui vẻ Tinh dầu cam hỗ trợ điều trị bệnh khó tiêu, trị ho, cảm cúm hiệu quả; giảm đau nhức vùng bắp mệt mỏi, giúp loại bỏ bã nhờn da, điều trị mụn, điều trị nám, mang lại da sáng khỏe đẹp Tinh dầu cam cịn có tính kháng khuẩn tự nhiên, chúng đƣợc sử dụng để giúp bảo quản loại thực phẩm, giúp đảm bảo an tồn, Tinh dầu cam cịn đƣợc sử dụng để ngăn chặn phát triển nhƣ tiêu diệt loại vi khuẩn E coli, loại vi khuẩn nguy hiểm, thƣờng gây bệnh suy thận dẫn đến tử vong Bên cạnh cơng dụng tinh dầu vỏ cam đƣợc để ức chế lây lan phát triển loại vi khuẩn Salmonella, có chứa chất kháng khuẩn mạnh mẽ, đặc biệt Tecpen Nhóm tác giả Zaixiang Lou cộng năm 2017 báo cáo cơng trình nghiên cứu kháng khuẩn, kháng vi nấm tinh dầu từ họ cam chanh Cơng trình nghiên cứu tinh dầu từ họ cam chanh ức chế phát triển vi khuẩn S aureus E coli [7] Những năm gần đây, với phát triển vƣợt bậc công nghệ nano, nhà nghiên cứu dành mối quan tâm to lớn cho việc chuyển hóa tinh dầu trích ly từ thực vật sang dạng nano (nanoemulsion nano nhũ tƣơng) Nano nhũ tƣơng (có đƣờng kính hạt khoảng 20-500 nm) hệ bền mặt nhiệt động, bao gồm dầu, nƣớc chất hoạt động bề mặt đóng vai trị nhũ hóa [8-11] Nhóm tác giả Mohammad Hasan Shahavi cộng năm 2016 báo cáo phƣơng pháp tối ƣu dùng sóng siêu âm tổng hợp tinh dầu nano đinh hƣơng Phƣơng pháp cho hạt nano tinh dầu có kích thƣớc nhỏ 50 nm, phân bố ổn định bền vững mơi trƣờng nƣớc [12] Cũng năm 2016, nhóm tác giả Sheng Jang Zhang cộng báo cáo phƣơng pháp tổng hợp tinh dầu đinh hƣơng tinh dầu quế dạng nano với kích thƣớc hạt 8,69 nm ứng dụng hiệu việc kháng vi sinh vật: Escherichia Coli, Bacillus Subtilis, Salmonella Typhimurium, Staphylococus Aureus [13] Nhóm tác giả Tahir Mehmood cộng năm 2017 báo cáo phƣơng pháp tối ƣu tổng hợp tinh dầu oliu dạng nano, phƣơng pháp cho hạt nano tinh dầu có kích thƣớc hạt 151,68 nm [14] Nhóm tác giả Balagopal Amrutha năm 2017 báo cáo phƣơng pháp tổng hợp nano tinh dầu từ (Cuminum Cynium) hồ tiêu (Piper Nirgrum) sử dụng sóng siêu âm ứng dụng để ức chế hoạt động vi khuẩn E coli S enteria [15] Năm 2018, Yuan Li cộng kết hợp tinh dầu cam chanh với chiosan tạo microcapsules sử dụng nhiều chất hoạt động bề mặt khác phƣơng pháp nhũ tƣơng ion gel cho hạt có kích thƣớc lớn 289,3 nm [16] Tuy nhiên, nghiên cứu chủ yếu tập trung vào phƣơng pháp sản xuất tinh dầu hiệu quả, đặc tính sinh học hóa học loại tinh dầu chiết suất từ thiên nhiên, nhƣ việc chuyển tinh dầu sang dạng nanoemulsion, nanoemulsion đƣợc hỗ trợ hạt nano kim loại, ví dụ nhƣ nano bạc cho ứng dụng kháng khuẩn chƣa đƣợc báo cáo rộng rãi Trong đó, nano bạc vật liệu có diện tích bề mặt riêng lớn, có đặc tính độc đáo sau: tính khử khuẩn, chống nấm, khử mùi; khơng có hại cho sức khỏe ngƣời với liều lƣợng tƣơng đối cao; có khả phân tán ổn định loại dung môi khác nhau; độ bền hóa học cao, khơng bị biến đổi dƣới tác dụng ánh sáng tác nhân oxy hóa khử thông thƣờng [17] Nanoemulsions thƣờng đƣợc tổng hợp cách sử dụng phƣơng pháp nhũ tƣơng lƣợng cao, chẳng hạn nhƣ đồng áp lực cao, khuếch tán vi lỏng, siêu âm cƣờng độ cao [18] Phƣơng pháp siêu âm với mức tiêu thụ lƣợng chất ổn định hơn, cho kích thƣớc hạt nhỏ hơn, độ phân tán cao ƣu điểm kỹ thuật so với phƣơng pháp khác [19] Vì vậy, mục đích nghiên cứu tổng hợp nanoemulsion từ tinh dầu cam trích ly từ vỏ cam sành, sau kết hợp với nano bạc phƣơng pháp rung siêu âm khảo sát hoạt tính sinh học ứng dụng làm chất kháng khuẩn NGUYÊN LIỆU VÀ PHƢƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 2.1 Nguyên liệu Hóa chất đƣợc dùng cho trình tổng hợp gồm trisodium citrate (Na 3C6H5O7.2H2O, ≥99%), tween 80 (C64H124O26, ≥99%), span 80 (C24H44O6, ≥99%), sodium sulphate (Na 2SO4, ≥99%) sodium chloride (NaCl, ≥99,1%) đƣợc đặt từ cơng ty hóa chất Shanghai Shenglong Chemical Co Vỏ cam tƣơi đƣợc thu © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 102 thập giống cam sành (King orange - Citrus reticulata × sinensis) trồng miền nam Việt Nam Nƣớc cất hai lần đƣợc sử dụng làm dung môi chuẩn bị tất dung dịch cần thiết 2.2 Trích ly tinh dầu cam Tinh dầu cam đƣợc trích ly từ vỏ cam sành phƣơng pháp chƣng cất lôi nƣớc trực quy trình mơ tả hình Phƣơng pháp sử dụng thiết bị vận hành đơn giản, dễ áp dụng với quy mô nghiên cứu phịng thí nghiệm 2.3 Tổng hợp nano nhũ tƣơng tinh dầu cam Các hạt nanoemulsion tinh dầu cam đƣợc tổng hợp phƣơng pháp rung siêu âm kết hợp với khuấy học Trong phƣơng pháp chất hoạt động bề mặt Tween 80 Span 80 đƣợc chọn làm chất nhũ hóa cho hệ nhũ tƣơng q trình phân tán tạo hệ nhũ tƣơng đƣợc mơ tả theo qui trình hình Vỏ cam tƣơi Tween 80 Loại bỏ ruột phần phần phao trắng Nƣớc cất Đánh siêu âm 10 phút Xay nhuyễn Khuấy phút Chƣng cất Đánh siêu âm 10 phút Chiết tinh dầu Na2SO4 Tinh dầu cam Khuấy trộn sơ Cân NaCl 10% Span 80 Làm khan Đo DLS kiểm tra kích thƣớc hạt Tinh dầu cam Đánh giá kết Hình 1: Sơ đồ quy trình trích ly tinh dầu cam Hình 2: Sơ đồ quy trình tổng hợp nano nhũ tương tinh dầu cam 2.4 Tổng hợp nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam kết hợp nano bạc Nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam kết hợp nano bạc đƣợc tổng hợp theo quy trình hình Tinh dầu cam đƣợc nhũ hóa hỗn hợp Tween 80 Span 80 với tỉ lệ thích hợp, sử dụng dung dịch nano bạc nhƣ môi trƣờng phân tán Sau đó, hỗn hợp đƣợc rung siêu âm 10 phút, khuấy phút với tốc độ 1200 vòng/phút, tiếp tục cho hỗn hợp rung siêu âm 10 phút thu đƣợc hệ nano nhũ tƣơng tinh dầu dung dịch nano bạc © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN Tween 80 Tinh dầu cam Nano bạc 100 ppm 103 Nƣớc cất Khuấy trộn sơ Đánh siêu âm 10 phút Khuấy phút Đánh siêu âm 10 phút Đo DLS kiểm tra kích thƣớc hạt Đánh giá kết Hình 3: Quy trình tổng hợp nano nhũ tương tinh dầu cam kết hợp với nano Bạc 2.5 Phƣơng pháp phân tích nano tinh dầu Phƣơng pháp GC-MS (Gas Chromatography Mass Spectometry) đƣợc sử dụng để phân tích định tính định lƣợng thành phần chứa tinh dầu cam Phƣơng pháp tán xạ ánh sáng độnghọc (DLS - Dynamic Ligth Scattering) đƣợc sử dụng để xác định phân bố kích thƣớc hạt Phân bố kích thƣớc đƣợc thực thiết bị đo Horiba SZ-100 viện Khoa học Vật liệu Ứng dụng – Viện Hàn Lâm Khoa học & Công nghệ Việt Nam TP Hồ Chí Minh 2.6 Phƣơng pháp nghiên cứu khả kháng khuẩn Phƣơng pháp thử nghiệm khả kháng khuẩn áp dụng kỹ thuật khoanh giấy kháng sinh khuếch tán Quy trình thử nghiệm: cho vi khuẩn vào đĩa petri có chứa mơi trƣờng thạch LB (Luria Bertani), sau dàn vi khuẩn hết bề mặt thạch Đĩa giấy 6mm vô trùng đặt lên bề mặt thạch thấm mẫu thử nghiệm lên, cho mẫu kháng sinh (đối chứng dƣơng) lên bề mặt thạch Bọc kín đĩa petri giấy vô trùng, để điều kiện thƣờng vòng – ngày Quan sát vòng kháng khuẩn xung quang đĩa giấy đánh giá kết Mẫu nano tinh dầu, nano tinh dầu kết hợp với nano Bạc đƣợc xác định khả kháng khuẩn viện sinh học thực phẩm – Trƣờng Đại học Công nghiệp TPHCM KẾT QUẢ VÀ THẢO LUẬN 3.1 Kết GC-MS tinh dầu Cam Thành phần tinh dầu cam đƣợc phân tích phƣơng pháp sắc ký ghép khối phổ, nhiệt độ làm bay tinh dầu trƣớc vào phân tích hai nhiệt độ khác 320oC 600oC Bảng Thành phần tinh dầu cam bay nhiệt độ 320 oC 600 oC Hợp chất -Pinene -Myricene (+)-Limonene Limonene oxide Hàm lƣợng cấu tử (%) 320 oC 600 oC 0,54 0,55 0,24 0,32 75,79 56,88 8,88 17,76 30 ngày 4,66 - © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 104 TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN Hợp chất Cis-Carveol Carvone Cis-Carvone oxide Octanal Decanal Dodecanal -Terpineol -Cadinene -Octadecene Nonadecene Nonadecane Methyloleate Tricosane Eicosane Eicosanoic acid p-aminobezoic acid Docosanoic acid Cyclooctyne Cyclopentenone 3-Octyne 1,4-Pentadiene 1,2-Cyclononadiene 1,9-Decadiyne 9-Octylicosane 2-Cyclopenten-1-one E-p-Mentha-2,8-dienol (Z)-9-Octadecenamide Spiro[4.5]dec-6-ene Cis-Decahydro-1-naphthol 1,5-Dimethyltricyclo[3.3.0.0(2,6)]octane Glutaric acid,di(2,5-difluorobenzyl)ester 1H-Indene,5-butyl-6-hexyloctahydro1-Naphthoic Acid Methyl Ester Tổng Hàm lƣợng cấu tử (%) 320 oC 600 oC 4,17 16,64 6,42 0,44 0,75 0,32 0,.23 0,24 0,61 0,12 1,85 0,43 0,94 0,27 1,56 4,04 100 99,99 30 ngày 3,05 4,68 2,43 7,73 2,81 2,60 1,23 2,42 11,56 2,43 0,66 8,18 11,39 4,97 0,72 6,80 1,36 4,15 4,94 7,34 1,22 2,64 99,97 Bảng Thành phần tinh dầu cam bay nhiệt độ 600oC Hợp chất -Pinene Propene Ocimene (+)-Limonene p-xylene Cis-Carveol Carvone Citronellene Carhydrine Hexadenol Pentanal Octanal Decanal Dodecanal -Terpineol © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 10 ngày 0,45 0,55 61.64 4,54 5,46 3,67 0,34 - Hàm lƣợng cấu tử (%) 20 ngày 30 ngày 0,16 0,59 63,43 0,17 4,41 5,23 0,23 - 25,94 4,33 7,58 14,10 3,66 7,20 TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN Hợp chất 10 ngày 105 Hàm lƣợng cấu tử (%) 20 ngày 30 ngày -Cadinene 2,15 Heptacosane 2,06 Tricosane 2,61 Eicosane 6,81 Alloocimene 0,67 0,43 Limonene oxide 17,00 17,83 1,2-Pentadien 1,97 2,20 1,3-Pentadiene 3,68 1,9-Decadiyne 0,41 3,16 1,2-Dimethylenecyclobutane 0,17 1,2-Dimethyl-1,4-cyclohexadiene 0,15 2,5-Dihylcyclohexa-1,4-diene 0,18 2-Methyl-2vinyloxirane 0,39 Tricyclo[5.1.1.0(2,6)]none 0,76 Bicyclo[4.2.0]oct-7-ene 2,13 1,65 Hexacosanoic acid 1,84 9-Octylicosane 1,83 p-Mentha-3,8-diene 2,07 17-n-Hexadeyl Tetratriacontane 5,11 1,1’-Bicyclopentyl, 2-hexadecyl1,17 7,83 -Lioneic acid 2,2-dimethyl-1,3-dioxolan-4-ylmethyl ester Tổng 99,98 99,99 99,97 Tất bảng tổng hợp ta thấy thành phần D – Limonene Limonene Oxide chiếm phần trăm cao có tất bảng Từ rút kết luận D – Limonene thành phần tinh dầu Cam D – Limonene chất có khả chống lại oxy hóa mạnh mẽ, hoạt tính có khả ức chế phòng chống ung thƣ Thành phần Decyclicaldehyd tạo nên mùi thơm Dƣới ảnh hƣởng nhiệt độ, ánh sáng, khơng khí, độ ẩm, tinh dầu dễ bị oxi hóa biến thành Aldehyde, Aldehyde chuyển hóa thành Acid Chính lý ta nhận thấy bảng thành phần 20 30 ngày có xuất hợp chất nhóm chức Aldehyde Acid 3.2 Tỷ lệ yếu tố chất hoạt động bề mặt, tinh dầu nƣớc ảnh hƣởng đến kích thƣớc hạt nano nhũ tƣơng tinh dầu cam Tất mẫu thử nghiệm đƣợc rung siêu âm 10 phút tiếp tục đƣợc đánh máy khuấy 10 phút với tốc độ 1200 vòng/phút cuối rung siêu âm thêm 10 phút Bảng 3: Bảng kết khảo sát kích thước hạt nano nhũ tương tinh dầu cam 25 mL nước 25 mL nƣớc cất 0,5 1,0 1,5 Kích Kích Kích Tween/Span Ký hiệu Ký hiệu Ký hiệu thƣớc, thƣớc, thƣớc, mL:mL mẫu mẫu mẫu nm nm nm 0–1 A1 166,4 B1 179,2 C1 269,3 0,25 – 0,75 A2 302,0 B2 154,3 C2 361,1 0,5 – 0,5 A3 157,5 B3 123,2 C3 294,7 0,75 – 0,25 A4 116,3 B4 79,5 C4 143,9 1–0 A5 6996,9 B5 61,3 C5 855,2 Bảng cho ta thấy kích thƣớc trung bình hạt nhũ tƣơng điều kiện thể tích nƣớc 25 mL thể tích tinh dầu thay đổi lần lƣợt 0,5 mL; mL; 1,5 mL, tƣơng ứng với tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; 0,75 – 0,25; – Đối với khảo sát thể tích nƣớc 25 mL trình tổng hợp cho kết tốt thể tích tinh dầu mL kích thƣớc hạt giảm dần theo tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; Tinh dầu, mL © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh 106 TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 0,75 – 0,25; – Và tỷ lệ Tween tăng dần mẫu tích tinh dầu mL cho kích thƣớc nhỏ 61,3 nm Tuy nhiên nhìn chung kích thƣớc hạt mẫu có hệ chất hoạt động bề mặt cho kết nằm khoảng nano, ngoại trừ mẫu A5 C5 Nhƣ vậy, rút kết luận mẫu tích nƣớc 25 mL, thể tích chất nhũ hóa lớn thể tích tinh dầu tỉ lệ Tween/Span cho mẫu nano nhũ tƣơng có kích thƣớc tối ƣu; Khi thể tích chất nhũ hóa thể tích tinh dầu tỉ lệ vƣợt trội Tween so với Span cho mẫu nano nhũ tƣơng có kích thƣớc nhỏ hơn; Khi thể tích chất nhũ hóa nhỏ thể tích tinh dầu có mặt Span giúp q trình nhũ hóa diễn dễ dàng Hình 4: Phổ kích thước hạt mẫu nano nhũ tương tinh dầu Cam có kích thước giảm dần từ B1 – B5 © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 107 Hình 5: Mẫu nano tinh dầu tổng hợp Kết hình ảnh cho ta thấy kích thƣớc nano tn theo quy luật giảm dần điều kiện 25 mL nƣớc cất mL tinh dầu Cam (Hình 4, 5) Bảng 4: Bảng kết khảo sát kích thước hạt nano nhũ tương tinh dầu cam 50 mL nước 50 mL nƣớc cất 0,5 Tinh dầu, mL Tween/Span, mL:mL Ký hiệu mẫu 0–1 0,25 – 0,75 0,5 – 0,5 0,75 – 0,25 1–0 A6 A7 A8 A9 A10 Kích thƣớc, nm 106,0 195,4 125.9 1077,1 283,8 1,0 1,5 Kích thƣớc, nm Ký hiệu mẫu B6 B7 B8 B9 B10 78,4 94,7 85,4 106,1 66,2 Kích thƣớc, nm Ký hiệu mẫu C6 C7 C8 C9 C10 47,6 78,7 100,1 108,6 104,4 Bảng cho ta thấy kích thƣớc trung bình hạt nhũ tƣơng điều kiện thể tích nƣớc 50 mL thể tích tinh dầu thay đổi lần lƣợt 0,5 mL; mL; 1,5 mL, tƣơng ứng với tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; 0,75 – 0,25; – Đối với khảo sát thể tích nƣớc 50 mL trình tổng hợp cho kết tốt thể tích tinh dầu mL 1,5 mL theo tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; 0,75 – 0,25; – thể tích tinh dầu 1,5 mL cho kích thƣớc hạt có xu hƣớng tăng dần, cịn thể tích tinh dầu mL không cho quy luật thay đổi rõ ràng Và tỷ lệ Tween tăng dần mẫu tích tinh dầu mL cho kích thƣớc lớn 108,6 nm Tuy nhiên nhìn chung kích thƣớc hạt mẫu có cho kết nằm khoảng nano kích thƣớc hạt nhỏ 47,6 nm Bảng 5: Bảng kết khảo sát kích thước hạt nano nhũ tương tinh dầu cam 75 mL nước 75 mL nƣớc cất Tinh dầu, mL 0,5 Tween/Span, mL:mL Ký hiệu mẫu 0,25 – 0,75 0,5 – 0,5 0,75 – 0,25 1–0 A12 A13 A14 A15 1,0 Kích thƣớc, nm 481,5 736,5 5222 1809,0 Ký hiệu mẫu B12 B13 B14 B15 1,5 Kích thƣớc, nm 249,7 258,5 184,6 246,0 Ký hiệu mẫu C12 C13 C14 C15 Kích thƣớc, nm 306,8 159,6 100,6 - © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 108 Bảng cho ta thấy kích thƣớc trung bình hạt nhũ tƣơng điều kiện thể tích nƣớc 50 mL thể tích tinh dầu thay đổi lần lƣợt 0,5 mL; mL; 1,5 mL, tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; 0,75 – 0,25; – Đối với khảo sát thể tích nƣớc 75 mL q trình tổng hợp cho kết tốt thể tích tinh dầu mL 1,5 mL (Hình 6) Theo tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween tăng dần thể tích tinh dầu 1,5 mL cho kích thƣớc hạt có xu hƣớng giảm dần, cịn thể tích tinh dầu mL kích thƣớc hạt có xu hƣớng giảm dần nhƣng có khác hai điểm cuối lại theo hƣớng tăng Mẫu C15 có kích thƣớc trung bình hạt nằm ngồi giới hạn đo máy Hình 6: Phổ kích thước hạt mẫu nano nhũ tương tinh dầu Cam có kích thước giảm dần từ C11 – C14 Bảng 6: Bảng kết khảo sát kích thước hạt nano nhũ tương tinh dầu cam 100 mL nước 100 mL nƣớc cất Tinh dầu, mL 0,5 1,0 1,5 Tween/Span, mL:mL Ký hiệu mẫu 0,25 – 0,75 0,5 – 0,5 0,75 – 0,25 1–0 A17 A18 A19 A20 Kích thƣớc, nm 266,7 179,2 660,0 5865,3 Ký hiệu mẫu B17 B18 B19 B20 Kích thƣớc, nm 301,5 28,4 1416.4 6812,1 Ký hiệu mẫu C17 C18 C19 C20 Kích thƣớc, nm 311,5 260,5 129,8 131,1 Bảng cho ta thấy kích thƣớc trung bình hạt nhũ tƣơng điều kiện thể tích nƣớc 100 mL thể tích tinh dầu thay đổi lần lƣợt 0,5 mL; mL; 1,5 mL, tỷ lệ chất hoạt động bề mặt © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 109 Tween/Span thay đổi từ – 1; 0,25 – 0,75; 0,5 – 0,5; 0,75 – 0,25; – Với khảo sát thể tích nƣớc 100 mL trình tổng hợp cho kết tốt thể tích tinh dầu 1,5 mL theo tỷ lệ chất hoạt động bề mặt Tween tăng dần thể tích tinh dầu 1,5 mL cho kích thƣớc hạt có xu hƣớng giảm dần Tại thể tích tinh dầu 0,5 mL mL thu đƣợc mẫu nano nhũ tƣơng có kích thƣớc hạt nano nhỏ nhất, tƣơng ứng 179,2 28,4 nm (mẫu A18 B18) 3.3 Sự ảnh hƣởng thời gian khuấy học đến kích thƣớc nano nhũ tƣơng tinh dầu cam Khảo sát tìm mẫu cho kích thƣớc nano tối ƣu mẫu B18 có kích thƣớc 28,4 nm điều kiện 100 mL nƣớc cất, tỷ lệ Tween/Span 0,5 – 0,5 1,5 mL tinh dầu Cam phƣơng pháp rung siêu âm kết hợp khuấy học 10 phút với tốc độ 1200 vịng/phút Thí nghiệm khảo sát ảnh hƣởng thời gian khuấy lần lƣợt phút, 15 phút, 20 phút 25 phút đến kích thƣớc nano nhũ tƣơng tinh dầu cam 318.2 350 Kích thƣớc (nm) 300 250 176.9 200 167.7 155.1 150 100 28.4 50 0 200 400 600 800 1000 1200 1400 1600 Thời gian (s) Hình 7: Kết khảo sát ảnh hưởng thời gian khuấy học lên kích thước hạt Kết khảo sát cho thấy thời gian 10 phút (600s) khoảng thời gian tối ưu cho mẫu nano nhũ tương tinh dầu cam với kích thước hạt trung bình 28,4 nm Tốc độ khuấy (vòng/phút) 3.4 Sự ảnh hƣởng tốc độ khuấy đến kích thƣớc nano nhũ tƣơng tinh dầu cam Khảo sát ảnh hƣởng tốc độ khuấy đến kích thƣớc nano nhũ tƣơng tinh dầu cam đƣợc thực mẫu B18 điều kiện 100 mL nƣớc cất, tỷ lệ Tween/Span 0,5 – 0,5 1,5 mL tinh dầu Cam ta với tốc độ khuấy lần lƣợt 1000 vòng/phút, 1200 vòng/phút, 1400 vòng/phút, 1600 vòng/phút, 1800 vòng/phút 10 phút 900 800 700 600 500 400 300 200 100 798.8 176.1 128.4 129.7 28.4 900 1100 1300 1500 1700 1900 Kích thƣớc (nm) Hình 8: Kết khảo sát tốc độ khuấy © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 110 Kết khảo sát cho thấy tốc độ khuấy 1200 vòng/phút tốc độ khuấy tối ưu cho mẫu nano nhũ tương tinh dầu cam với kích thước hạt trung bình 28,4 nm 3.5 Kết khảo sát kết hợp nano nhũ tƣơng tinh dầu cam nano bạc 50ppm Nano nhũ tƣơng tinh dầu cam kết hợp với nano Bạc đƣợc tổng hợp theo quy trình mục 2.4 Kết DLS mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam kết hợp nano Bạc đƣợc biễu diễn Bảng hình Bảng Kết DLS mẫu nano nhũ tương tinh dầu cam kết hợp nano bạc NB: nano bạc Mẫu Tween 80 (mL) Tinh dầu cam (mL) Dung dịch nano bạc 100ppm (mL) H2O (mL) D1 D2 D3 D4 D5 D6 0,75 1,5 2,25 3,75 4,5 0,5 1,5 2,5 25 25 25 25 25 25 23,75 22,5 21,25 20 18,75 17,5 - - 25 D1 - 135,5nm D2 – 69,3nm D3 – 60,4nm D4 – 58,3nm D5 – 42,9nm D6 – 115,8nm 25 DLS mẫu nano nhũ tương tinh dầu cam kết hợp nano bạc © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh Kích thƣớc hạt (nm) 135,5 69,3 60,4 58,3 42,9 115,8 42,7 TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 111 Kết DLS cho thấy phƣơng pháp nhũ tƣơng hóa tinh dầu cam kết hợp với nano bạc tổng hợp đƣợc hệ nano nhũ tƣơng có kích thƣớc hạt nằm khoảng từ 42 – 136 nm Từ kết đo DLS ta thấy kích thƣớc hạt mẫu từ D1 đến D5 giảm dần, D5 mẫu có kích thƣớc hạt nhỏ (42,9 nm) tới D6 kích thƣớc hạt lại tăng (Hình 9) Nhƣ kết luận với thể tích tinh dầu 2,5mL chất ổn định Tween đƣợc nhũ hóa tốt 50mL dung dịch nano bạc để tổng hợp dung dịch nano nhũ tƣơng kết hợp nano bạc 3.6 Phân tích khả kháng khuẩn nano nhũ tƣơng tinh dầu cam kết hợp với nano bạc Các mẫu thử nghiệm P1, P2, P3, P4, P5, P6 mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam với hàm lƣợng tinh dầu cam khác nhau, mẫu D1, D2, D3, D4, D5, D6 mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam kết hợp với nano bạc 50 ppm, mẫu TDC mẫu tinh dầu cam nguyên chất, mẫu NB mẫu Nano bạc 50ppm Ở thí nghiệm này, vi khuẩn Escherichia coli (E.coli) đƣợc sử dụng để khảo sát khả kháng khuẩn mẫu phƣơng pháp khuếch tán giếng đĩa thạch với mẫu kháng sinh đối chứng ampicillin Bảng Mẫu thử nghiệm kháng khuẩn DLS (nm) Thành phần, mL Mẫu Tinh dầu cam H2O - Nano bạc 100ppm - - P1 0,5 50 - - P2 P3 1,5 50 50 - - P4 50 - - P5 2,5 50 - - P6 50 - - NB - 25 25 42,7 D1 0,5 23,75 25 135,5 D2 22,5 25 69,3 D3 D4 D5 D6 1,5 2,5 21,25 20 18,75 17,5 25 25 25 25 60,4 58,3 42,9 115,8 Hình 10: Đĩa thử nghiệm kháng khuẩn E.coli Ở đĩa vi khuẩn E.coli, mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam kết hợp nano bạc có vịng kháng khuẩn gần nhƣ nhau, lớn so với mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam khơng có hỗ trợ © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 112 hạt nano bạc (Hình 10) Các mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam có khả kháng vi khuẩn E.coli, nhiên, đƣờng kính vịng kháng khuẩn nhỏ tăng hàm lƣợng tinh dầu lên (giữ im nồng độ nano bạc) đƣờng kính vịng kháng khuẩn hầu nhƣ khơng thay đổi Nhƣ vậy, ta kết luận rằng, nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam có khả kháng khuẩn thấp tính kháng khuẩn đƣợc cải thiện rõ rệt có thêm hỗ trợ nano bạc KẾT LUẬN Các hạt nano nhũ tƣơng từ tinh dầu vỏ cam kết hợp với nano bạc đƣợc tổng hợp thành công phƣơng pháp rung siêu âm đƣợc hỗ trợ khuấy học, sử dụng Tween 80 Span 80 nhƣ chất nhũ hóa hiệu Các mẫu nhũ tƣơng hầu hết có kích thƣớc nano với đƣờng kính động học khoảng 60 – 120 nm Kết nghiên cứu rằng, yếu tố kỹ thuật nhƣ tỉ lệ dầu/nƣớc, tỉ lệ chất nhũ hóa, tốc độ khuấy thời gian khuấy có ảnh hƣởng rõ rệt lên kích thƣớc hạt trung bình So với mẫu nhũ tƣơng từ tinh dầu vỏ cam, mẫu nano nhũ tƣơng kết hợp với nano bạc thể tính kháng khuẩn E.coli vƣợt trội Kết nghiên cứu cho thấy nano nhũ tƣơng từ tinh dầu vỏ cam sành kết hợp với nano bạc trở thành vật liệu triển vọng ứng dụng lĩnh vực thực phẩm, mỹ phẩm kháng khuẩn LỜI CẢM ƠN Cơng trình đƣợc hỗ trợ tài đề tài nghiên cứu khoa học mã số 184.HH05 trƣờng Đại học Cơng Nghiệp Thành Phố Hồ Chí Minh tài trợ theo hợp đồng số 39/HĐ-ĐHCN TÀI LIỆU THAM KHẢO [1] D Amaral and K Bhargava, Essential oil nanoemulsions and food applications, Adv Food Technol Nutr Sci Open J., vol 1, pp 84-87, 2015 [2] P Anand, V Vellingiri, R Durairajan and N Paramasivam, Antibacterial and antibiofilm activities of linalool nanoemulsions against Salmonella Typhimurium, Food Bioscience, vol 28, pp 57-65, 2019 [3] D S Hélder, P Joana, A C Pinheiro, F Donsì, A T Serra, C M M Duarte, G Ferrari, M A Cerqueira and A.A Vicente, Evaluating the behaviour of curcumin nanoemulsions and multilayer nanoemulsions during dynamic in vitro digestion, Journal of Functional Foods, vol 48, pp 605-613, 2018 [4] H B Eral Gupta, T A Hatton and P Doyle, Nanoemulsions: Formation, Properties And Applications, Soft Matter, vol 11, pp 1-17, 2016 [5] M.M Ahmad, Salim - ur - Rehman, F.M Anjum and E.E Bajwa, Comparative Physical Examination Of Various Citrus Peel Essential Oils, International Journal of Agriculture and Biology, vol 8, pp 186-190, 2006 [6] Y Li, C Wu, T Wu, L Wang, S Chen, T Ding and Y Hu, Preparation and characterization of citrus essential oils loaded in chitosan microcapsules by using different emulsifiers, Journal of Food Engineering, vol 217, pp 108-114, 2018 [7] Z Lou, J Chen, F Yu, H Wang, X Kou, C Ma and S Zhu, The Antioxidant, Antibacterial, Antibiofilm Activity Of Essential Oil From Citrus Medica L Var Sarcodactylis and Its Nanoemulsion, LWT - Food Science and Technology, vol 80, pp 371-377, 2017 [8] H V Mojdeh, R Hassan, A Aliahmadi and A Ardalan, Chapter 13 – Nanoemulsions: A Novel Antimicrobial Delivery System, Editor(s): Alexandru Mihai Grumezescu, Nano- and Microscale Drug Delivery Systems Elsevier, 2017 [9] O C Aneta and S H Beata, Chapter - The Use of Nanotechnology in Modern Pharmacotherapy, Editor(s): Alexandru Mihai Grumezescu, Multifunctional Systems for Combined Delivery, Biosensing Elsevier, 2017 [10] D S Bernardi, T A Pereira, N R Maciel, J Bortoloto, G S Viera, G C Oliveira and P A Rocha-Filho, Formation and stability of oil-in-water nanoemulsions containing rice bran oil: in vitro and in vivo assessments, J Nanobiotechnology (2011) 1-9 © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 113 [11] S A Chime, F C Kenechukwu and A.A Attama, Application of Nanotechnology in Drug Delivery IntechOpen, 2014 [12] H S Mohammad, M Hosseini, M Jahanshahi, R L Meyer and G N Darzi, Clove oil nanoemulsion as an effective antibacterial agent: Taguchi optimization method, Desalination and Water Treatment, vol 57, pp 18379-18390, 2016 [13] S Zhang, M Zhang, Z Fang and Y Liu, Preparation and characterization of blended cloves/cinnamon essential oil nanoemulsions, LWT - Food Science and Technology, vol.75, pp 1-7, 2016 14 T Mehmood, A Ahmad, A Ahmed, and Z Ahmed, Optimization of olive oil based O/W nanoemulsions prepared through ultrasonic homogenization: A response surface methodology approach, Food Chemistry, 229 (2017) 790-796 [15] B Amrutha, K Sundar, and P H Shetty, Spice oil nanoemulsions: Potential natural inhibitors against pathogenic E coli and Salmonella spp from fresh fruits and vegetables, Lebensmittel-Wissenschaft Technologie, vol 79, pp 152-159, 2017 [16] Y Li, C Wu, T Wu, L Wang, S Chen, T Ding and Y Hu, Preparation and characterization of citrus essential oils loaded in chitosan microcapsules by using different emulsifiers, Journal of Food Engineering, vol 217, pp.108-114, 2018 [17] S.P Deshmukh, S.M Patil, S.B Mullani and S.D Delekar, Silver nanoparticles as an effective disinfectant: A review, Materials Science and Engineering: C, vol 97, pp 954-965, 2019 [18] P H Li and B H Chiang, Process optimization and stability of D-limonene-inwater nanoemulsions prepared by ultrasonic emulsification using response surface methodology, Ultrasonics Sonochemistry, vol 19, pp 192-197, 2012 [19] S Kentish, T J Wooster, M Ashokkumar, S Balachandran, R Mawson and L Simons, The use of ultrasonics for nanoemulsion preparation, Innovative Food Science & Emerging Technologies, vol 9, pp 170-175, 2008 Ngày nhận bài: 02/07/2019 Ngày chấp nhận đăng: 01/10/2019 © 2019 Trƣờng Đại học Cơng nghiệp thành phố Hồ Chí Minh ... trình tổng hợp nano nhũ tương tinh dầu cam 2.4 Tổng hợp nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam kết hợp nano bạc Nano nhũ tƣơng từ tinh dầu cam kết hợp nano bạc đƣợc tổng hợp theo quy trình hình Tinh dầu cam. ..TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 101 liệu thực phẩm, mỹ phẩm dƣợc liệu y học, đặc biệt tinh dầu Tinh dầu cam đƣợc chiết xuất từ hoa vỏ quả, vỏ. .. phố Hồ Chí Minh TỔNG HỢP NANO NHŨ TƢƠNG TỪ TINH DẦU VỎ CAM SÀNH ỨNG DỤNG LÀM VẬT LIỆU KHÁNG KHUẨN 112 hạt nano bạc (Hình 10) Các mẫu nano nhũ tƣơng tinh dầu cam có khả kháng vi khuẩn E.coli, nhiên,