Mục tiêu nghiên cứu của Luận án nhằm xác định đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T ở bệnh nhân thay van tim cơ học. Xác định mối liên quan giữa đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng và đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol ở bệnh nhân thay van tim cơ học. Mời các bạn cùng tham khảo!
BỘ GIÁO DỤC VÀ ĐÀO TẠO BỘ Y TẾ TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI PHẠM THỊ THÙY NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C9, VKORC1 VÀ LIỀU THUỐC CHỐNG ĐÔNG KHÁNG VITAMIN K Ở BỆNH NHÂN THAY VAN TIM CƠ HỌC Chuyên ngành : Hoá sinh y học Mã số : 62720112 LUẬN ÁN TIẾN SĨ Y HỌC Người hướng dẫn khoa học: GS.TS TẠ THÀNH VĂN PGS.TS PHẠM TRUNG KIÊN HÀ NỘI - 2020 LỜI CẢM ƠN Để hồn thành luận án này, trước hết, tơi xin bày tỏ lòng tri ân sâu sắc tới GS TS Tạ Thành Văn, Chủ tịch Hội đồng Trường, Nguyên Hiệu trưởng, Trưởng Bộ mơn Hóa sinh Trường Đại học Y Hà Nội PGS TS Phạm Trung Kiên, Phó chủ nhiệm khoa Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, người thầy tận tụy giúp đỡ, động viên hướng dẫn tơi q trình học tập, nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu, Phòng Đào tạo Sau Đại Học, tồn thể q thầy cơ, cán Bộ mơn Hóa Sinh, Trường Đại học Y Hà Nội tạo điều kiện giúp đỡ trình thực luận án Tơi xin bày tỏ lòng biết ơn chân thành đến Ban Giám hiệu, quý thầy cô, cán Bộ môn Y Dược học sở, Trường Đại học Y Dược, Đại học Quốc Gia Hà Nội, tạo điều kiện thuận lợi cho tơi q trình học tập nghiên cứu Tơi xin bày tỏ lịng biết ơn đến Ban Giám đốc, Phịng kế hoạch tổng hợp tồn thể bác sỹ, điều dưỡng kỹ thuật viên Khoa Xét nghiệm, Khoa Khám bệnh, Bệnh viện Tim Hà Nội giúp đỡ tơi q trình thực luận án Tôi xin trân trọng cảm ơn bệnh nhân gia đình họ, người đóng góp lớn cho thành công luận án Tôi xin bày tỏ lòng biết ơn sâu sắc đến Ban Giám hiệu, Trường Đại học Y Dược Thái Nguyên, toàn thể quý thầy cô, bạn bè, đồng nghiệp giúp đỡ tơi q trình học tập, nghiên cứu thực luận án Cuối cùng, xin ghi nhớ cơng ơn sinh thành, ni dưỡng tình u thương bố mẹ ủng hộ, động viên chồng, hai anh chị em gia đình, người ln bên tơi, chỗ dựa vững để yên tâm học tập hoàn thành luận án Hà Nội, Ngày tháng năm 2020 Phạm Thị Thùy LỜI CAM ĐOAN Tôi Phạm Thị Thùy, nghiên cứu sinh khóa 35 Trường Đại học Y Hà Nội, chuyên ngành Hóa Sinh Y Học, xin cam đoan: Đây luận án thân trực tiếp thực hướng dẫn Thầy Tạ Thành Văn Thầy Phạm Trung Kiên Công trình khơng trùng lặp với nghiên cứu khác công bố Việt Nam Các số liệu thông tin nghiên cứu hồn tồn xác, trung thực khách quan, xác nhận chấp thuận sở nơi nghiên cứu Tơi xin hồn tồn chịu trách nhiệm trước pháp luật cam kết Hà Nội, ngày tháng năm 2020 Người viết cam đoan Phạm Thị Thùy CHỮ VIẾT TẮT Từ viết tắt Từ gốc tiếng Anh ACC/AHA American College of Cardiology/American Heart Association BMI Body Mass Index Bp Base pair CYP2C9 Cytochrome P450 2C9 DNA Deoxyribonucleic acid EF HMWK Hight molecular weigh kininogen IDI & International Diabetes Institute WPRO & Regional Office for the Western Pacific I359L Isoleucine359Leucine INR ISI PCR PTA PT R144C RNA TTR VKA TM TF UTR VKORC1 Nghĩa tiếng Việt Hội Tim mạch học Hoa Kỳ Hiệp hội Tim mạch Hoa Kỳ Chỉ số khối thể Cặp bazơ Axít deoxyribonucleic Chức tâm thu thất trái Kininogen phân tử lượng cao Hiệp hội đái đường nước châu Á Đa hình ba mã hố 359, mã hố Isoleucine Leucine International Normalized Ratio Chỉ số chuẩn hóa quốc tế International Sensitivity Index Độ nhạy lô thromboplastin dùng so với thromboplastin chuẩn Tổ chức Y tế Thế giới Polymerase Chain Reaction Phản ứng chuỗi khuếch đại gen Plasma- thromboplastin antecedent Tiền chất thromboplastin huyết tương Prothrombin time Thời gian prothrombin Arginin144Cystein Đa hình ba mã hoá 144, mã hoá Arginin Cystein Ribonucleic acid Axit ribonucleic Time in Therapeutic Range Thời gian khoảng điều trị Vitamin K antagonists Thuốc chống đông kháng vitamin K Transmembrane helices Vòng xoắn xuyên màng Yếu tổ tổ chức Untranslated region Vùng không dịch mã Vitamin K epoxide reductase complex subunit MỤC LỤC ĐẶT VẤN ĐỀ CHƯƠNG TỔNG QUAN 1.1 Tổng quan thay van tim học 1.1.1 Bệnh lý van tim 1.1.2 Phẫu thuật thay van tim học 1.2 Huyết khối bệnh nhân sau thay van tim học .5 1.2.1 Sinh lý q trình đơng cầm máu 1.2.2 Cơ chế hình thành huyết khối bệnh nhân sau thay van tim học 10 1.2.3 Điều trị phòng ngừa huyết khối bệnh nhân sau thay van tim học 12 1.3 Tổng quan thuốc chống đông acenocoumarol 14 1.3.1 Dược lý chế tác dụng 14 1.3.2 Chỉ định chống định 16 1.3.3 Điều trị thuốc acenocoumarol bệnh nhân sau thay van tim học 17 1.3.4 Các yếu tố tương tác với thuốc acenocoumarol 20 1.4 Tổng quan gen CYP2C9 VKORC1 .21 1.4.1 Đa hình đơn nucleotid 21 1.4.2 Tổng quan gen CYP2C9 mối liên quan với liều thuốc acenocoumarol 23 1.4.3 Gen VKORC1 mối liên quan với liều thuốc acenocoumarol 31 1.5 Tình hình nghiên cứu giới 37 CHƯƠNG ĐỐI TƯỢNG VÀ PHƯƠNG PHÁP NGHIÊN CỨU 40 2.1 Đối tượng nghiên cứu .40 2.1.1 Tiêu chuẩn lựa chọn bệnh nhân 40 2.1.2 Tiêu chuẩn loại trừ 40 2.2 Phương pháp nghiên cứu 40 2.2.1 Cỡ mẫu nghiên cứu 40 2.2.2 Các số, biến số nghiên cứu 41 2.2.3 Hóa chất trang thiết bị nghiên cứu 43 2.2.4 Sơ đồ thiết kế nghiên cứu 45 2.3 Thời gian địa điểm nghiên cứu 49 2.3.1 Địa điểm nghiên cứu 49 2.3.2 Thời gian nghiên cứu 49 2.4 Xử lý số liệu 49 2.5 Các loại sai số cách khắc phục 49 2.5.1 Sai số mắc phải 49 2.5.2 Cách khắc phục sai số 50 2.6 Vấn đề đạo đức nghiên cứu y sinh .50 CHƯƠNG KẾT QUẢ NGHIÊN CỨU 51 3.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T bệnh nhân thay van tim học 51 3.1.1 Một số đặc điểm lâm sàng nhóm nghiên cứu 51 3.1.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 57 3.1.3 Tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A 1173C>T nhóm nghiên cứu 60 3.2 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol bệnh nhân thay van tim học 69 3.2.1 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng với liều thuốc acenocoumarol 69 3.2.2 Mối liên quan đặc điểm cận lâm sàng với liều thuốc acenocoumarol 75 3.2.3 Mối liên quan kiểu gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol 77 3.2.4 Phân tích hồi quy tuyến tính yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 81 CHƯƠNG BÀN LUẬN 87 4.1 Đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T bệnh nhân thay van tim học 87 4.1.1 Một số đặc điểm lâm sàng nhóm nghiên cứu 87 4.1.2 Một số đặc điểm cận lâm sàng nhóm nghiên cứu 96 4.1.3 Tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A 1173C>T nhóm nghiên cứu 97 4.2 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A, 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol bệnh nhân thay van tim học 102 4.2.1 Mối liên quan đặc điểm lâm sàng với liều thuốc acenocoumarol 102 4.2.2 Mối liên quan đặc điểm cận lâm sàng với liều thuốc acenocoumarol 107 4.2.3 Mối liên quan kiểu gen CYP2C9*3, VKORC1-1639G>A 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol 108 4.2.4 Phân tích hồi quy tuyến tính yếu tố ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 112 KẾT LUẬN 120 KIẾN NGHỊ 123 DANH MỤC CÁC CƠNG TRÌNH CƠNG BỐ LIÊN QUAN ĐẾN LUẬN ÁN TÀI LIỆU THAM KHẢO PHỤ LỤC DANH MỤC BẢNG Bảng 1.1 Một số loại thuốc chống đông kháng Vitamin K 13 Bảng 1.2 Một số đa hình đơn nucleotid gen CYP2C9 27 Bảng 1.3 Tần số xuất đa hình gen CYP2C9 số chủng tộc giới 28 Bảng 1.4 Tần số xuất biến thể di truyền gen VKORC1 1639G>A 1173C>T số quốc gia 34 Bảng 2.1 Trình tự mồi khuếch đại đoạn gen chứa alen 47 Bảng 3.1 Đặc điểm tuổi giới nhóm nghiên cứu 51 Bảng 3.2 Đặc điểm số BMI nhóm nghiên cứu 52 Bảng 3.3 Một số yếu tố nguy cơ, nguyên nhân vị trí thay van tim nhóm nghiên cứu 53 Bảng 3.4 Đặc điểm thời gian sau thay van học 54 Bảng 3.5 Đặc điểm tiền sử biến chứng xuất huyết 54 Bảng 3.6 Đặc điểm tiền sử huyết khối nhóm nghiên cứu 55 Bảng 3.7 Một số thuốc dùng phối hợp nhóm nghiên cứu 56 Bảng 3.8 Một số số xét nghiệm hóa sinh nhóm nghiên cứu 57 Bảng 3.9 Một số số huyết học nhóm nghiên cứu 58 Bảng 3.10 Một số số đông máu nhóm nghiên cứu 58 Bảng 3.11 Đặc điểm điện tim siêu âm tim nhóm nghiên cứu 59 Bảng 3.12 Tần số alen kiểu gen CYP2C9*3 nhóm nghiên cứu 62 Bảng 3.13 Tần số alen kiểu gen VKORC1-1639G>A 64 Bảng 3.14 Tần số alen kiểu gen VKORC1 1173C>T nhóm nghiên cứu 67 Bảng 3.15 Mối liên quan tuổi với liều thuốc acenocoumarol 69 Bảng 3.16 Mối liên quan giới với liều thuốc acenocoumarol 70 Bảng 3.17 Mối liên quan số BMI với liều thuốc acenocoumarol 70 Bảng 3.18 Mối liên quan số yếu tố nguy với liều thuốc acenocoumarol 71 Bảng 3.19 Mối liên quan nguyên nhân thay van tim với liều thuốc acenocoumarol 72 Bảng 3.20 Mối liên quan vị trí thay van tim với liều thuốc acenocoumarol 72 Bảng 3.21 Mối liên quan thời gian sau thay van với liều thuốc acenocoumarol 73 Bảng 3.22 Mối liên quan số loại thuốc dùng phối hợp với acenocoumarol 74 Bảng 3.23 Mối liên quan đặc điểm điện tim với liều thuốc acenocoumarol 75 Bảng 3.24 Mối liên quan số đặc điểm siêu âm tim với liều thuốc acenocoumarol 76 Bảng 3.25 Mối liên quan kiểu gen CYP2C9*3 với liều thuốc acenocoumarol 77 Bảng 3.26 Mối liên quan kiểu gen phối hợp VKORC1-1639G>A 1173C>T với liều thuốc acenocoumarol 80 Bảng 3.27 Phân tích hồi quy đơn biến đa biến số nhân trắc ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 81 Bảng 3.28 Phân tích hồi quy đơn biến đa biến yếu tố di truyền ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 82 Bảng 3.29 Phân tích hồi quy đa biến yếu tố lâm sàng, cận lâm sàng di truyền ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 83 Bảng 3.30 Phân tích hồi quy đa biến số nhân trắc di truyền ảnh hưởng đến liều thuốc acenocoumarol 85 Bảng 4.1 Tần số alen kiểu gen CYP2C9*3 số quốc gia giới 98 Bảng 4.2 Tần số alen kiểu gen VKORC1-1639G>A số quốc gia/dân tộc giới 100 Bảng 4.3 Tần số alen kiểu gen VKORC1 1173C>T số quốc gia giới 101 DANH MỤC HÌNH Hình 1.1 Sơ đồ đơng máu theo mơ hình dịng thác đơng máu Hình 1.2 Sơ đồ hình thành fibrin Hình 1.3 Sơ đồ trình tiêu fibrin Hình 1.4 Cơ chế hình thành huyết khối van học 11 Hình 1.5 Hình ảnh huyết khối van học 12 Hình 1.6 Hình ảnh cấu trúc thuốc acenocoumarol 14 Hình 1.7 Cơ chế tác dụng thuốc acenocoumarol 15 Hình 1.8 Hình ảnh SNP 22 Hình 1.9 Hình ảnh cấu trúc gen CYP2C9 23 Hình 1.10 Hình ảnh mơ cấu trúc bậc enzym CYP2C9 24 Hình 1.11 Hình ảnh cấu trúc enzym CY2C9 25 Hình 1.12 Hình ảnh vị trí liên kết thuốc chống đông enzym CYP2C9 26 Hình 1.13 Phân bố kiểu gen CYP2C9 số dân số châu Á 29 Hình 1.14 Chuyển hóa thuốc acenocoumarol 30 Hình 1.15 Hình ảnh cấu trúc gen VKORC1 32 Hình 1.16 Hình ảnh cấu trúc enzym Vitamin K epoxide reductase complex subunit 33 Hình 1.17 Ảnh hưởng đa hình gen VKORC1 CYP2C9 lên liều thuốc aenocoumarol 35 Hình 3.1 Hình ảnh điện di sản phẩm phản ứng khuếch đại đoạn gen chứa SNP CYP2C9*3 60 Hình 3.2 Hình ảnh giải trình tự giải trình exon xác định SNP CYP2C9*3 gen CYP2C9 61 143 Shendre A., Dillon C., and Limdi N.A (2018) Pharmacogenetics of warfarin dosing in patients of African and European ancestry Pharmacogenomics, 19(17), 1357–1371 144 Johnson J.A, Gong L, Whirl-Carrillo M et al (2011) Clinical Pharmacogenetics Implementation Consortium Guidelines for CYP2C9 and VKORC1 genotypes and warfarin dosing Clinical Pharmacology & Therapeutics, 90(4), 625–629 145 Warfarin product labeling (2011) Food and Drug Administration, 1-36 146 Kaye J.B, Schultz L.E, Steiner H.E et al (2017) Warfarin Pharmacogenomics in Diverse Populations Pharmacotherapy, 37(9), 1150–1163 147 Gage B.F, Eby C, Johnson J.A et al (2008) Use of pharmacogenetic and clinical factors to predict the therapeutic dose of warfarin Clinical Pharmacology & Therapeutics, 84(3), 326–331 148 Klein T.E, Altman R.B et al (2009) Estimation of the warfarin dose with clinical and pharmacogenetic data New England Journal of Medicine, 360(8), 753–764 149 Minoli A Perera, Larisa H Cavallari, Nita A Limdi et al (2013) Genetic variants associated with warfarin dose in African-American individuals: a genome-wide association study The Lancet, 790-796 150 Perera M, Gamazon E, Cavallari L et al (2011) The Missing Association: Sequencing-Based Discovery of Novel SNPs in VKORC1 and CYP2C9 That Affect Warfarin Dose in African Americans Clinical Pharmacology & Therapeutics, 89(3), 408–415 151 Jinhua Zhang, Tingting Wu, Wenjun Chen et al (2020) Effect of GeneBased Warfarin Dosing on Anticoagulation Control and Clinical Events in a Real-World Setting Frontiers in Pharmacology, 1527 (10), 152 Jahanzeb Malik, Uzma Ishaq, Nismat Javed et al (2020) Genetic Warfarin-Resistance Resulting in Surgery to Change a Prosthetic Valve European Journal of Case Reports in Internal Medicine * Phụ lục BỆNH ÁN NGHIÊN CỨU TRƯỜNG ĐẠI HỌC Y HÀ NỘI NGHIÊN CỨU TÍNH ĐA HÌNH GEN CYP2C9, VKORC1 VÀ ĐÁP ỨNG THUỐC CHỐNG ĐÔNG KHÁNG VITAMIN K Ở BỆNH NHÂN THAY VAN TIM CƠ HỌC BỘ CÂU HỎI PHỎNG VẤN Mã số phiếu: Nơi tiếp cận bệnh nhân: Bệnh viện Tim Hà Nội Họ tên đối tượng vấn: Địa chỉ: Điện thoại: Mã số bệnh án: Thỏa thuận nghiên cứu Tôi là: Phạm Thị Thùy, nghiên cứu viên đề tài trường Đại học Y Hà Nội chủ trì Hiện tơi muốn tìm hiểu đặc điểm di truyền mối liên quan với chuyển hóa thuốc chống đơng kháng vitamin K bệnh nhân sau thay van tim học Do xin phép hỏi ý kiến anh/chị số vấn đề liên quan đến sức khỏe anh/chị Sự tham gia anh/chị khảo sát hoàn toàn tự nguyện Chúng đảm bảo thông tin anh/chị cung cấp phục vụ cho mục đích nghiên cứu Đồng thời thơng tin cá nhân anh/chị hồn tồn giữ bí mật Cuộc vấn kéo dài khoảng 10 phút, anh/chị từ chối trả lời câu hỏi mà anh/chị không muốn q trình vấn Sau vấn chúng tơi tiến hành lấy 2ml máu anh/chị để phục vụ đề tài nghiên cứu Anh/chị có đồng ý tham gia nghiên cứu khơng? 1-có / 2- khơng Chữ ký người vấn: Chữ ký điều tra viên: I HÀNH CHÍNH Họ tên BN: Tuổi: Giới: Chiều cao: Cân nặng: BMI: Huyết áp: II TIỀN SỬ: Nguyên nhân thay van tim: Viêm nội tâm mạc nhiễm khuẩn Có Khơng Thấp tim Có Khơng Thối hóa van Có Khơng Van hai Có Khơng Van động mạch chủ Có Khơng Van kép Có Khơng Khác Vị trí thay van: Thời gian phẫu thuật: Dùng thuốc kháng đông trước phẫu thuật (Loại thuốc liều thuốc): Thời gian dùng thuốc kháng đông trước phẫu thuật: Cận lâm sàng trước phẫu thuật a Sinh hóa máu Glucose Ure Cre Choles Tri HDL-C LDL-C ALT AST GGT CK CKMB Troponin T Tiền sử hút thuốc: Có Khơng Tiền sử uống rượu: Có Khơng Tiền sử điều trị xuất huyết: Số lần: Mức độ: Nhẹ Vừa Nặng Xuất huyết da Có Khơng Xuất huyết niêm mạc Có Khơng Đi tiểu có máu Có Khơng Chảy máu chân Có Khơng Chảy máu cam Có Khơng Tắc mạch chi Có Khơng Tắc mạch não Có Khơng Kẹt van Có Khơng Vị trí khác 10 Tiền sử điều trị huyết khối: Khác: Số lần: III LÂM SÀNG HIỆN TẠI: Triệu chứng xuất huyết: Nhẹ Vừa Nặng Xuất huyết da Có Khơng Xuất huyết niêm mạc Có Khơng Đi tiểu có máu Có Khơng Chảy máu chân Có Khơng Chảy máu cam Có Khơng Tắc mạch chi Có Khơng Tắc mạch não Có Khơng Kẹt van Có Khơng Mức độ: Khác Triệu chứng huyết khối: Khác: V CẬN LÂM SÀNG HIỆN TẠI Sinh hóa máu Glucose Ure Cre Choles Tri HDL-C LDL-C ALT AST Na+ K+ Cl- Công thức máu RBC WBC PLT Hb MPV Hct PCT PDW P-LCR Đông máu tháng a Tháng: INR: b PT(s): PT(%): PT(s): PT(%): PT(s): PT(%): Có Khơng Tháng: INR: c Tháng: INR: Điện tim: Rung nhĩ Siêu âm tim Chênh áp qua van học B Tổn thương van khác Có Khơng Tăng áp ĐMP Có Khơng Hẹp nhẹ Hẹp nặng VI ĐIỀU TRỊ: Liều thuốc chống đông (mg/tuần): Dùng thuốc khác kèm theo: Digoxin Có Khơng Amiodarone Có Khơng Furosemide Có Khơng Khác VI KẾT QUẢ PHÂN TÍCH GEN CYP2C9*3: VKORC1 2.1 1639G>A: 2.2 1173C>T: Hà Nội, Ngày tháng năm 201 Người thu thập Phạm Thị Thùy Phụ lục QUY TRÌNH TÁCH DNA TỪ MÁU TOÀN PHẦN THEO KIT E.Z.N.A BLOOD DNA MINI KIT Lắc ống máu Chuyển 250 µl mẫu vào ống epp 1,5 ml vô trùng Thêm 25 µl OB Protease Solution 250 µl BL Buffer Vortex 10 giây Ủ 650C 10 phút Chú ý: sau ủ phút, vortex 15s Thêm 260 µl Ethanol 100% Vortex 20 giây Ly tâm 1000 v/p 15s để đảm bảo mẫu khơng dính thành ống Chú ý: Tất bước ly tâm phải cân đối trọng mẫu ly tâm Chèn HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube ml Chuyển toàn mẫu vào cột (để pipet mức 790 µl) Ly tâm 14.000 vòng/phút phút Bỏ dịch lọc Collection Tube 10 Lắp HiBind DNA Mini Column vào Collection Tube ml 11 Thêm 500 µl HBC Buffer 12 Ly tâm 14.000 vòng/phút phút 13 Bỏ dịch lọc sử dụng lại Collection Tube 14 Thêm 700 µl DNA Wash Buffer 15 Ly tâm 14.000 vòng/phút phút 16 Bỏ dịch lọc sử dụng lại Collection Tube 17 Lặp lại bước 14-16 cho bước rửa thứ với DNA Wash Buffer 18 Ly tâm HiBind DNA Mini Column 14.000 v/p phút 19 Chuyển HiBind DNA Mini Column vào ống ly tâm 2ml 20 Thêm 100 µl Elution Buffer (đã làm ấm đến 650C) Ủ 650C, phút 21 Ly tâm 14.000 vịng/phút phút 22 Thêm 50 µl Elution Buffer, ủ phút nhiệt độ phòng 23 Ly tâm 14.000 vòng/phút phút 24 Thu bảo quản DNA -300C * Kiểm tra chất lượng DNA phương pháp đo quang Các mẫu sau tách DNA tổng số kiểm tra chất lượng DNA phương pháp đo quang bước sóng A260 nm A280 nm để đánh giá nồng độ DNA độ tinh DNA Phương pháp sử dụng máy đo quang phổ nồng độ nano, Nano Photometer-implen NP80 Quy trình thao tác chung gồm bước sau: Đo Blank: đo với µl mơi trường dùng để bảo quản mẫu DNA tổng số Đo mẫu DNA: đo với µl mẫu DNA tổng số vừa thu Mỗi mẫu phải đo lần lấy giá trị trung bình để xác định nồng độ DNA mẫu Phụ lục QUY TRÌNH ĐIỆN DI DNA HOẶC SẢN PHẨM PCR * Cách làm gel agarose 1,5%: Cân 1,5g agarose hòa tan 10ml boric acid EDTA (TBE) (sử dụng lị vi sóng) Sau agarose tan hết, để nguội 55- 60°C, đổ vào khuôn gel, tùy thuộc vào số lượng giếng cần cho điện di mà cài lược làm giếng từ -6- 8- 12 * Cách pha dung dịch TBE 10X (Tris; acid boric; EDTA): Tris 0,89M; acid boric 0,89M; EDTA 0,02M * Tiến hành kỹ thuật điện di: Thành phần Ống chuẩn Ống bệnh nhân Dung dịch TLPT chuẩn (Hae III) 10μl - cDNA - 9μl Loading buffer 10X - 1μl 10μl 10μl Tổng số - Đưa gel agarose vào máy điện di, cho TBE đến ngập gel - Dùng pipet đầu côn nhỏ hút dung dịch ống đưa vào giếng (10μl/giếng) - Máy điện di 80- 100v (Mupid- Nhật Bản), điện di khoảng 30 phút - Sau điện di, gel ngâm vào Edithilium bromide 20 phút, rửa qua nước cất đưa vào soi đèn UV, chụp ảnh Phụ lục QUY TRÌNH KỸ THUẬT PCR Thành phần phản ứng: Thành phần Nồng độ hoạt động Thể tích phản ứng (30 µl) 100 ng/µl 1,5 µl 0,2 mM 3,0 µl 1X 6,0 µl Mồi F [10] mM 0,5 µM 1,5 µl Mồi R [10] mM 0,5 µM 1,5 µl 0,02 u/µl 0,3 µl DNA dNTP mix mM 5X HF buffer Phusion pol 2u/µl DDW 16,2 µl Tổng thể tích phản ứng: 30 µl Chu trình phản ứng PCR sau + 980C phút + 950C 10 giây + 630C 30 giây + 720C 30 giây + 720C phút 35 chu kỳ Phụ lục QUY TRÌNH TINH SẠCH SẢN PHẨM PCR TRÊN GEL AGAROSE Sử dụng Promega Wizard SV gel clean-up system (Promega, USA) Chuẩn bị dung dịch rửa màng (membrance wash solution) Thêm ethanol 95% vào lọ dung dịch rửa màng Lượng ethanol cho thêm vào phụ thuộc vào thể tích lọ dung dịch rửa màng (được quy định sẵn kit) Cắt phần gel agarose có chứa sản phẩm PCR mong muốn (hiển thị đèn chiếu UV) Ước lượng trọng lượng miếng gel Cho miếng gel vào ống có dung tích 1,5 ml, thêm vào 10 µl dung dịch bám màng (membrance binding solution) cho 10 mg trọng lượng miếng gel Nhẹ nhàng trộn hỗn hợp ống ủ ống 50-600C 10 phút quan sát thấy miếng gel tan hoàn toàn Ly tâm ống để toàn DNA tập trung xuống đáy ống Đặt cột lọc (SV Minicolum) vào ống thu thập Chuyển toàn hỗn hợp gel hòa tan vào cột lọc ủ phút nhiệt độ phòng Ly tâm phức hợp cột lọc-ống thu thập tốc độ 14 000 vòng/phút Gỡ cột lọc ra, đổ bỏ phần dung dịch ống thu thập Sau đặt cột lọc lại ống thu thập Thêm vào cột lọc 700 µl dung dịch giửa màng ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút phút Lặp lại bước Thêm vào cột lọc 500 µl dung dịch rửa màng ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút 10 Chuyển cột lọc sang ống 1,5 ml Thêm vào cột 50 µl Nuclease-Free Water Ủ nhiệt độ phịng phút, sau ly tâm tốc độ 14000 vòng/phút, phút 11 Bỏ cột lọc, dung dịch ống chứa DNA đích tinh Tiếp tục thực kỹ thuật cất giữ ống -200C Phụ lục QUY TRÌNH GIẢI TRÌNH TỰ GEN TRỰC TIẾP Giải trình tự gen: Theo qui trình sử dụng phương pháp BigDye terminator sequencing (Applied Biosystems, Foster city, USA) Quy trình thực hiện: Cho vào ống dung tích 200 µl thành phần sau Thành phần Thể tích (µl) DNA đích tinh BigDye Terminator v3.0 Mồi xi (hoặc mồi ngược) µM BigDye seq buffer 5X Nước cất 3,2 8,8 (Thực ống cho mẫu: ống cho mồi xuôi, ống cho mồi ngược) Chu trình nhiệt: phút 980C, sau 15 giây 980C, sau 10 giây 600C, phút 600C 30 chu kỳ Sau phản ứng kết thúc, tiến hành tinh sản phẩm Wizard PCR Clean-up System (Promega) Tiến hành phân tích trình tự gen hệ thống ABI Prism 310 (Applied Biosystems): Cho vào giếng µl DNA 15 µl formandehide Đặt giếng vào máy giải trình tự chạy chương trình ... CYP2C9, VKORC1 liều thuốc chống đông kháng vitamin K bệnh nhân thay van tim học? ?? với hai mục tiêu: Xác định đặc điểm lâm sàng, cận lâm sàng tính đa hình gen CYP2C9*3, VKORC1- 1639G>A, 1173C>T bệnh nhân. .. huyết khối tắc mạch k? ??t van tim, nguyên nhân hàng đầu g? ?y tử vong bệnh nhân sau thay van tim học [4], [10], [11] Một số tin c? ?y để nhà lâm sàng đánh giá hiệu thuốc chống đông bệnh nhân thay van tim. .. nghiên cứu liên tục kiểu gen VKORC1 dường y? ??u tố dự đốn lớn liều chống đơng kháng vitamin K [85] Mặc dù 36 nhiều đa hình gen VKORC1 tìm nghiên cứu mức độ ảnh hưởng đến liều thuốc chống đông, nhiên